Deregulace cytokinetiky
(možnosti ovlivnění)
(homeostáza, zdraví a regenerace organismu)
A. Kozubík
Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky)
Ústav experimentální biologie, PřF MU
(Oddělení fyziologie a imunologie živočichů)
Brno
Deregulace cytokinetiky:
Další příklady jejího ovlivnění
Adamantylaminové Pt(II) a Pt(IV)
komplexy
Dvojmocné Pt(II)
(reaktivní s DNA)
čtyřmocné Pt(IV)
(s DNA nereaktivní)
Syntetizované F. Žákem a spol.,
PLIVA – Lachema
Zak et al., 2004, J Med Chem,
LA-9 LA-12
JM-216
(1. z řady
v klinickém
zkoušení)
Výhoda: lipofilní
redukce
Cisplatina (II)
Biologické „cíle" cisplatiny
(adukty s DNA)
Fuertes, MA et al.
IntraInter-
mono-
!
!! !
Typy DNA
aduktů
a frekvence
jejich výskytu
(80-90%)
Molekulární podstata
cytotoxického
působení cisplatiny
iniciované adukty DNA
B. smrt závisí na
relativní intenzitě
Signálů
LA-12 ?
U buněk rezistentních
k cisplatině je f-ce p53
(dráhy vedoucí k apoptóze)
narušena.
Přispívají k tomu
změny v regulaci
proteinů r. Bcl, Fas,
Survivinu, Glutathionu
Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol
„Dose-response“ křivky (MTT test)
Nejcitlivější k cis-DDP z panelu senzitivních ovariálních buněk
(H134, IGROV-1, OVCAR-3),s najnižším % apoptózy (6-14%)
(Kolfschoten, G.M. et al., Gyn. Oncol., 2002)
Získaná rezistence udržovaná přídavkem cisplatiny
do kultivačního média (výsl. konc. 1 uM, každá 2. pasáž)
6x 18x
Faktor rezistence (18:6) = 3
Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol
Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus
A2780 (single staining)
SG2/M
Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol
Rozdílný vliv cis-DDP a LA-12 na buněčný cyklus
A2780cis
S
S
Účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus
jsou u ovariárních nádorových linií rozdílné.
Detekovány hladiny proteinů:
- Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu);
- p21, Gadd45a („p53 target genes“ - regulace b. cyklu);
- Bax (apoptóza);
- Gadd 45a („DNA repair“);
- Mdm2 (regulace stability p53)
Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklin A, B1,
cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny
Nebyly pozorovány žádné změny
Kozubik et al., Biochem Pharmacol., 2005
Exprese PARP a p53 (Western b.) u A2780 a A2780cis
Equitoxické koncentrace
cis-DDP indukují vyšší
expresi proteinu p53
(teoreticky vyšší
poškození DNA, než po
apl. LA-12 a tudíž by
cis-DDP měla působit
efektivněji),
Nebylo tomu tak, tzn. že
by musí existovat jiné.
např. s poškozením DNA
nesouvisející mechanismy
působení LA-12 !!!!!!
p53
p53
A2780 A2780cis
Detekce produktů genů activatelných p53 spojovaných
se zástavou b. cyklu, „DNA repair“ a apoptózou po
působení cisplatiny nebo LA-12
Analýzy potvrzující
dřívější data u b.
A2780
v časnějších int.
Žádné změny na
úrovni hladin
Mdm2 a Bax
Zvýšení exprese
Gadd45a u buněk
A2780 po působení
cisplatiny
Tyto naše výsledky, i když plně nevysvětlují působení cisplatiny a LA-12,
se zařazují mezi ty přístupy, které výzkum platinových cytostatik
posouvají do nových oblastí.
Studie z poslední doby ukazují, že cisplatina inhibuje růst nádorových
buněk v koncentracích, které jsou významně nižší, než konc. potřebné
pro inhibici syntézy DNA.
To naznačuje, že mohou existovat i jiné mechanismy působení než
ty, které jsou primárně založeny na poškození DNA
Platinová cytostatika mohou reagovat s dalšími buněčnými
strukturami (komponenty) jako jsou:
 RNA,
 proteiny,
 cytoskeletální filamenta,
 thioly- obsahující molekuly
 membranové fosfolipidy.
Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních
kaskád regulujících dělení a smrt buněk
Předpoklad:
Vzhledem ke své lipopfilicitě, lze očekávat, že alespoň
některé příznivé efekty působení LA-12
by mohly být (alespoň částečně),
spojeny s interakcemi této látky se složkami b. membrán
(anebo by mohly být modulovány
ovlivněním membranového složení).
LA-12 indukuje „upregulaci“ DR5 mRNA, celkových povrchových
proteinů, a zvyšuje zastoupení DR5 v lipidových raftech
DR5
mRNA
Zastoupení DR5 a DR4 v membránách
Celkové hladiny DR5
Lokalizace DR5 v lipidových raftech
Celkové hladiny DR5
(rafty)
HCT 116
NEZNÁMÉINTERAKCE
buněčný
cyklus a
proliferace
apoptóza
?
změny
fluidity
membrán
ovlivnění
metabolismu
PUFAs
poškození
cytoskeletu,
oxidativní
stres…
PUFAs
cisplatina
cytostatika
nové
generace
(LA-12)
EXPERIMENTÁLNÍ
OVLIVNĚNÍ
„přenos signálů“
membrána-cytosol-jádro
ÚČINEK
cílenáregulace
cytokinetiky
Lipidové
výživy
vhodného
složení
Podstata možných návrhů projektů – prozatím neuzavřeno
Posílení terapeutických efektů ?
Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných
než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA