Moderní metody buněčné biologie 2013




Úkol č.1 - Stanovení počtu a viability buněk

Připravená buněčná linie byla kultivována na 40 mm kultivačních miskách v inkubátoru při teplotě
…….., vlhkosti 95% a …..........[.] Počet buněk a jejich viabilita byly stanoveny pomocí přístroje
CASY.


Princip detekce:

Princip měření je založen na základě ………………………………….......................................



Vzorky :

Buněčná linie (doplňte):………….

                           1. ……………….

                           2. ……………….

Čas: ………


Postup:

1.      Popsat zkumavky pro sběr vzorků.

2.      Sebrat medium do příslušných zkumavek.

3.      Přidat 1 ml PBS/EDTA do každé misky, sebrat do zkumavky.

4.      Buňky uvolnit trypsinem (800 ml, cca 3 min).

5.      Neutralizace trypsinu pomocí média ze zkumavek.

6.      Oplach misek cca 1ml PBS.

7.      Vzorky zcentrifugovat (200 g/5 min).

8.      Odsát supernatant.

9.      Peletu důkladně resuspendovat v 1ml PBS.

10.  Přidat ještě 2 x 1 ml PBS.

11.  20 ml suspenze buněk odkápnout do kyvetky s 10 ml hemasolu.

12.  Otáčením kyvetu promíchat.

13.  Spočítat buňky v kyvetě na počítači částic CASY v příslušném programu pro naši buněčnou linii.

14.  CASY proměří i viabilitu a další parametry.

15.  Výsledky zapsat do tabulky


Výsledky:

buněčná linie

             vzorek

                   počet živých buněk/ml

                                        počet živých buněk










buněčná linie

             vzorek

                   viabilita

                            agregace

                                    velikost

                                            objem














Závěr:

……………………………………………………………………………………………….


Úkol č.2 - Detekce lipidových dropletů v cytoplasmě buněk pomocí Nile Red

Lipidové droplety (LD) jsou malé tukové kapénky uvnitř buňky. Tyto částice jsou syntetizovány na
endoplasmatickém retikulu a jsou tvořeny monovrstvou fosfolipidů, která uvnitř obsahuje neutrální
lipidy (triacylglyceroly, estery cholesterolu) jako zdroj energie a signálních molekul pro buňky. S
LD jsou spojeny i některé specifické proteiny. LD mají důležitou funkci v udržení lipidové
homeostázy, lipidovém metabolismu a vnitrobuněčném signálování. Lipidy uložené v LD jsou
hydrolyzovány a mohou být využity pro β-oxidaci, syntézu membrán, modifikaci proteinů či tvorbu
signálních molekul a jiných lipidových produktů. Zvýšená akumulace LD byla detekována v zánětlivých
a nádorových buňkách.


Princip detekce:

Lipidové droplety jsou detekovány pomocí ……………………… (FACS VERSE) s využitím Nilské červeně - Nile
Red (9-diethylamino-5H-benzo(alpha)phenoxazine-5-one). Jedná se o selektivní fluorescenční barvu,
která barví vnitrobuněčné lipidové kapénky červeně. S rostoucím množstvím lipidových kapének se
………….fluorescence.


Vzorky :

Buněčná linie (doplňte):………….

                           1. ……………….

                           2. ……………….

Čas: ………


Postup:

1.            Vzorky opláchnout PBS/EDTA, rozvolnit a uvolnit trypsinem. Vzorky zcentrifugovat (200
g/5 min) a spočítat na přístroji CASY.

2.            Vzorek centrifugovat (200 g, 5 min).

3.            Odsát supernatant.

4.            Přidat 3 ml PBS, opět centrifugovat (200g, 5min).

5.            Supernatant odsát.

6.            Poté přidat 450µl PBS a 50µl zředěné barvy Nile Red (ředění: 1ml do 1 ml , tzn.
ředění ……………..).

7.            Barvené buňky inkubovat 5 min ve tmě při ……………. teplotě a následně změřit
fluorescenci pomocí FACS VERSE.

8.            Analyzovat posun mediánu ovlivněných buněk ve srovnání s kontrolou v Nile Red Blue
527/32 kanálu.


Výsledky:

buněčná linie

             vzorek

                   medián








Závěr:

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….







Otázky a úkoly:

1.            Jaké parametry lze měřit pomocí počítače částic CASY? Uveďte alespoň 3.

…………………………………………………………………………………….

2.            Jak se rozeznají mrtvé a živé buňky pomocí „dye exclussion assay“?

……………………………………………………………………………………..

3.            Co je a co lze měřit pomocí Nile Red?

……………………………………………………………………………………..