MODERNÍ METODY BIOLOGICKÉHO VÝZKUMU
(Speciální cvičení)
Oddělení molekulární cytologie a cytometrie
Oddělení patofyziologie volných radikálů
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AV ČR v.v.i.,Brno
ODDĚLENÍ CYTOKINETIKY
http://www.ibp.cz/cs/oddeleni/cytokinetika/informace-o-oddeleni
těsná spolupráce s Odd. fyziologie a imunologie živočichů ÚEB, PřF MU
Oddělení Cytokinetiky
okruhy výzkumu
• Regulace cytokinetických parametrů
lipidovými složkami výživy
• Interakce lipidů a cytokinů
• Působení protinádorových léčiv
• Role růstových faktorů v signalizaci
nádorových buněk
• Molekulární a buněčné mechanizmy
toxicity organických látek
TKÁŇOVÉ (BUNĚČNÉ) KULTURY IN VITRO
živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd.
Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání např. hlodavců jako je
myš, krysa, křeček nebo opic, člověka)
PRIMÁRNÍ KULTURY - buňky získané přímo z živočišných tkání, kousek tkáně,
nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění nežádoucích částí,
omezená doba kultivace, specifické požadavky
BUNĚČNÉ LINIE - adaptované na dlouhodobý růst in vitro
diploidní - karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly izolovány
většinou omezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený tzv. “life-span”)
heteroploidní - karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá kultivace
Udržují se tzv. pasážováním - určitý počet buněk se po určité době přenese do
čerstvého živného prostředí
ADHERENTNÍ kultury - rostou přichyceny k pevnému podkladu (kultivační
nádobky, mikronosiče)
SUSPENZNÍ kultury - nevyžadují podklad, rostou volně v médiu
Hlavní komerční dodavatelé buněčných linií
• The American Type Culture Collection
www.atcc.com
• The European Collection of Cell Cultures
www.ecacc.org.uk
Organizmus
Orgán a typ tkáně
Adherentní x neadherentní
Jaké medium a sérum
Způsob pasážování
Podrobnosti,literatura atd.
.
.
.
Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti – sterilní
Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků
buněk v termostatu s řízenou atmosférou - 370 C, 95% vlhkost, 5% CO2.
Nutná přísná sterilita!!!! - sterilní roztoky, plastik. nádobky, sklo, pipety atd.,
sterilizace autoklávem (120 0C), nebo horkým vzduchem (180 0C)
Práce ve sterilním laminárním boxu (typ BioHazard – laminární proudění
vzduchu, filtry -chrání i uživatele - práce s nebezpečnými viry apod.)
Základní médium je balancované chemické prostředí - zdroj pro energii a
biosyntézu.
Doplňky: a) nedefinované složky - zvířecí séra (hovězí, telecí, fetální,
koňské)
b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) - specializované podle
typu buněk
Živočišná séra
nejdražší součást média - ze zvířat z ekologicky málo poškozených oblastí
vhodné definované náhrady sér
Antibiotika a antimykotika
penicilin + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům)
KULTIVACE BUNĚK
Suspenzní buňky - po spočítání buněk se část supenze doplní čerstvým
kultivačním médiem
Adherentní (přisedlé) buňky - uvolnění od podkladu a rozvolnění shluků
enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média.
Některé buňky vyžadují tzv. feeder layer - vrstvu buněk inaktivovaných
zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů
buněk
Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo
v miskách různé velikosti.
Velkokapacitní kultivace - na mikročásticích ve velkých kontejnerech automatická
výměna média
Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 0C - mraznice, tekutý
dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné
kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) - většinou dimetylsulfoxid nebo
glycerol. Zmrazování je pomalé (řízené po 1 0C), rozmrazování rychlé ponoření
ampulí do lázně 37 0C.
ZPŮSOB KULTIVACE
Kultivace buněk
• Udržování kultury –
pasážování
– určitý počet buněk
se po určité době
přenese do
čerstvého živného
prostředí
• Adherentní
– odsátí média
– oplach EDTA/PBS
– trypsin
• Neadherentní
- část kultury se přenese
do nového média
VYUŽITÍ BUNĚČNÝCH KULTUR
Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci a objasňování mechanismů
účinků buněčných regulátorů a genů, které určují individuální aspekty
chování buněk.
Tato technologie umožnila pokrok ve virologii, somatické buněčné genetice,
endokrinologii, toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve
výzkumu karcinogeneze a stala se významným nástrojem vývojové
biologie, komplexní tkáňové fyziologie a průmyslové výroby specifických
buněčných produktů.
Výhody:
- lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů bez
nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku humorálních
faktorů i celkového stavu organismu
- lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat jejich
reakce v kontrolovatelných podmínkách
- homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje studovat a
odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů chování těchto buněk
- specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství
důležitých biologických látek (enzymy, hormony) - hybridomy
- etické hledisko - systém omezuje využívání laboratorních zvířat
Nevýhody:
- umělý zjednodušený systém
- poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo
Buňky nezralé (nediferencované nebo částečně diferencované)
► buňky kmenové (toti- nebo pluripotentní)
► buňky progenitorové
Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do zralejších stádií.
Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro některé
tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky).
Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách.
Buňky zralé - diferencované
Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou schopny se dále
dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní buňky apod.)
Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo se z nich
vytvářejí heteroploidní permanentní linie.
Buněčné populace in vitro
Imortalizované – z normální tkáně i nádorové linie
asynchronní - buňky se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu - přirozený
stav
synchronní - buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu - uměle navozené různými
chemickými látkami, homogenní populace, stejné reakce
Využití:
při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi buněčného cyklu
v praxi v nádorové terapii (léčba cytostatiky)
KREVNÍ BUŇKY
primární - z krve nebo kostní dřeně člověka a laboratorních zvířat
detekce jednotlivých typů a počtů na hemocytometru
kultivace progenitorů in vitro - BFU-E, CFU-S, GM-CFU - vyžadují specifické
podmínky a specifické růstové faktory (erytropetin, GM-CSF, IL-3 apod.)
Využití při transplantacích – namnožení buněk
permanentní línie - z krve leukemických pacientů nebo lab. zvířat
HL-60 - lidská promyelocytární leukémie - promyelocyty schopné diferencovat in
vitro - bipotentní, deficientní v p53
kys. retinová (RA), DMSO - diferenciace do granulocytů
vit. D3., forbol ester (TPA), butyrát - diferenciace do monocytů-makrofágů
Vhodný model pro
► studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy myeloidních buněk
► studium příčin leukemických poruch
► studium účinků kyseliny arachidonové (AA), eikosanoidů a cytokinů (TGF- a
TNF)
EPITELIÁLNÍ BUŇKY
z lidské tkáně kolonu - línie HT29, CaCO2, HCT116 - nádorové buňky , FHC
– fetální střevo, NCM460 – nenádorové. Schopnost diferencovat in vitro po
působení butyrátu sodného (NaBt):
► růst aktivity alkalické fosfatázy
► morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu
► výšení exprese adhezívních molekul - E-kadherinu
Vhodný model
► pro studium regulace prolif., dif. a apoptózy epitelu střeva a mechanismů
vzniku nádorů kolonu
z lidské tkáně prostaty – nádorové i nenádorové linie
► pro studium účinků nenasyc. MK a cytokinů
Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné
► jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), línie nádorových buněk
hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty
► geneticky modifikované buněčné línie:
Vnesený gen s luciferázou - intenzita odráží aktivaci příslušných
vnitrobuněčných receptorů
pro detekci dioxinové aktivity (AhR), estrogenní aktivity ( ER) či aktivace
PPAR (peroxisome proliferator - activated receptors) studovaných látek
a je detekována na luminometru.
Linie transfekované různými zkoumanými geny nebo je postrádající („knock-
out“)
VYBAVENÍ LABORATOŘE PRO KULTIVACE BUNĚK
► Sterilní prostředí – speciální plastik, sklo, pipety
(skleněné, automatické -různé objemy
autokláv, horkovzdušná sterilizace (130 oC)
► Klimatizace, UV světlo
► Destilační přístroj na superčistou vodu
► Laminární box (Biohazard) – laminární proudění vzduchu,
filtry – sterilní prostředí pro práci, ochrana při práci
► Inkubátor – 37 oC, 5% CO2, 95% vlhkost
► Počítač částic (buněk)
► Inverzní mikroskop
► Centrifugy
--------------------------------------------------------------------------
► ELISA reader
► Cytocentrifuga
► Fluorescenční mikroskop
► Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměnné rotory)
► Průtokový cytometr (FACSCalibur, Beckton Dickinson)
Několik laserů, stanovení několika parametrů současně u
rozsáhlých buněčných populací
FACSVerse
► Fluostar – multifunkční přístroj – spektrofotometr, fluorimetr,
chemiluminometr
► Zařízení pro molekulární biologii
► Výkonná výpočetní technika
„Core facilities“ (Laboratoř molekulární biofyziky)
FACS Aria Sorb (BD) – vysokorychlostní buněčný sorter
Unikátní konfokální mikroskop Leica s vysokým rozlišením
Průtoková cytometrie
FACSCalibur Jedna z hlavních používaných
metodologií.
Měření řady buněčných
parametrů v krátkém čase u
10 tis. buněk.
FACSCalibur
FACSVerse
MÉDIA
Řada druhů podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se
kompletní tekutá, koncentráty, prášková - skladování 40 C.
Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 S a chemikálie nejvyšší čistoty.
Nutná sterilizace přes filtr 0,2 m.
Základní složky:
Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin - zdroj energie a uhlíku
Aminokyseliny - zdroj energie a dusíku
Vitamíny - kofaktory pro enzymatické reakce
Lipidy - esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod.
Anorganické soli - zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor
Pufrační solné směsi - Earlův roztok (fyziolog. roztok s vysokým obsahem
NaHCO3) - kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5% CO2
zabraňuje rozpadu a alkalizaci média.
Požadované pH většinou 7,2 - 7,4 - úprava HCl a NaOH
Otevřený systém - Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěren
Optická kontrola - indikátor fenolová červeň
Organické pufrační systémy - HEPES 20mM
Nejčastěji používané fetální bovinní (telecí) sérum
Metodologické přístupy
of
DETEKCE PROLIFERAČNÍ AKTIVITY BUNĚK
Růst buněk
● počty buněk (Bürkerova komůrka, Coulter Counter, Casy) v časových intervalech
od vysetí určitého počtu - růstové křivky
● spektrofotometrické stanovení celkových proteinů - Amido black
● doba zdvojení populace (doubling time),
● generační doba (trvání buněčného cyklu)
Metabolicky aktivní část populace
● izotopové metody - stanovení podílu populace syntetizující DNA - inkorporace
3H-tymidinu do DNA - detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo
scintilačně – detektor  záření
● spektofotometrické metody - inkorporace bromdeoxyuridinu - detekce pomocí
navázáné protilátky - ELISA reader nebo průtoková cytometrie (FCM)
● metoda redukce MTT na formazan - založeno na aktivitě mitochondrií
Stanovení mitotického indexu
mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných
preparátech
Testy cytotoxicity
● MTT (WST) test
● Stanovení viability - vitální barvení trypanovou modří nebo eosinem
propidium jodid (flow cytometrie)
Detekce počtu buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu
Flow cytometrie - procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi (propidium iodid)
Stanovení délky fází buněčného cyklu - autoradiografické metody, BrDU
POČTY BUNĚK
• Coulter Counter
• Mezi elektrodou uvnitř
trubice a zevní elektrodou
protéká elektrický proud
– Buňka procházející mezi
elektrodami přeruší tok proudu
a vede k změně napětí
– Změna napětí je úměrná
objemu částice
– Změna napětí musí mít určitou
prahovou hodnotu, aby byla
započítána
– Suspenze buněk v elektrolytu
je nasávána do trubice s
malým otvorem
CASY
– Základní princip stejný jako u
Coulter Counter
– Navíc analýza
• Viability buněk
• Objemu buněk
• Agregátů
• Debris - „rozbitých buněk“
Stanovení proliferace – další možnosti
• Bürkerova komůrka
– nejjednodušší metoda
– počítání pod
mikroskopem
xCELLigence System
• Real-Time Cell
Analyzer
• Měří tzv. cell index
(růst, adheze, tvar
buněk)
DETEKCE BUNĚČNÉ SMRTI
apoptózy/nekrózy/autofagie
• Morfologicky – světelný mikroskop
• Fluorescenční mikroskop
• Průtoková (flow) cytometrie
(TUNEL- barvení konců fragmentů DNA,
AnnexinV, subG0/G1 populace)
● Stanovení specifických markerů (proteinů –
western blotting) těchto procesů
Stanovení apoptózy
Aktivace kaspáz
Kondenzace buňky a organel
Kondenzace chromatinu
Ztráta asymetrie buněčné membrány
Zachování integrity buněčné membrány
Tvorba „bodies“ a jejich fagocytóza
okolními buňkami
Stanovení apoptózy na různých úrovních procesu…(aktivace kaspáz,
uvolnění cytochromu c, štěpení cílových proteinů, DNA)
Morfologická detekce apoptózy
barvení DAPI
http://springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s13277-010-0036-6-3
http://cytoquant.com/mediac/450_0/media/8cda7dca66452e40ffff84f0ac144225.JPG
•Během apoptózy – fragmentace
DNA ~ 200 PB
•DAPI (4',6-diamidino-2phenylindole)
prochází neporušenou
cytoplazmatickou membránou
•DAPI se vmezeřuje do DNA –
typické „rosety“ pod fluorescenčním
mikroskopem
•Absorpční maximum ~358 nm
(ultrafialová)
•Emisní maximum ~461 nm (modrá)
Stanovení apoptózy
další možnosti
● Substráty kaspáz
detekce štěpení PARP (poly-ADP ribose polymerase),
detekce exprese proteinů z rodiny Bcl-2 (western blot)
● Aktivita (štěpení) kaspázy-3 (-8, -9)
● Mitochondriální funkce
uvolňování cytochromu c (FACS)
pokles potenciálu mitochondriální membrány (TMRE,
Mitotracker; FACS)
● TUNEL
– sledování fragmentace DNA (fluorescenční mikroskop,
FACS)
● Anexin V
– váže se na fosfatidylseriny v membráně, které při
apoptóze mění orientaci
Jakou metodu použít?
• více než jednu
• principiálně odlišnou
• v závislosti na buněčném typu
Fyziologie buněčných systémů (Bi7070), prof. A. Kozubík
Genotoxicita a karcinogeneze (Bi 8110), prof. J. Hofmanová
Zdravotní rizika (Bi3871), prof. J. Hofmanová
Molekulární fyziologie živočichů (Bi651)
Mechanizmy buněčné smrti, význam, metody – RNDr. Alena
Hyršlová, Ph.D. (Bi8870)
Analytická cytometrie – Mgr. K. Souček, PhD. (Bi9393)
SDS-PAGE gelová elektroforéza a Western blotting
http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html
http://www.elect-intro.com/western-blots
http://www.kollewin.com/blog/read.php?5262&guid=1
•SDS-PAGE (polyakrylamid)
elektroforéza – separace proteinů na
základě jejích hmotnosti
•SDS denaturuje proteiny a obalí je –
proteiny mají negativní náboj (úměrný
jejich velikosti)
•Proteiny v gelu migrují ke kladné
elektrodě
•Přenos vzorků z gelu na
membránu a následná identifikace
proteinů pomocí vazby protilátek
•Membrány PVDF, nitrocelulózová
DIFERENCIACE
• Rozrůznění buněk do odlišných typů (při vývoji, v
dospělosti v některých tkáních – krevní, epiteliální)
Při diferenciaci
• se mění morfologie buněk
• stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické
fosfatázy)
• stoupá exprese specif. povrchových antigenů
(CD11b, CD 14)
• vzniká schopnost fagocytózy a produkce
kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo
chemiluminiscenčně)
Stanovení diferenciace
Změna enzymového vybavení buněk
• Nespecifické esterázy - Hydrolýza -naftyl acetátu esterázami vede k
vzniku hnědého zbarvení
• Detekce myeloperoxidázy - myeloperoxidáza štěpí peroxid kyslíku za
vzniku kyslíkových radikálů, které pak oxidují o-dianisidin za vzniku
barevných látek chinonového charakteru
• Detekce alkalické fosfatázy - alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4p-nitrofenyl
fosfát za vzniku žlutého zbarvení
Produkce reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS) při oxidativním
vzplanutí (monocyty)
• Redukce NBT (nitroblue tetrazolium) - NBT je redukován superoxidem
produkovaným monocyty. Redukce vede k změně barvy ze žluté na modrou
• Oxidace/redukce luminolu - ROS produkované monocyty oxidují luminol
při redukci – chemiluminiscence
Změna povrchových molekul
• Exprese CD11b (R proC3b složku komplementu) a CD14 (vazba LPS)
Změna morfologie Zvýšená adheze, pseudopodia, zástava proliferace
MASTNÉ KYSELINY S KRÁTKÝM ŘETĚZCEM
Anaerobní mikrobiální fermentace VLÁKNINY
Fyziologický význam pro zdravou střevní tkáň
Psyllium
Normální kolonocyty
Nádorové buňky kolonu
● zdroj energie
→ zvýšená proliferace
→ pokles apoptózy
● snížená proliferace
● indukce diferenciace
● indukce apoptózy
● změny genové exprese
inhibitor histondeacetyláz
Butyrát sodný
Prevence a terapie
NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA ???
Specifické působení na
Sřevní epitel - přechod adenom x karcinom
fetální colon
FHC
adenom
AA/C1
RG/C2
adenocarcinom
HT-29
DLD-1
HCT-116
SW480
lymf.
metastáza
SW-620
Buněčné línie Účinky butyrátu
normální epitel
NCM460
Buňky diferencují po působení butyrátu sodného (NaBt, 2-5 mM, 72 h).
Morfologické změny, adheze, zvýšená exprese E-kadherinu, polymerizace F-
aktinu
Zvýšení aktivity alkalické fosfatázy
Metoda fluorimetrického stanovení - přístroj Fluostar (spektrofotometr, fluorimetr,
chemiluminometr).
Spektrofotometrie = stanovování vlastností vzorku, např. koncentrace určité
látky v roztoku, na základě pohlcování světla v různých vlnových délkách
spektra.
Stanovení diferenciace buněk z adenokarcinomu kolonu (linie HT-29)
Detekce buněčné diferenciace
(aktivita alkalické fosfatázy, spektrofotometrie)
0
10 000
20 000
30 000
40 000
50 000
60 000
70 000
-
-
-
0.5
-
15
3
-
3
0.5
3
15
5
-
5
0.5
5
15
ALPactivity(U/5x10
4
cells-%ofcontrol)
24 hours
48 hours
72 hours












x
x
x
xx
xx
xx
xx
xx
NaBt
TNF- 
of
Detekce buněčné diferenciace
(obsah F-aktinu FITC značený phalloidin- konfokální mikr.)
of
FACSCalibur
Metoda průtokové cytometrie
Specifická barviva - intenzita fluorescence
Parametry odrážející chování buněčných populací
Fáze buněčného cyklu Exprese CD povrchových antigenů
Exprese a produkce vnitrobun. molekul
100 101 102 103 104
Nile red FL1 H
M1
Nile red
fetal adenocarcinoma
AKUMULACE LIPIDŮ v cytoplasmě (Nile red, FL-1)
Zvýšená tvorba LD u FHC buněk posílená v kombinaci AA (DHA)/NaBt
korelovala s % buněk se sníženým mit. membránovým potenciálem (MMP)
a zvýšenou produkcí reakt. kyslíkových metabolitů (ROS)
Registered
participants:
Invited speakers:
65 137 180......
0 3 7... (Angl.)
Česká společnost pro analytickou cytometrii
Mezinárodní konference 2001, 2003, 2005, 2007, 2009, 2011
Analytická cytometrie VII, Mikulov
21.-24. září 2013
Příklady výsledků s využitím
buněčných linií
► Na počátku stojí pracovní hypotéza, kterou ověřujeme
► Důležité jsou časové a koncentrační závislosti (dose-response)
► Studium působení jednotlivých faktorů nebo jejich kombinací
(multivariační analýzy)
► Souvislost proliferace, diferenciace a apoptózy na buněčné úrovni
► Po stanovení základních cytokinetických dat studium detailnějších
mechanismů účinků na subbuněčné a molekulární úrovni
► Experimenty se opakují nezávisle nejméně 3x (v případě nejasností i
vícekrát) a v mnoha případech zahrnují ještě paralelní měření, která
upřesňují získanou hodnotu.
► Výsledky jsou vždy statisticky zhodnoceny a je určena významnost
rozdílů.
► Výsledky jsou prezentovány formou tabulek, grafů nebo reprezentativních
obrázků či fotografií.
Růstové křivky
Koncentrační závislosti
(dose-response)
vyjádření v % kontroly
(neovlivněná
populace=100%)
PARAMETRY BUNĚČNÉHO CYKLU
EXPRESE PROTEINU (WESTERN BLOTTING)
control
NaBt
AA50
AA50-NaBt
DHA20
DHA20-NaBt
113
89
PARP
32
pro-
caspase-3
21Bax
Bak 24
kDa
Mcl-1 42
Interakce kys. arachidonové (AA) a dokosahexaenové (DHA) s butyrátem
HT-29
FHC
HCT116
Mcl-1= 40/42 kDa
β-actin=40kDa
Mcl-1
Mcl-1
actin
actin
Exprese antiapoptického proteinu Mcl-1
LIPIDOMICKÉ ANALÝZY
(spolupráce s VÚVeL)
1) změny obsahu jednotlivých typů MK v celkových buněčných lipidech
GC-MS (gas chromatography – mass spectrometry)
2) změny obsahu AA, resp. DHA v jednotlivých skupinách fosfolipidů:
PC, PS, PI, PE, SM a v neutrálních lipidech
LC-MS-MS (high – performance liquid chromatography
– tandem mass spectrometry)
po působení AA, DHA, NaBt a kombinací AA/NaBt, DHA/NaBt)
u buněk FHC a HCT-116
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
AA
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
DHA
Hmotnostní spektra fosfatidyletanolamin
u buněk FHC po působení AA (DHA) 24h
Data hodnocena jako plochy píků (normalizované na 106
buněk)
Detekován snížený obsah typů obsahujících FA
dominantní v kontrole a zvýšený obsah typů obsahujících
AA (příp. DHA)
NaBt tyto změny dále významně neovlivnil
kontrola
AA (50μM)
DHA (50μM)
ANALÝZY FOSFOLIPIDŮ
Příklad LC/MS/MS
Doporučená literatura:
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Eds. A. Doyle, J. B. Griffiths,
D. G. Newell, Wiley&Sons Inc., London 1995
Culture of human tumor cells, Eds. R. Pfagner, R.I. Freshney, Wiley-Liss,
Wiley&Sons Inc., Hoboken, New Jersey, 2004
Current Protocols in Cytometry, Ed. J. P. Robinson et al., Wiley&Sons Inc.,
New York 1997
T. Eckschlager a kol.: Průtoková cytometrie v klinické praxi
The Handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies, 10th
edition, R. P. Haugland, Invitrogen Corp. 2005
R. A: Bradshaw, E. A. Dennis: Handbook of Cell Signaling (Vol. 1, 2, 3),
Elsevier Science, Academic Press 2004
Short Protocols in Molecular Biology (Vol. 1, 2) John Wiley &Sons, 2002
K. M. Debatin, S. Fulda: Apoptosis and Cancer Therapy (Vol. 1, 2), WILEYVCH
Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim, 2006
Methods of Enzymology, DNA Microarrays Part A and B, Vol. 410 and 411,
Eds. J.N. Abelson, M.I. Simon, Elsevier Inc. 2006
Buněčné linie
of
Buňky epiteliálního původu
PahtologyOrganismsLokalizationcode
karcinomkrysajátraH4IIELuc
embryonálníčlověkkolonFHC
normálnímyšplicníE10
karcinommyškolorectumCT26
karcinom, doxorubicin -
rezistentní
člověkplíceCOR-L23R
karcinom, Pt - rezistentníčlověkplíceCOR-L23/CP3
karcinomčlověkplíceCOR-L23
karcinom, Pt- citlivéčlověkovariumCH-1
normálnínorekplíceCCL-64
adenokarcinomčlověkkolonCaCo2
tranformované viremčlověkplíceBEAS-2B
karcinomčlověkplíceA549
karcinom, Pt - rezistentníčlověkováriumA2780cis
karcinom, Pt - citlivéčlověkováriumA2780
Buňky epiteliálního původu
PathologyOrganismsLokalizationcode
normálníkrysajátraWB-F344
karcinomčlověkprsT47D
adenokarcinom, Pt – primárně
rezistentní
člověkovariumSKOV-3
adenokarcinomčlověkprsMVLN
normálnípesledvinaMDCK
adenokarcinomčlověkprsMDA-MB-231
adenokarcinomčlověkprsMCF-7
embryonální (fibroblasty)člověkplíceLEP
embryonálníčlověkendotelHUVEC
adenokarcinomčlověkkolonHT115
adenokarcinomčlověkkolonHT-29
karcinomčlověkjátraHepG2
karcinommyšjátraHepa1
karcinomčlověkcervixHeLa
normálníčlověkepidermisHaCaT
PathologyOrganismLokalizationcode
Buňky mesenchymálního původu
leukemie (lymfoidní)myškrevWEHI
normální (fibroblasty)křečekfibroblastyV79
leukemie (monocytární)člověkkrevU937
leukemie (myeloidní)člověkkrevNB4
leukemie (myeloidní)člověkkrevML-1
leukemie (lymfoidní)člověkkrevMOLT-4
leukemie (erytroidní)člověkkrevK562
leukemie (lymfoidní)člověkkrevJurkat
imortalizovanénervovéIMM
leukemiečlověkkrevHL-60
fibrosarkommyšG5:113
Metody používané v Oddělení Cytokinetiky BFÚ AV ČR v.v.i. Brno
Legenda: FACS – flow cytometry
FM - fluorescent microscopy
SM – light microscopy
WB - western blotting
FM - fluorimetry (FluoStar)
CM - colorimetry (FluoStar nebo Elisa reader)
LM - luminometry
PAGE - polyacrylamid electrophoresis
RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction
RG - radiography
ELFO – agarose electrophoresis
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
DAPI staining Studium morfologických změn buněčného jádra apoptotických buněk FM
Annexin V - FITC + propidium jodid
(PI) Externalizovaný fosfatidylserin apop. buněk + zachovaná semipermeabilita (detekce rané apoptózy) FACS, FM
TUNEL + PI Průkaz specifické fragmentace DNA (DNA zlomů - nicků – ss DNA breaks) FACS, FM
SubG0/G1 peak v distribuci
buněčného cyklu Barvení buněčné DNA propidium jodidem s extrakcí nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem FACS
PI - Hoechst double - stain Rozdělení buněk na mrtvé/živé, podle morfologie jádra identifikace apoptotických buněk FM
DNA žebřík Průkaz fragmentace DNA na 180 bp fragmenty (tzv. ladder) ELFO
Kaspáza 1, 3, 7, 8, 9 Detekce exprese specifických proteáz WB
Caspase assay (c-3, -6, -8, -9 subs.) Důkaz aktivity specifických proteáz štěpením specifické sekvence na fluorescenční substrát FM
cytokeratin 18 - protilátka M30 Neoepitop vytvořený štěpením cytokeratinu kaspázou FACS,
Lamin B Degradace Laminu B kaspázami WB
PARP Detekce štěpení proteinu PARP WB
JC-1, TMRE, DiOC6, MitoTracker
Red, Rh 123 Detekce změn mitochondriálního potenciálu DYm FACS
Hoechst + propidium jodid (PI) Detekce apoptických, nekrotických a sekundárně nekrotických buněk (detekce i pozdní apoptózy) FM
F-aktin Detekce intenzity polymerizace a depolymerizace aktinu (pomocí konjugátu faloidin-FITC) FCM, FM
Intracelulární pH Průkaz poklesu intracelulárního pH vůči fyziol. hodnotě nutného k aktivaci enzymu DNA-ázy
Izolace cytochromu c z cytos. frakce Vylití Cyt. C z mitochondríí do cytosolu a formování komplexu s Apaf-1 a procasp-9 vytváří apoptosom WB
OxPhos Complex IV subunit II Studium funkce mitochondrií WB
Detekce apoptózy
Proteiny a moleculy spojené s apoptózou
Bad, Bag-1, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-X, BclXL,
Bid, Mcl-1 Bcl-2 rodina - regulátory průběhu apoptózy WB
c-FLIP Inhibitor kaspázy 8 WB
c-IAP1, XIAP Rodina inhibitorů kaspáz WB
Hydroethidin, 2´,7´
dichlorofluoresceindiacetát Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS
Dihydrorhodamin 123 Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS
Lucigenin Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu LM
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
Detekce proliferace, cytotoxicity a viability
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
Počítání buněk Počítač částic založený na principu konduktivity
Coulter
counter
Dye exclusion assay - eosin, trypanová
modř Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou SM
Dye exclusion assay - propidium jodid Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou FACS
MTT, WST-1
Stanovení relativního množství buněk metabolizujících tetrazolove soli MTT, WST-1 na formazanove
produkty CM
CyQuant Kit (Molecular Probes) pro značení DNA speciální fluorescenční barvou - proliferační assay FM
PCNA Marker proliferace - podjednotka DNA-polymerázy d a e WB, SM
Inkorporace BrdU Analog deoxyuridinu se inkorporuje během replikace DNA v proliferujích buňkách FACS, FM
Inkorporace 3H-thymidinu (izotopová
metoda) Triciem značený thymidin se inkorporuje do buněk během replikace DNA - scintilační hodnocení RG
Clonogenic assay Otreatované buňky rostou v médiu nebo na agaru, sleduje se schopnost vytvářet kolonie buněk
Mehody pro analýzu buněčného cyklu
LegendPrincip, function, parameterMethods, molecules
Proteiny spojené s regulací buněčného cyklu
Barvení pomocí PI
(např. Vindelův roztok) Distribuce buněčné populace podle množství celkové buněčné DNA do jednotlivých fáz bun. Cyklu FACS
Mouse anti-BrdU-FITC + PI Sledování syntézy DNA na základě inkorporace BrdU do DNA proliferujících buněk FACS
Pulse-chase BrdU labeling Sledování průchodu buněk cyklem FACS
cyklin A Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cdk 2 WB
cyklin D1 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cdk 4 WB
cdk 2 activity assay Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cyklinem A RG
cdk 4 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cyklinem D WB
p15, 16 Rodina p16 - inhibující kinázy cdk 4 a 6 WB
p21/waf1/cip1/sdi1/pic1 Inhibitor cdk a DNA replikace, transaktivovaný pomocí p53 WB
p27/kip1 Inhibitor komplexů cyklin D-cdk 4, cyklin A-cdk 2 WB
Topoizomeráza II Replikační faktor - marker pozdní S/G2/M fáze b. cyklu WB
pRb Onkosupresor zastavující ve fosforylované formě b. cyklus v souvislosti s p21 WB
p53 Tumor supresorový gen - "Guardian of the genome" - downstream reguluje p21/waf WB
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
Detekce buněčné diferenciace
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
Proteiny spojené a buněčnou diferenciací
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
CD11b, CD14 Znaky monocytární diferenciace lidských leukemických buněk FACS
Nespecifické esterázy Stanovení aktivity -naftyl acetát esterázy (difer. leukemických buněk) CM
Fagocytická aktivita Znak monocytární diferenciace leukem. buněk - pohlcení částic konjug. s FITC FACS
NBT redukční test Se zvyšující se úrovní diferenciace roste počet reduk. formazánových zrn CM
Aktivita alkalické fosfatázy Znak diferenciace kolonových buněk - disodná sůl 4-nitrofenyl fosfátu CM
Nespecifické esterázy
Stanovení aktivity nespecifických esteráz pomocí štěpení fluoresenčné sondy CFDA
(karboxyfluorescein diacetát) FACS
Intracelulární pH Stanovení intracelulárního pH jako markru diferenciace buněk pomocí flourescenční sondy SNARF-1 FACS
Polymerizace aktinu FITC značený faloidin FM
RAR Receptor all-trans kyselina retinová indukující diferenciaci leukemických buněk WB
RXR Receptor aktivovaný 9-cis-retinovou kyselinou WB
VDR Receptor vitaminu D, množství VDR moduluje růst a diferenciaci nádorových buněk WB
Mezibuněčná komunikace, anoikis, motilita
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
Metabolismus kyseliny arachidonové
LegendPrincip, function, parametermethod, molecules
FAK Nereceptorová tyrosin kináza zapojená v přenosu signálů z ECM WB
Cadheriny Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cateniny WB, FM
g-catenin Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cadheriny WB
connexin 43 Složka gap junctions (GJIC) WB
GJIC inhibition assay Testování funkčnosti GJIC pomocí luciferové žluti FM
Wound healing assay Testování motility buněk FM
cytopl. fosfolipáza A2 Odštěpuje AA z membrán WB
5-lipooxygenáza Metabolizuje AA na leukotrieny WB
Cyklooxygenáza 2 Metabolizuje AA na prostaglandiny, prostacykliny a tromboxany WB
Uvolňování AA Uvolnění AA z buněk do media
HPLC
(VUVEL)
Signální dráhy receptorů smrti
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
Kinázy a s nimi spojené proteiny
Fas-L Ligand Fas-R - signál smrti WB
Fas-R (CD95) Receptor smrti - aktivovaný navázáním Fas-L WB,FACS
FADD Adaptérová molekula - součást DISC komplexu WB
Toso Inhibitor Fas indukované apoptózy nacházející se na povrchu T lymfocytů WB
TRAIL Ligand TRAIL-R - signál smrti WB
TRAIL-R1,2 (DRs) Receptory smrti - aktivovány navázáním TRAIL-L WB,FACS
TRAIL-R3,4 (DcRs) Decoy receptory - vážou TRAIL, ale neaktivují proces apoptózy WB,FACS
Ras, N-Ras Mebránový G-protein WB
ERK 1/2 Imunochemické stanovení neaktivní a aktivní (fosforylované formy) WB
p38 Imunochemické stanovení totální (na fosforylačním stavu nezávislé) hladiny p38 WB
JNK/SAPK activity assay stanovení aktivity analýzou fosforylace substrátu (radioizotopová metoda) RG
Akt/PKB Serin/Threoninová protein kináza, může stimulovat Ras WB
pTyr Protilátka detekující fosforylovaný Tyrosin WB
pSer Protilátka detekující fosforylovaný Serin WB
Signální dráha TGF
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
Proteiny spojené s receptorem AhR
AhR
WB, RT-PCR
Ligand-dependentní transkripční faktor,
EMSA,
FM
Reporter gene assay for AhR Metoda stanovení aktivity Ah R LM
Stabilní transfekce mutantních variant AhR a ARNT pomocí plazmidových vektorů
ARNT Jaderný partner receptoru AhR umožňující jeho vazbu na XRE element
WB, RT-
PCR
CYP1A1 Oxidáza se smíšenou funkcí patřící do rodiny cytochromů P450
WB, RT-
PCR
TGF 1 Růstový faktor WB
TGF  R I, II Receptor pro TGF  WB
Smad 2, 4 Aktivace TGF R vede k translokaci těchto transkripčních faktorů do jádra WB
Proteiny spojené s hormonální regulací
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
LegendaPrincip, funkce, parametrNázev metody, stanovované molekuly
Transcripční faktory a s nimi spojené proteiny
ER ,  Receptory estrogenů WB
Reporter gene assay for ER Metoda stanovení aktivity estrogenních receptorů LM
Cathepsin D Endopeptidáza indukovaná estrogeny WB
LRP/MVP Ribonukleoproteinové částice ovlivněné hladinou estrogenů WB
PPARg Jaderný receptor pro hormony ovlivňovaný MAPK WB
NF-kB Aktivátor řady genů spojených s hematopoezou, apoptózou atd. WB, EMSA
IkB Inhibitor NF-kB, který jej zadržuje v cytoplazmě WB
c-Myc Po navázání heterodimerizačního partnera Max působí jako TF WB
p53 Onkosupresor podílící se na řízení oprav DNA lézí WB
AP - 1 (Jun + Fos) Homo- či heterodimerní transkripční faktor WB, EMSA