Plazmidy – podstatná složka genomu bakterií
Definice:
Plazmidy jsou extrachromozomální, autonomně se
replikující genetické elementy, které se vyskytují v
buňkách všech skupin mikroorganismů.
Význam:
1. Podstatně ovlivňují základní biologické vlastnosti svých
hostitelů, podílejí se na jejich diverzitě a evoluci
2. Jsou využívány k poznání základních
molekulárněbiologických procesů v bakteriálních
buňkách a horizontálnímu přenosu genů
3. Jsou prakticky a široce využívány v metodách MB a GI,
zejména jako vektory
CHARAKTERISTIKA PLAZMIDŮ
dsDNA – kružnicová nebo lineární, velikost: 1-1000 kb
Základní typy plazmidů:
kryptické - funkce neznámá
epizomální - reverzibilní integrace do chromozomu hostitele
konjugativní - schopné přenosu konjugací
mobilizovatelné – přenositelné za přítomnosti konjugativního plazmidu
Příklady plazmidů:
F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní)
zodpovědné za konjugaci, příp. mobilizaci jiných plazmidů
R-plazmidy (R-faktory)
zodpovědné za rezistenci k antibiotikům, řada z nich konjugativní
kolicinogenní (Col-plazmidy) (bakteriocinogenní plazmidy)
tvorba proteinů s antibiotikovým charakterem (Enterobacteriaceae)
Virulenční plazmidy
Ti-plazmidy (tumory indukující)
tvorba nádorů u dvouděložných rostlin (Agrobacterium tumefaciens)
Plazmidy odbourávající organické sloučeniny (Pseudomonas)
Plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium).
Plazmidy používané jako vektory pro přenos DNA (pBR322, pUC, Ti)
Objev: spojen s konjugací u E. coli, později ColE1 a R-plazmidy
PLAZMIDY
Plazmidy archeí
- málo prostudované, nejlépe u metanogenních archeí
- většinou kryptické
- některé mají charakter megaplazmidů (např. u Haloferax volcanii) –
velikost 690, 442 a 86 kb,
- identifikované geny:
---- geny pro tvorbu plynových měchýřků
---- geny kódující restrikční endonukleázy a metylázy
- konjugativní plazmidy (r. Sulfolobus) – schopnost integrace do
chromozomu, jednosměrný přenos, patrně i do bakterií
-- některé plazmidy mají geny podobné provirům archeií
KLASIFIKACE PLAZMIDŮ
označování: pXY123
Univerzální vlastností plazmidů je jejich inkompatibilita,
kterou se rozumí neschopnost dvou plazmidů koexistovat
společně v téže buňce (navzájem se vytěsňují).
Kompatibilitou se rozumí schopnost dvou plazmidů
koexistovat v jedné buňce bez selekčního tlaku a stabilně se
dědit.
Rozlišuje se mezi vektoriální a symetrickou inkompatibilitou.
- vektoriální: je ztracen vždy jeden konkrétní plazmid ze dvou.
- symetrická: každý z plazmidů je ztrácen při stejné pravděpodobnosti.
Do stejné inkompatibilní skupiny náležejí navzájem
inkompatibilní plazmidy. Inkompatibilní plazmidy jsou
vzájemně příbuzné (využívají tentýž mechanismus
kontroly replikace).
V současné době je známo asi 30 inkompatibilních
skupin u enterobaktérií, 9 u stafylokoků atd.
Důkaz přítomnosti plazmidu v bakteriálních buňkách
1. Elektroforéza po izolaci plazmidové DNA
2. Průkaz CCC DNA v elektronovém mikroskopu.
3. Centrifugační metody:
- důkaz satelitního pruhu v sacharozovém gradientu podle S.
- důkaz v CsCl-EB podle konformace CCC, LIN a OC.
Charakterizace plazmidů
- stanovení velikosti: elektronmikroskopicky nebo v agarozovém gelu, kde se
nejdříve linearizuje
- konstrukce restrikční mapy, sekvenování DNA
- zařazení plazmidu do inkompatibilní skupiny. Za tímto účelem je
plazmid přenesen do vhodných recipientních testovacích kmenů, které již
obsahují známé plazmidy příslušných kompatibilních skupin.
Předpokladem je to, aby oba plazmidy měly různé genetické markery, např.
dva různé geny pro rezistence. Při Inc-testu se kmen pomnožuje nejdříve
bez selekčního tlaku 10-50 generací a pak se vzniklé kolonie testují na
přítomnost obou plazmidů.
Pro stanovení příbuznosti dvou plazmidů lze použít i srovnání jejich
restrikčních map. Přesnější analýza určitých oblastí se pak může provést
hybridizací. Poslední krok je sekvenování DNA.
Důkaz přítomnosti plazmidu v bakteriálních buňkách
1. Průkaz DNA v elektronovém mikroskopu
2. Centrifugační metody: důkaz satelitního pruhu po centrifugaci
3. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu
P
Ch
P
1. 2. 3.
P
P
Ch
CsCl
(CsCl-EB)
sach.
DŮKAZ PROTEINŮ KÓDOVANÝCH
PLAZMIDEM (E. coli)
A. Systém využívající minibuňky: není přítomen
chromozom, ale plazmidy (inkubovány v minimálním mediu za
přítomnosti značených aminokyselin (35S-metionin). Proteiny
jsou detekovány na SDS-PAGE a prokázány autoradiograficky.
B. Systém využívající maxibuňky. Po ozáření UV-světlem
se chromozomové geny v důsledku poškození neexprimují,
většina plazmidů za těchto podmínek zůstává díky své malé
velikosti intaktní a může geny exprimovat. Důkaz tvorby
proteinů probíhá analogicky jako u minibuněk.
C. Systém translace in vitro (Zubayův systém), který se
skládá z testované plazmidové DNA, ze supernatantu po
centrifugaci lyzátu buněk E. coli, obsahujícího proteinové
komponenty nutné pro transkripci a translaci (RNApolymeráza,
ribozomy, translační faktory, 19
aminokyselin a jedné aminokyseliny značené, rNTP,
systému regenerujícího energii a další). Důkaz tvorby
proteinů probíhá analogicky jako u minibuněk.
ODSTRAŇOVÁNÍ PLAZMIDŮ
(„plasmid CURING“, LÉČENÍ)
změna fenotypu = důkaz, že určitá funkce je spjata s přítomností plazmidu
A. Interkalační barviva:
Akriflavin, akridinoranž, etidiumbromid a quinarcin patří mezi
interkalační barviva, které se začleňují mezi sousední báze a
zabraňují replikaci plazmidů.
B. Coumermycin a novobiocin:
Interference s účinkem DNA-gyrázy, který zavádí negativní
superhelikální otáčky do kruhové dsDNA.
C. Rifampicin a mitomycin C:
Rifampicin se váže na RNA polymerázu a zabraňuje tak transkripci.
Mitomycin C je metabolicky aktivován na intermediát, který
kroslinkuje DNA řetězce a blokuje tak transkripci.
D. Natriumdodecylsulfát (SDS):
Narušuje vazbu plazmidu k b. membráně
E: Další metody:
Zvýšená teplota, skladování kultur, regenerace protoplastů
Komplementární přístup: přenos plazmidu do bezplazmidových buněk
LOKALIZACE ORI NA PLAZMIDOVÉ MOLEKULE,
STANOVENÍ ZPŮSOBU REPLIKACE
Štěpení plazmidů
v různých stadiích
replikace restrikčním
enzymem, sledování
struktury v EM
RE
ori
Selektovatelný
gen
VYHLEDÁVÁNÍ (IZOLACE) POČÁTKU REPLIKACE (ORI) NA PLAZMIDU
PODLE POČTU KOPIÍ SE PLAZMIDY
DĚLÍ DO TŘÍ SKUPIN
1. S nízkým počtem kopií (1-2/chr)
2. Se středním počtem kopií (asi 15)
3. S vysokým počtem kopií (více jak 15)
(dělení je umělé a hranice není pevná)
STANOVENÍ POČTU PLAZMIDOVÝCH KOPIÍ
velikost chromozomu (kb) radioaktivita plazmidu (cpm)
velikost plazmidu (kb) radioaktivita chromozomu (cpm)
x
POČET KOPIÍ =
-Ultracentrifugace v CsCl-EB s radioaktivně značenou DNA,
stanovení radioaktivity v jednotlivých frakcích (pruzích)
-Elektroforéza v gelu, stanovení množství DNA (densitometricky)
STANOVENÍ ČETNOSTI REPLIKACE PLAZMIDŮ
CENTRIFUGACÍ V GRADIENTU CsCl
0,3 generace
0,5 generace
1,0 generace
15N 14N/15N 14N
Plazmid, který se replikoval
dvakrát nebo vícekrát
Plazmid, který se nereplikoval
Plazmid, který se replikoval 1x
Růst buněk v mediu s 14N a
následně v mediu s 15N
MECHANISMY REPLIKACE PLAZMIDŮ
Začíná ve specifickém místě (oriV)(n. oriT)
vytvořením volné 3´OH skupiny (buď
RNA-primer, nebo zlom DNA)
malé plazmidy:
mechanismus otáčivé kružnice (RC-plazmidy)
velké plazmidy: (theta mechanismus)
mechanismus podobný replikaci chromozomu
je vyžadován Rep protein a další proteiny hostitele
(DnaA, B, G aj); v místě ori je po vazbě iniciačních
faktorů syntetizována primerová-RNA (plazmidy typu
ColE1 nevyžadují pro tvorbu primerové-RNA žádný
protein kódovaný plazmidem)
STRATEGIE KONTROLY POČTU
PLAZMIDOVÝCH KOPIÍ
Inhibitor – cíl
Plazmid kóduje difuzibilní inhibitor replikace, který se váže na
cílovou sekvenci
Iteronová strategie
Regulační protein (Rep) nezbytný k zahájení replikace je vázán
(titrován) opakujícími se sekvencemi (iterony) poblíž ori.
Replikace nastává po nasyntetizování dostatečného množství
volného regulačního proteinu.
Přímá regulace Nepřímá regulace
Vazba inhibitoru
brání iniciaci replikace
Vazba inhibitoru brání
syntéze produktu nezbytného
pro zahájení replikace
Regulace replikace
ColE1 plazmidu
a jeho derivátů
„Kissing“
komplex
Preprimer = cíl inhibitor
Párování RNAI
a pRNA-
prekurzoru
(RNAII)
zabraňuje
maturaci
primerového
transkriptu
Rop (regulation of
primer)
Rom (RNA One
inhibition Moderator).
inhibitor
„hug“
INTERAKCE RNAI S RNAII PŘI
INCIACI REPLIKACE ColE1
Mutace v genu
rop vedou ke
zvýšení počtu
kopií plazmidu
Po spárování RNAI a RNAII
se změní sekundární
struktura RNAII
(preprimeru), který pak není
RNázouH upraven na primer
+ Rop
ori V
Interakce RNAI, RNAII
a proteinu Rom (~Rop)
při iniciaci replikace
ColE1 plazmidu
Mutace v genu pro
protein Rop vedou
ke změně počtu
plazmidových kopií
REGULACE REPLIKACE PLAZMIDU ColE1
RNAI (inhibitor) je syntetizován konstitutivně a ve vyšší koncentraci než než
preprimerová RNAII. Rostoucí bakterie zvětšuje objem, čímž se snižuje
pravděpodobnost interakce RNAI a RNAII a dochází k zahájení replikace.
Další možnost regulace je dána působením proteinu Rop, jehož množství v
buňkách může kolísat (regulace na úrovni transkripce nebo translace, případně
jeho stabilita)
Regulace replikace plazmidu R1 (IncFII) – antisense RNA je využívána k potlačení
translace mRNA pro RepA protein
Umístění promotorů, genů a genových produktů
týkajících se replikace
Jakmile plazmid vstoupí do buńky, je většina RepA
mRNA vytvářena z promotoru PrepA. Protein RepA
se tvoří tak dlouho, dokud není dosaženo
standardního počtu kopií
Jakmile plazmid dosáhne žádaného počtu kopií,
protein CopB reprimuje transkripci
z promotorou PrepA. Nyní je RepA
transkribován jen z PcopB.
Antisense RNA CopA hybridizuje k oblasti mRNA
kódující vedoucí peptid a dsRNA je je štěpena
RNázouIII. To zabrání translaci RepA, která je
translačně spojena s vedoucím peptidem.
Regulace replikace prostřednictvím komplementární RNA u plazmidu colIP9
Podobně jako u R1 plazmidu je gen
kodující protein Rep (zde je to repZ)
translatován po směru transkripce
od ORF vedoucího peptidu zvaného
repY a tyto dva jsou rovnž
translačně napojeny . Translace repY
otevírá sekundární strukturu na
RNA, která uzavírá SD sekvenci TIR
(translační iniciační oblast genu
repZ). Sekvence v sekundární
struktuře se pak může párovat se
smyčkou vlásenky upstream od
genu repY vytvářející pseudoknot
(smyčku), čímž permanentně ruší
sekundární strukturu a ponechává
SD genu repZ přístupnou. Pak se na
TIR genu repZ může navázat ribozom
a překládat iniciátorový protein. Malá
komplementární Inc RNA se páruje
se smyčkou upstreamové vlásenky a
zabraňuje vytvoření vlásenky,
ponechávajíc SD sekvenci kodující
oblasti repZ blokovanou a
zabraňující translaci repY.
Vazba Inc antisense RNA na smyčku
struktury I přímo inhibuje vytvoření
pseudoknotu, a následně duplex
IncRNA-mRNA inhibuje translaci
RepY, a následně i translaci RepZ,
jelikož jsou translačně spojeny.
KONTROLA REPLIKACE ITERONOVÝCH
PLAZMIDŮ
Plazmid kóduje difuzibilní iniciační protein Rep, který se
váže na řadu 17-22 bp dlouhých přímých opakování iteronů
v oblasti oriV (různý počet u různých plazmidů).
Tento protein má následující vlastnosti:
iniciuje nové cykly replikace
může zabraňovat replikaci
funguje jako autorepresor na úrovni transkripce
Působení Rep je závislé na jeho koncentraci, která
je ovlivňována počtem plazmidových kopií (a tím i
počtem iteronů) a rozdílnou afinitou Rep k
iteronům (L a R) v oblasti ori.
R = CAAAGGTCTAGCAGCAGAATT-(TACAGA-R3)
RepA
PŮSOBENÍ PROTEINU RepA NA INICIACI
REPLIKACE U ITERONOVÉHO PLAZMIDU pSC101
aktivace
replikace
autoreprese
Vazba DnaA a
dalších proteinů
kódovaných
chromozomem
nízká koncentrace RepA replikace; vysoká koncentrace RepA autoreprese
iterony
KONTROLA REGULACE INICIACE
REPLIKACE PLAZMIDU F
čtyři L-iterony pět R-iteronů
represe
rep
Rep
Silnější vazba Rep
zábrana replikace
při nízkých
koncentracích Rep
Slabší vazba Rep
iniciace replikace při
vyšších
koncentracích Rep
Experimentální pozorování: delece R-iteronů vede ke zvýšení a
adice dodatečných R-iteronů ke snížení počtu kopií
DVOJÍ PŮSOBENÍ RepA PROTEINU ITERONOVÝCH PLAZMIDŮ
RepA se váže
jen na jeden
plazmid a
iniciuje
replikaci
RepA se váže na
dva plazmidy
současně a spojuje
je, čímž brání
replikaci
Důkaz EM
„coupling“
model
Nízký počet
plazmidových kopií
v buňce
Vysoký počet
plazmidových kopií
v buňce
MECHANISMY ZAJIŠŤUJÍCÍ STABILNÍ
UDRŽENÍ PLAZMIDŮ V BUŇKÁCH
(SEGREGAČNÍ STABILITA PLAZMIDŮ)
u vícekopiových plazmidů (>20) typu ColE1 je
přítomen nekódující úsek (cer, 380 bp), který je
cílem působení místně specifické rekombinázy
(kódovaná geny xerC a xerD na chromozomu) –
„Multimer resolution systems“
u větších plazmidů jsou rekombinázy kódovány
plazmidovými geny
u nízkokopiových plazmidů jsou přítomny aktivní
mechanismy rozdělování:
aktivní segregace: partitioning (lokus inc + proteiny
Par(Sop))
postsegregační usmrcování buněk, které ztratily plazmid
(interakce stabilního toxinu s nestabilním antitoxinem)
SYSTÉM PRO ROZDĚLOVÁNÍ MULTIMERNÍCH
PLAZMIDOVÝCH FOREM
Přímá opakování
Resolváza (místně
specifická rekombináza)
Xer FUNKCE E. Coli KATALYZUJE MÍSTNĚ-SPECIFICKOU
REKOMBINACI V MÍSTECH CER PRO ROZKLAD PLAZMIDŮ
ColE1
Proteiny XerC
a XerD E.coli
Působí na místo
dif poblíž ter u
E. coli
ZAJIŠTĚNÍ POČTU KOPIÍ SYSTÉMEM CER A XER
Plazmid
obsahuje cer
Plazmid
neobsahuje cer
vysoká pravděpodobnost vzniku bezplazmidových buněk
nízká pravděpodobnost vzniku bezplazmidových buněk
MODEL PŮSOBENÍ FUNKCE SOP (PAR) U
F PLAZMIDU – zajištění distribuce
plazmidových kopií do dceřiných buněk
Sop = stability of plasmid
Proteiny hostitele
Par
Vnitřní membrána
Par = partitioning (rozdělování)
sopA kóduje protein, který zřejmě reguluje expresi sopB:
protein SopB se váže spolu s proteiny hostitele na lokus
sopC (místo parS) obsahující 12 tandemových 43 bprepetic
a je ukotven na vnitřní membránu
3 kb
Model rozdělování plazmidu R1
A. Struktura lokusu par: lokalizace genů parM a
parR a cis-působícího místa parC.
B. ParR se váže na místo parC, což umožňuje
navázání ParM-ATP. Filamentum se
prodlužuje nasedáním dalších podjednotek
ParM-ATP, což vede k pohybu plazmidových
kopií k pólům buňky. Filamentum je
destabilizováno, jakmile dojde k hydrolýze
ParM-ATP na ParM-ADP.
Intracelulární lokalizace plazmidů
Metoda: využití fluorescenčního značení proteinů vázajících se na sekvence
plazmidů
Závěry:
1. Plazmidy mají v buňkách specifickou nebo preferovanou lokalizaci:
obvykle poblíž první a třetí čtvrtiny buňky
2. Lokalizace plazmidu v buňce závisí na jeho rozdělovacím systému
3. U rychle rostoucích buněk jsou plazmidy ve dvojicích nebo
skupinách, které využívají společné připojovací místo na membráně
(počet fluorescenčních signálů je nižší než počet plazmidových kopií)
4. Různé typy (druhy) plazmidů využívají různá místa pro přichycení při
jejich dělení a v buňce se nacházejí na různých místech.
Celkový závěr: platí obecný model, podle kterého je signál pro rozdělení
plazmidu u dělících se buněk uprostřed a po rozdělení buňky se
přesunuje do první a třetí čtvrtiny buňky.
Obecné schéma znázorňující rozdělování plazmidů
Nově zreplikované plazmidy
umístěné ve středu buňky se
oddělí a přesunou do první a třetí
čtvrtiny ještě před tvorbou septa
Po rozdělení buňky se tyto polohy
stávají v dceřiných buňkách opět
středovými
Rozdělovací
aparát (jeho
složky nejsou
dosud známy)
MODELY ZNÁZORŇUJÍCÍ FUNKCI MÍST PAR U PLAZMIDŮ F A RP1
A. Plazmid se váže na místo par
na membráně. Při dělení buňky
jsou kopie plazmidu přichyceny
na rozdělená místa par a taženy
do dceřinných buněk
B. Dvě kopie plazmidu se nejdříve
navážou na místo par a při jeho
rozdělení jsou odděleny
Fluorescenčně
značené proteiny
Par (ParA-GFP;
ParB-GFP)
Vizualizace polohy plazmidů F a P1 uvnitř buněk E. coli
pomocí fluorescenčního barvení – různé plazmidy se
nacházejí v různých místech
F - červená
P1 - zelená
Membrána
- modrá
Obecný mechanismus „genetického donucování“ (závislosti,
addiction systems) – udržování plazmidu v populaci buněk
Na plazmidu jsou přítomny dva geny, kódující dva produkty:
1. toxin (killer) - stabilnější
2. antitoxin (antidot, antikiller) - nestabilní
Plazmid je
přítomen,antitoxin
inhibuje toxin,
buňka přežívá
Plazmid není
přítomen, toxin usmrtí
buňku
Toxin: napadá životně důležité molekuly v buňce
Antitoxin: eliminuje působení toxinu
Ccd = couples cell division (geny týkající se buněčného dělení - replikace DNA )
POSTSEGREGAČNÍ USMRCOVÁNÍ BEZPLAZMIDOVÝCH
BUNĚK PŮSOBENÍM PROTEINOVÝCH SYSTÉMŮ
Degradace antitoxinu
Negativní
regulace
- v nadbytku
+++ +
operon
nefunkční antitoxin
Smrt
buňky
funkční antitoxin
SLOŽKY PROTEINOVÝCH SYSTÉMŮ
PRO UDRŽENÍ PLAZMIDU V BUŇCE
Proteiny pro replikaci chromozomu buňky
RM-systémy typu II nesené na plazmidu (např. EcoRI)
C. Anti-sense-RNA-regulated systems
POSTSEGREGAČNÍ ZABÍJENÍ
BEZPLAZMIDOVÝCH BUNĚK PŮSOBENÍM
SYSTÉMU HOK/SOK U PLAZMIDU R1
Antisense sok-RNA je
nestabilní a po ztrátě
plazmidu z buněk rychle
zmizí
hok = host killing (toxin); sok = suppression of killing (antitoxin)
Hok protein je stabilní a po
ztrátě plazmidu z buněk
navodí kolaps
membránového potenciálu
SLOŽKY R-PLAZMIDŮ
1. Resistance transfer factor (RTF) – nese geny regulující DNA
replikaci a počet kopií, geny pro přenos a někdy geny pro rezistenci k
tetracyklinu.
2. R determinanta – má různou velikost a nese další geny pro
rezistenci k antibiotikům – obvykle ampicilinu, chloramfenikolu,
streptomycinu, kanamycinu, sulfonamidu – v různých kombinacích.
Vystavením buněk antibiotiku dochází k amplifikaci R-složky a
zvětšuje se velikost celého plazmidu
RTF
(geny pro přenos
a replikaci, + TetR)
IS element
R determinanta
(geny pro rezistence)
+
R plazmid
Plazmidy zodpovědné za rezistenci bakterií k antibiotikům (R-plazmidy)
ÚLOHA TRANSPOZONŮ PŘI EVOLUCI R-PLAZMIDŮ
každý transpozon může být přenášen nezávisle
Segment obsahující transpozony
nesoucí determinanty rezistence
Segment pro přenos determinant
Bakteriociny inhibují jednu nebo více základních funkcí
(replikace, transkripce nebo translace, nebo energetický
metabolismus).
Na nárůstu citlivých buněk vytvářejí sterilní zóny – lakuny.
Pravé koliciny x defektní fágové částice (fágové bičíky, lytické
enzymy)
PŘÍKLADY BAKTERIÁLNÍCH DRUHŮ PRODUKUJÍCÍCH BAKTERIOCINY
Kolicinogenní plazmidy – produkují látky s antibiotických charakterem
STRUKTURA F PLAZMIDU (100 kb, 49% GC)
60 genů rozdělených podle funkce do 5 oblastí
1. Tranferová oblast
33 kb, 31 genů všechny funkce nezbytné pro přenos.
Biosyntéza a sestavování F pilu (traA,B,C,E,F,G,H,L,K,Q,U,V,W)
Stabilizace párujících se buněk (traG,N)
Konjugativní metabolismus DNA (traD,I,M,Y,Z)
Regulace přenostu (traJ,finO,finP)
Povrchová exkluze (traS,T)
2. Vedoucí oblast
Oblast, která je při přenosu DNA přenášena
jako první. 13 kb.
3. Oblast replikace
Tři oblasti s geny a sekvencemi
podílejícími se na replikaci.
4. Oblast s inzerčními sekvencemi
(IS3a,b, IS2, Tn1000)
5. Pif oblast
Pif (phage inhibition by F). Tři geny pifC.
HLAVNÍ FUNKČNÍ
OBLASTI F-PLAZMIDU
CHARAKTERISTIKA Ti-PLAZMIDŮ
(tumory indukující; 150-200 kb)
Hostitel:
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rubi
Agrobacterium rhizogenes (Ri-plazmidy)
Ti – způsobuje krčkové nádory (crown galls)
Ri – způsobuje vlasaté kořeny (hairy roots)
Geny na plazmidu:
T-DNA (15-45 kb) – syntéza opinů a fytohormonů
Geny pro virulenci
Geny pro katabolismus opinů
Ori
Geny pro konjugaci
Typy Ti-plazmidů (/podle typu opinu)
nopalinový
oktopinový
agropinový
sukcinamopionový
Typy Ri-plazmidů
manopinový
agropinový
Struktura opinů
1. Rodina oktopinů
Vznik kondenzací pyruvátu s některou aminokyselinou:
- Pyruvát + arginin: oktopin
- Pyruvát + lyzin: lyzopin
- Pyruvát + histidin: histopin
- Pyruvát + ornitin: kys. oktopinová
2. Rodina nopalinů
Vznik kondenzací a-ketoglutarátu s aminokyselinami
3. Rodina agropinů
Vznik kondenzací kys. glutamové s aminokyselinami
Chemická struktura opinů (zdroj C, příp. N)
Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem Agr. tumefaciens
Poraněná
rostlina
Infekce rostliny
bakterií s
Ti-plazmidem
Přenos T-DNA do
rostlinné buňky
Začlenění T-DNA do
jádra rostlinné buňky
opiny
Vytvoření
krčkového
nádoru
fytohormony1.
5.
4.
3.
2.
T-DNA
Geny pro
katabolismus
opinů
Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens
Část plazmidu přenášená do
rostliny
Geny pro
přenos T-DNA
do rostlinných
buněk
Geny zodpovědné
za transformaci
rostlinných pletiv
Geny zodpovědné
za tvorbu opinů v
rostlinných buňkách
25 bp LB
25 bp RB = sekvence nezbytná
pro začlenění T-DNA do
genomu rostliny
Mozaikovitá struktura Ti-PLAZMIDU
Konjugativní přenos
Ti-plazmidu do bakterií
PRŮBĚH PŘENOSU Ti-PLAZMIDU
DO ROSTLINNÉ BUŇKY
agrobakterium
rostlinná buňka
PŘENOS T-DNA Z AGROBAKTERIA DO
ROSTLINNÉ BUŇKY
PRŮBĚH PŘENOSU T-DNA Z
AGROBAKTERIÍ DO ROSTLIN
1. Poranění rostliny, sekrece fenolických látek do prostředí (typu
acetosyringonu: acetovanilon, hydroxyacetofenon aj.)
2. Reakce bakterií A. tumefaciens na fenolické látky (pozitivní
chemotaxe)
Aktivace genů vir na Ti-plazmidu
Připojení bakterií k rostlinným buňkám
(spolupůsobení chromozomových genů chvA, chvB, pscA)
3. Aktivace transkripce genů virB, C, D a E prostřednictvím proteinu
kódovaného genem virG.
4. Působení produktů genů vir:
Vznik jednovláknových zlomů na Ti-plazmidu (produkt genu virD)
Tvorba jednovláknových kopií T-DNA
5. Vytvoření přenosového komplexu T-DNA a polypeptidů virD a virE
6. Přenos komplexu T-DNA do rostlinné buňky
7. Přenos T-DNA do jádra rostlinné buňky
8. Integrace T-DNA do chromozomu (různá místa, částečná homologie
sekvencí RB a LB s místy začlenění)
FUNKCE PLAZMIDOVÝCH
GENŮ VIRULENCE
Geny vir = skupina genů v úseku asi 35 kb, velmi
podobném u různých Ti-plazmidů
Celkem asi 25 vir genů (7 operonů): virA,B,C,D,E a
G, vytvářejících 20 polypeptidů
a) tvorba jednovláknových zlomů na T-DNA: virD1,
virD2
b) odkrucování jednovláknové T-DNA: virD1, virD2 a
virE2
c) vytvoření přenosového komplexu TDNA/proteiny:
virD1, virD2 (virB)
d) rozmezí hostitelů: virC
HLAVNÍ RYSY PŘENOSU T-DNA
DO ROSTLINNÉ BUŇKY
1. Do rostlinné buňky je z Ti-plazmidu přenášena pouze
T-DNA, ve formě ssDNA
2. Při integraci T-DNA do rostlinného genomu dojde k
definovanému začlenění 5´ konce (1-2 bp BR), začlenění
3´ konce je variabilní (vznik delecí 3-100 bp)
3. Do rostlinného genomu se může začlenit více kopií TDNA,
i tandemově (vznik tandemů není jasný)
4. Pro přenos je nutná pouze 25 bp BR
5. Místo integrace je náhodné, nejsou vyžadovány úseky
homologie – preferenčně probíhá do transkripčně
aktivních oblastí (často místa bohatá na AT páry)
6. Vlastní proces integrace T-DNA do genomu rostliny
není jasný – účast reparačních enzymů rostliny, ?
Produkty genů na T-DNA
7. V místě integrace dochází k přeskupením (delece,
přeskupení apod.)
Symbiotické plazmidy Rhizobiaceae (pSyn)
Diazotrofie: klíčový proces v biosféře – přeměna N2 na redukované formy (amonium)
- volně žijící bakterie uskutečňují tento proces pro svou potřebu při omezením množství
amoniaku nebo nitrátů
- symbiotické mohou fixovat dusík jen po vytvoření mutualistických interakcí
s leguminózami
Předpoklady pro ustavení účinné symbiozy mezi bakteriemi a rostlinou:
- chemotaktická invaze bakterií do kořenových buněk, kde se vytvoří specializovaný
rostlinný orgán: nodula
- bakterie mají 20 různých nodulačních (nod) genů – ty se podílejí na syntéze nebo
sekreci nodulačních faktorů (= silné mitogeny, přetvářející rostlinné buňky)
- uvnitř rostlinných buněk vytvářejí bakterie bakteroidy, což jsou specializované buňky
určené k fixaci dusíku. Bakteroidy dodávají rostlině fixovaný dusík a od rostliny
odebírají fotosyntézou vytvářený uhlík.
Bakterie příbuzné rhizobiím byly zjištěny i u mravenců ve
specializovaném orgánu pro recyklování dusíku.
Lokalizace symbiotických genů u rhizobií
- Symbiotická fixace dusíku vyžaduje asi 60 genů
- Geny pro symbiozu jsou na 150 kb až 1683 kb plazmidech
(megaplazmidy), které představují 25-50% velikosti genomu
- většina genů pro nodulaci a fixaci dusíku je na jediném
symbiotickém plazmidu pSyn, v některých případech na
konjugativním transpozonu (502 kb) – symbiotický ostrov
- ztráta plazmidu vede k neschopnosti fixovat dusík
- Evoluce: přenos plazmidů nebo ostrovů vede k novým druhům
Degradativní plazmidy
Nesou geny propůjčující bakteriím schopnost biologicky degradovat organické
sloučeniny, které se běžně v přírodě nevyskytují. Ve většině případů kódují část
degradační dráhy včetně regulačních elementů.
Pseudomonas: salicylát, naftalen, kafr, octan, toluen,
fenoly, xylen, dichlorfenoxyaceton, chlorbenzen
TOL plazmidy (prototyp degradativních plazmidů)
Plazmidy nesou geny pro degradaci toluenu, xylenu, benzylalkoholů,
benzylaldehydů
Příbuzné plazmidy: schopnost růst na salicylátu nebo naftalenu jako jediném
zdroji C a E.
2,4-D-plazmid = model pro studium degradace chlorovaných aromatických
látek (např. (2,4-D = dichlorfenoxyoctové kyseliny používané jako herbicid)
Obecné rysy virulenčních plazmidů enterobakterií
- velikost 60-200 kb, nízkokopiové (1-2 kopie)
- podobné buď F plazmidu nebo R100
- v jedné buňce může být i více různých virulenčních plazmidů
- např. Yersinia má tři různé plazmidy, z nichž každý přispívá
výrazně k virulenci
Virulenční plazmidy
nesou geny zodpovědné za patogenitu a virulenci
bakteriálních kmenů
Geny virulence na plazmidech
Faktory virulence pro kolonizaci buněk a tkání
- toxiny pro adhezi na epitel a invazi,
- tvorba biofilmu
- průnik bakterií buněčnou membránou hostitele,
- systemické šíření do dalších tkání
- intracelulární přežívání v mikrofágách.
Virulenční geny obecně zvyšují přežívání v hostiteli, adherenci a invazivitu
do buněk a někdy interferují s imunitními funkcemi hostitele
Mikrofág, též neutrofilní granulocyt, druh bílé krvinky, leukocyt – fagocytující
buňka schopná pohlcovat drobné cizorodé částice, např. bakterie.
Virulenční plazmidy gramnegativních bakterií
Výskyt: Čeleď Enterobacteriace
A. normální mikroflóra gastronintestinálního traktu člověka Enterobacter, Klebsiella,
Escherichia
B. Patogeny: Salmonella, Shigella, Yersinia
Patogenní kmeny Escherichia coli:
Enterotoxigenní (ETEC)
Enteroinvazivní (EIEC)
Enterohemorhagické (EHEC)
Enteropatogenní (EPEC)
Enteroagregativní (EaggEC)
Spektrum chorob odráží obsah genů virulence lokalizovaných na plazmidech,
bakteriofágách, ostrovech patogenity (PAI), které nejsou u komensálů.
Virulenční plazmidy nesporulujících G+ patogenů
G+ bakterie: nejzávažnější nosokomiální patogeny jsou stafylokoky a enterokoky
Řada z nich je multirezistentní k antibiotikům.
Virulenční plazmidy Staphylococcus aureus
Extracelulární proteiny: toxiny vázané k určitým typům chorob
Enterotoxiny - ETB: potravinové otravy
TSST – syndrom toxického šoku
exfoliatin – syndrom opařené kůže
Virulenční plazmidy Enterococcus faecalis
identifikováno 18 různých plazmidů (prototyp: pAD1, 60 kb plasmid)
Faktory virulence: adhesin, matrix binding proteiny, kapsulární polysacharidy,
cytolyziny (lyze erytrocytů), želatinázy a proteázy schopné poškodit tkáně a
buňky.
Model rozdělování plazmidu R1
A. Struktura lokusu par: lokalizace genů parM a
parR a cis-působícího místa parC.
B. ParR se váže na místo parC, což umožňuje
navázání ParM-ATP. Filamentum se
prodlužuje nasedáním dalších podjednotek
ParM-ATP, což vede k pohybu plazmidových
kopií k pólům buňky. Filamentum je
destabilizováno, jakmile dojde k hydrolýze
ParM-ATP na ParM-ADP.