Důležitost rovnováhy mezi signálními drahami regulujícími apoptózu a přežívání – ukázka na modelu nádoru tlustého střeva RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR přednáška 6.11.2013 Fyziologie buněčných systémů 2013 Apoptóza - geneticky kontrolovaný komplexní proces programované buněčné smrti - cílená sebedestrukce buňky - obrovský význam ve vývoji a udržení homeostáza mnohobuněčného organismu - od 70. let intenzívní výzkum apoptózy a její regulace Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza – morfologické znaky bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organel formace tzv. apoptotických bodies Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza – biochemické změny Aktivace specifických molekul – kaspázy, nukleázy atd. Nutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií Změny symetrie membrán Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza - fyziologický význam Týká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimuly Fagocytóza makrofágy Není zánět Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných, mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem udržení homeostázy mnohobuněčného organismu Hyršlová Vaculová A., 2013 Induktory apoptózy Nedostatek růstových faktorů Hormonální změny Specifické signály smrti - „death ligandy“ Chemoterapie UV-záření Ztráta kontaktu s prostředím Hyršlová Vaculová A., 2013 Studium apoptózy v mnohobuněčném organismu Caenorhabditis elegans (Nematoda) – první a velmi sofistikovaný model studia PCD Přesně řízený vývoj – organismus z 1090 buněk, z nich během vývoje 131 buněk umírá apoptózou – nutno přesné načasování a lokalizace, jinak vážné malformace Jeden z nejvíce studovaných organismů z hlediska popisu mechanismů apoptózy, podobnost s obratlovci (výskyt analogických apoptotických genů a proteinů) Hyršlová Vaculová A., 2013 C. Elegans (Nematoda) Hyršlová Vaculová A., 2013"The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002". Nobelprize.org. 9 Feb 2011, http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2002/ Apoptóza ve vývoji mnohobuněčného organismu Metamorfóza hmyzu – vývoj imaga z larvy Metamorfóza obojživelníků a plazů – ztráta ocasu pulců během proměny v žábu (postupná řízená indukce apoptózy a proměna tvaru těla) Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza ve vývoji mnohobuněčného organismu odumírání některých neuronů při vytváření CNS formace tvaru orgánů a struktur – prsty a interdigitální prostory odstranění abnormalit během embryogeneze (včetně spontánních abortů) Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza v regulaci homeostázy organismu Eliminace starých diferencovaných nepotřebných buněk (krevní, střevní, kožní…) Eliminace již nepotřebných buněk mléčné žlázy po ukončení laktace Regulace endometria během menstruačního cyklu Odumření poškozených zárodečných buněk Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza versus proliferace Pro udržení homeostázy organismu je nutná dokonalá rovnováha mezi procesy proliferace a apoptózy Porušení této rovnováhy má dalekosáhlé důsledky, které se odrazí na zdraví organismu Obzvláště nutné pro intenzívné proliferující tkáně (krev, střevo…) Hyršlová Vaculová A., 2013 Rakovina AIO AIDS neurodegenerativní onemocnění homeostáza apoptózaproliferace Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza a nemoci – stimulovaná vs. inhibovaná apoptóza AIDS Neurodegenerativní onemocnění (Alzheimer,Parkinson) Myelodysplastický syndrom Ischemické poškození (infakrt, reperfuze) Intoxikace jater Nádorové onemocnění Autoimunitní onemocnění Virové infekce (Herpes, Adenovirus) Hyršlová Vaculová A., 2013 Modelový systém pro studium apoptózy Střevní epitel - druhá nejintenzivněji proliferující tkáň v lidském organismu – Extrémní důležitost přísné regulace cytokinetických procesů a jejich rovnováhy pro udržení homeostázy – Deregulace – vývoj nádorového onemocnění Nádorové onemocnění tlustého střeva - studium mechanismů regulace apoptózy v naší laboratoři Hyršlová Vaculová A., 2013 Nádorové onemocnění tlustého střeva Nerovnováha mezi buněčnou proliferací, diferenciací a apoptózou – porušení homeostázy tkáně – podmínky pro rozvoj nádorového onemocnění - kolorektální karcinom vyvíjí se pomalu – nejprve benigní polypy – pak akumulace mutací (díky vysoké míře proliferace) a maligní zvrat počáteční stádia – dobře léčitelná (chirurgie, v raných fázích jedno z nejlépe léčitelných nádorových onemocnění) polovina nádorů CRC však zjištěna až v pokročilém stádiu (nedostatečný screening) vysoká incidence CRC v ČR – přední místo ve statistikách, neustálý alarmující nárůst možnost významně ovlivnit vývoj onemocnění složením výživy obrovský význam prevence! Hyršlová Vaculová A., 2013 Hyršlová Vaculová A., 2013 Buněčná kultura na Petriho misce – adherentní epitheliální buňky kolonu Postupné uvolňování původně přisedlých buněk do média, apoptóza, apoptotická tělíska v umělé in vitro kultuře nejsou přítomny fagocyty, aby je pohltily, může proto docházet k tzv. sekundární nekróze Modelový systém pro studium apoptózy – in vitro Hyršlová Vaculová A., 2013 ATCC Hyršlová Vaculová A., 2013 Kolorektální karcinogeneze Maligní transformace normální střevní tkáně – charakteristika: Getetické změny: akumulace mutací Abnormální dynamika střevní krypty: porušení rovnováhy mezi proliferací, diferenciací a apoptózou Deformace střevní krypty: nadměrné hromadění buněk vede k výrazným změnám morfologie krypty Formace polypů: nahromadění buněk, benigní útvary Progrese nádoru: další akumulace genetických změn, zvyšování malignity a invazivity Metastázování: CRC metastázuje převážně do jater Hyršlová Vaculová A., 2013 Kolorektální karcinogeneze Nahromadění mutací nádorových supresorových genů a protoonkogenů během kolorektální karcinogeneze (Vogelstein et al. 1988, Fearon & Vogelstein 1990) Pro rozvoj maligního onemocnění je třeba kombinace několika různých mutací – např. geny APC, DCC, p53…. (Hamilton et al. 1998) Hyršlová Vaculová A., 2013 Významné změny střevních buněk během vývoje nádorového onemocnění Zvýšená aktivace proliferačních a antiapoptotických signálních drah, zvýšená exprese některých antiapoptotických proteinů Změny citlivosti buněk k apoptóze, např. apoptóze indukované TRAILem – v procesu kolorektální karcinogeneze Hyršlová Vaculová A., 2013 TRAIL  selektivní indukce apoptózy u celé řady nádorových buněk, ne však u většiny normálních TRAIL-R1 (DR-4, APO-2) TRAIL-R2 (DR-5, TRICK, Killer) TRAIL-R3 (DcR1) TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD) TRAIL-R5 (osteoprotegerin) • možnost interakce s pěti různými receptory (na rozdíl od TNF, Fas) Hyršlová Vaculová A., 2013 Význam TRAILu  Velmi výhodné vlastnosti (selektivní působení na nádorové buňky, indukce apoptózy nezávisle na p53) využití v protinádorové terapii jako důležitá alternativa ke konvenčním léčebným postupům využívajícím chemoterapii a ionizující záření (řada nádorů rezistentních, dráha přes mitochondrie, overexprese Bcl-2)  Některé nádorové buňky jsou však rezistentní k apoptóze indukované TRAILem popis signálních drah TRAILu je proto velmi důležitý pro pochopení mechanismu působení, mechanismů rezistence a pro správné zacílení protinádorové terapie Hyršlová Vaculová A., 2013 Efektorové kaspázy Kaspáza-8 Kaspáza-9 Kaspáza-3 Prokaspáza-9 dATP Apaf-1 Cytochrom c Prokaspáza-8 Bid tBid Mitochondrie „Death“ substráty Buněčná membrána FADD TRAIL „death receptor“ Kaspáza-6 Mcl-1 Bcl-2 Bax Bak jádro DISC Hyršlová Vaculová A., 2013 Působení TRAILu na nádorové buňky tlustého střeva TRAIL indukuje apoptózu nádorových buněk střeva in vitro v průběhu kolorektální karcinogeneze roste citlivost buněk k apoptotickým účinkům TRAILu (adenom vs. karcinom) (Hague et al., 2005) Popsána účinnost TRAILu rovněž v systému in vivo – inhiboval růst xenograftů (karcinom kolonu) u myší, bez vedlejších projevů systémové toxicity (Walczak et al., 1999) Hyršlová Vaculová A., 2013 Důležitost ROVNOVÁH Signální dráhy indukující -buněčnou smrt -přežití buněk Co rozhodne o výsledném osudu buňky? Hyršlová Vaculová A., 2013 Dráha Ras/Raf/MEK/ERK MAPK - mitogen-activated protein kinase (MAPK) Klíčová dráha přenášející signály z receptorů růstových faktorů do jádra Molekuly této dráhy mají důležitou funkci v regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy Deregulace této dráhy mají dalekosáhlé důsledky a byly pozorovány u řady onemocnění včetně nádorových Konstitutivní aktivace této dráhy u vysokého procenta nádorů Inhibitory těchto kináz jako protinádorově působící léčiva – testování různých typů, klinické zkoušky Hyršlová Vaculová A., 2013 ERK – extracellular signal-regulated protein kinase, MAPK (mitogen-activated protein kinase) Regulace - proliferace - diferenciace - apoptózy Konstitutivní aktivace MAPKs je častým jevem u řady nádorových buněčných linií včetně kolonu (Hoshino et al., 1999) (Sorbera et al., 2002) U0126 Hyršlová Vaculová A., 2013 42/44 42/44 40 pERK ERK b-actin kDa - ERK1/2 konstitutivně aktivní u nádorových buněk kolonu - TRAIL významně indukuje fosforylaci ERK1/2 u buněk HT-29 - U0126 – inhibice bazální i TRAILem indukované fosforylace ERK1/2 Hyršlová Vaculová A., 2013 Posílení apoptózy indukované TRAILem v podmínkách specifické inhibice dráhy MEK/ERK 113 89 kDa 1.80.3% 25.71.7% * 1.40.3% 38.54.8%*+x M30cytodeath M30cytodeath M30cytodeath M30cytodeath Štěpení CK18 (M30cytodeath, FCM) Štěpení PARP Hyršlová Vaculová A., 2013 Mcl-1 mRNA Mcl-1 protein 40Mcl-1 kDa 40b-actin *x * * 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 control TRAIL U0126 TRAIL+U0126 relativeMcl-1mRNAexpression Blokace dráhy MEK/ERK – inhibice exprese mcl-1 mRNA a proteinu Hyršlová Vaculová A., 2013 Mcl-1 myeloid cel leukemia-1 protein, poprvé identifikovaný u diferencujících myeloidních buněk linie ML-1 (Kozopas et al., 1993) Antiapoptotický protein z rodiny Bcl-2 Důležitý regulátor mitochondriální dráhy indukce apoptózy Interaguje s proapoptotickými proteiny rodiny Bcl-2, inhibice apoptotických změn na úrovni mitochondrií (vylití cytochromu c atd.) Hyršlová Vaculová A., 2013 Mcl-1 Protein s velmi krátkým poločasem rozkladu – 30 minut až několik hodin (x např. protein Bcl-2) Časný kritický regulátor apoptózy, krátkodobá ochrana buňky před spuštěním buněčné smrti Účinná regulace Mcl-1 na mnoha úrovních v buňce Hyršlová Vaculová A., 2013 Mcl-1 a nádorová onemocnění Overexprese proteinu Mcl-1 u řady nádorů (NSCLC, hepatocellularní karcinom, cholangiokarcinom, jaterní metastázy CRC) (Song et al. 2005, Sieghart et al. 2006, Okaro et al. 2001, Backus et al.2001) Zde zvýšená exprese Mcl-1 může chránit nádorové buňky před apoptózou Úloha proteinu Mcl-1 v rezistenci buněk k protinádorové terapii (CHT, záření…) – Mcl-1 anti-sense, siRNA - terapeutické strategie Hyršlová Vaculová A., 2013 Úloha poteinu Mcl-1 v regulaci citlivosti buněk k apoptóze Mcl-1 RNAi – zcitlivění buněk hepatocelulárního karcinomu k apoptóze indukované působením chemoterapie a inhibitorů dráhy PI3K/Akt, ale ne k apoptóze indukované TRAILem (Schulze-Bergkammen et al., 2006) Mcl-1 si RNA – zcitlivění buněk cholangiokarcinomu k apoptóze inukované TRAILem (Taniai et al., 2004) Protein Mcl-1 hraje roli v regulaci citlivosti nádorových buněk kolonu k apoptóze indukované TRAILem Hyršlová Vaculová A., 2013 MMP posílení apoptózy indukované TRAILem prostřednictvím U0126 na úrovni mitochondrií prostřednictvím eliminace Mcl-1 Hyršlová Vaculová A., 2013 Specifická inhibice signální dráhy ERK1/2 významně zcitlivuje nádorové buňky tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem TRAIL rovněž může aktivovat dráhu ERK1/2 a nárůst množství proteinu Mcl-1 v buňkách (antiapoptotické působení!!), tyto efekty lze účinně inhibovat v podmínkách inhibice MEK/ERK Úloha ERK v regulaci Mcl-1 Hyršlová Vaculová A., 2013 Hyršlová Vaculová A., 2013 TRAIL a Mcl-1 Specifická downregulace proteinu Mcl- 1 – cesta k úspěšnému překonání rezistence k apoptóze indukované TRAILem Snaha připravit a použít inhibitory s minimem vedlejších účinků Sorafenib – inhibitor kináz, specifická inhibice syntézy proteinu Mcl-1 (Ricci et al., 2008) Hyršlová Vaculová A., 2013 PI3K/Akt PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) – lipidová kináza, součástí signální dráhy tyrosinkinázových receptorů Stimulace proliferace, inhibice apoptózy Konstitutivní aktivace u řady nádorů Inhibitory PI3K, Akt jako potenciální protinádorová terapeutika Aktivní PI3K fosforyluje a tím aktivuje kinázu Akt (PKB), která má dále celou řadu substrátů, jenž se podílejí na regulaci proliferace a apoptózy Hyršlová Vaculová A., 2013 (Cooper GM, The Cell: A Molecular Approach.) Phosphatidylinositol 4,5BisPhosphate (PIP2) Phosphatidylinositol (3,4,5)trisphosphate (PIP3) phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK1) Hyršlová Vaculová A., 2013 (Pondrom et al., 2005) Hyršlová Vaculová A., 2013 (Alberts et al., 2002, Molecular Biology of the Cell) Akt in regulation of cell survival/death Hyršlová Vaculová A., 2013 Akt (PKB) - Akt je jednou z nejčastěji aktivovaných protein kináz u nádorů, Akt může fosforylovat širokou škálu substrátů, z nichž některé hrají důležitou úlohu v karcinogenezi - Hyperaktivace Akt je spojena s rezistencí k apoptóze a zvýšenou buněčnou proliferací - buněčný homolog virového onkogenu vAkt - Akt spouští řadu antiapoptotických signálů: – inaktivuje proapoptotický protein Bcl-2 rodiny – Bad, - inaktivuje kaspázu 9, - brání vylití cytochromu c z mitochondrií, - reguluje hladinu proteinu FLIP, - fosforyluje NF-kappa B - Akt se podílí na stimulaci buněčného cyklu - reguluje stabilizaci některých cyklinů a transport inhibitorů kináz do jádra Hyršlová Vaculová A., 2013 PI3K/Akt Velmi důležitá dráha v regulaci proliferace a diferenciace střevních buněk, zprostředkování signálů pro přežití (Sheng et al., 2003) významná role PI3K/Akt dráhy v regulaci citlivosti buněk k apoptóze indukované TRAILem – melanocyty (Larribere et al., 2004) – colon (Rychahou et al., 2005) Hyršlová Vaculová A., 2013 Posílení apoptózy indukované TRAILem v podmínkách specifické inhibice dráhy PI3K/Akt * *+x 0 10 20 30 40 50 60 K TRAIL LY294002 TRAIL+LY294002 %pozitivníchbuněk 113 89 PARP kDa caspase-8 41/43 55/57 Štěpení CK18 (FCM) Hyršlová Vaculová A., 2013 60pAkt Akt 60 * *+x 0 5 10 15 20 25 30 35 40 K TRA IL LY294002 TRA IL+LY294002 %buněksesníženýmMMP MMP (TMRE, FCM) Hyršlová Vaculová A., 2013 Specifická inhibice signální dráhy PI3K/Akt významně zcitlivuje nádorové buňky tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem Hyršlová Vaculová A., 2013 EGF Epidermální růstový faktor Vazba na povrchový receptor EGFR Stimulace proliferace a antiapoptotických signálních drah Aktivace drah MEK/ERK a PI3K/Akt Nadměrná stimulace této dráhy během nádorových onemocnění Inhibitory EGFR dráhy – potenciálně využitelná léčiva, aplikace v kombinované terapii – monoklonální protilátky proti EGFR (Cooper GM, The Cell: A Molecular Approach.) Hyršlová Vaculová A., 2013 http://healthcare.sourcebioscience.com/diagnostic-tests/egfr Hyršlová Vaculová A., 2013 Molekuly zapojené v signální dráze EGFR, deregulované u CRC (Krasinkas et al., 2011) Hyršlová Vaculová A., 2013 EGF snižuje citlivost nádorových buněk tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem Hyršlová Vaculová A., 2013 Dráha EGFR vs. nádorové onemocnění Vysoká exprese EGFR a posílená aktivace dráhy EGFR – během progrese nádorových onemocnění – přispívá k rezistenci nádorů k chemo- a radioterapii, ke zvýšené proliferaci nádorových buněk Stimulace EGFR vede také k podpoře neoangionegeze a migrace buněk Blokace EGFR dráhy – – využití v protinádorové terapii syntetické inhibitory EGFR monoklonální protilátky - Erbitux Hyršlová Vaculová A., 2013 In cancer cells, activation of the EGFR or related pathways induces genes implicated in tumor progression. EGFR targeted therapies block the activation of this signaling pathway. http://www.krascanada.ca/en/detect.html Hyršlová Vaculová A., 2013 (Khambata-Ford et al., 2007) Hyršlová Vaculová A., 2013 http://erbitux.registry.cz/ Hyršlová Vaculová A., 2013 Cetuximab (marketed under the name Erbitux) a monoclonal antibody, an epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor given by intravenous infusion for treatment of metastatic colorectal cancer manufactured and distributed in North America by ImClone and Bristol-Myers Squibb, while in the rest of the world distribution is by Merck KgaA treatment of patients with EGFR-expressing, KRAS wild-type metastatic colorectal cancer (CRC), in combination with chemotherapy, and as a single agent in patients who have failed oxaliplatin- and irinotecan-based therapy and who are intolerant to irinotecan. in mCRC, biomarkers, including KRAS, are indicative of response to cetuximab (Erbitux). 60% of patients express the KRAS wild-type tumor and data have shown that these patients are significantly more likely to benefit from treatment with cetuximab or a combination of cetuximab plus chemotherapy Hyršlová Vaculová A., 2013 osud buňky jasně závisí na rovnováze proapoptotických a antiapoptotických drah roli hrají jak konstitutivně aktivované kinázy, tak ty, které jsou indukované působením apoptotického stimulu Hyršlová Vaculová A., 2013 Modulace aktivity signálních drah MEK/ERK a PI3K/Akt má významnou úlohu v regulaci citlivosti nádorových buněk k působení induktorů apoptózy - Inhibitory signálních drah MEK/ERK a PI3K/Akt Hyršlová Vaculová A., 2013 (Schulze-Bergkammen, 2009) Hyršlová Vaculová A., 2013 důležitost klasifikace nádorových buněk s ohledem na odpověď k TRAILu před jeho terapeutickou aplikací důležitost současné aplikace inhibitorů „pro-survival“ kináz a TRAILu v protinádorové terapii pro optimální výsledek terapie u některých typů nádorů Hyršlová Vaculová A., 2013 Apoptóza vs. léčba rakoviny Možnost spustit apoptózu nádorové buňky je základní podmínkou úspěšné protinádorové terapie Řada nádorových buněk je však vůči apoptóze rezistentní Je nutné objasnit mechanismy rezistence a překonat ji (nová léčiva, spuštění alternativních mechanismů, kombinovaná terapie, genová terapie…) Hyršlová Vaculová A., 2013