BAKTERIÁLNÍ TRANSPOZONY (mobilní elementy) Transpozon = sekvence DNA schopná transpozice, tj. přemístění z jednoho místa v genomu do jiného místa Transpozice = proces přemístění transpozonu Transponáza (transpozáza) = enzym zprostředkující transpozici Základní typy bakteriálních transpozonů IS = inzerční sekvence (IS-elementy) Tn = transpozony Bakteriofág MU Konjugativní transpozony Poprvé byly IS popsány v r. 1967 u E. coli analýzou mutant s těmito vlastnostmi: Mutace byly vysoce polární - každá se mapovala v prvním genu operonu, ale nebyly syntetizovány proteiny genů po směru transkripce. Polarita byla důsledkem přítomnosti transkripčně-terminační sekvence inzerčního elementu. Tyto mutace nebylo možné revertovat analogy bází nebo frame-shift mutageny, takže podstatou mutací nemohly být substituce ani adice nebo delece bází. Jestliže byly do kmenů s mutacemi přeneseny plazmidy, podobné polární mutace (i když v jiných genech) se na nich občas objevovaly. Např. F´lac+ se stal lac-. Fyzikální studium plazmidů ukázalo, že plazmid s mutací je delší díky inzerci elementu. SPECIFICKÉ RYSY TRANSPOZICE cílová místa nejsou homologická s místy donorovými obvykle dochází k duplikaci přenášené sekvence, tj. transpozon zůstává i v původním donorovém místě v místě inzerce se zdvojují ve stejném směru sekvence DNA - transpozon je na obou koncích ohraničen přímými repeticemi, což je důsledek mechanismu transpozice po inzerci transpozonu do cílového místa dochází k inaktivaci genů, po excizi transpozonu se funkce obnovuje. DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI IS-SEKVENCÍ U E. coli Vznik specificky transdukujících fágů Vznik heteroduplexů Mapování neznámých IS v gal operonu heteroduplexní analýzou ZNÁZORNĚNÍ PŘÍTOMNOSTI TRANSPOZONŮ V ELEKTRONOVÉM MIKROSKOPU - HETERODUPLEXNÍ ANALÝZA STRUKTURA IS SEKVENCÍ A SLOŽENÝCH TRANSPOZONŮ ISRISL IRi IRo Struktura složených transpozonů Příklady genetické organizace složených transpozonů Struktura IS50 Obsah transpozonů v R plazmidu Vznik složených transpozonů tvořených dvěma IS, mezi nimiž se nachází gen nebo geny pro ANTR STRUKTURA TRANSPOZONU Tn3 38 bp obrácená opakování res IS U GRAMNEGATIVNÍCH BAKTERIÍ ~1 kb rozdílnost IR jednotky bp transponáza součást Tn IS U GRAMNEGATIVNÍCH BAKTERIÍ ČTYŘI HLAVNÍ TŘÍDY TRANSPOZONŮ U G- BAKTERIÍ Nová třída V - nemají IR - netvoří TD Konjugativní transpozony IS A TRANSPOZONY U G+ BAKTERIÍ IS U ARCHEÍ Více kopií přestavby genomu VZNIK PŘÍMÝCH REPETICÍ V CÍLOVÉM MÍSTĚ PO ZAČLENĚNÍ TRANSPOZONU Vytvoření posunutých zlomů transponázou MODEL NEREPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE (KONZERVATIVNÍ, „cut and past“) Působení transponázy Vytvoření dvouřetězcových zlomů Degradace donorové molekuly Mechanismus transpozice Tn5 Průběh konzervativní transpozice MODEL REPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE kointegrát 1. Vytvoření jednořetězcových zlomů v donorové a cílové DNA transponázou, spojení volných konců 2. Replikace transpozonu 3. Vznik kointegrátu 4. Rozklad kointegrátu: a) homologní rekombinací v recA+ b) místně specifickou rekombinací působením resolvázy Replikativní transpozice Tn3 Tn10-LacZ+ Tn10-LacZDŮKAZ KONZERVATIVNÍ TRANSPOZICE Tn10 Vytváření směsi heteroduplexů a homoduplexů z transpozonů Tn10, které nesou alely genu lacZ lišící se toliko 3 bázemi. Tn10 je přítomen v transdukujících fágách lambda. Konzervativní transpozice Replikativní transpozice Většina případů Infikovaná buňka, v níž došlo k transpozici Donor (fág) Cílová molekula Důkaz konzervativní transpozice Mutace Nam a Pam – fág není schopen se replikovat ani lyzogenizovat Výsledky konzervativní a replikativní transpozice transpozonu Tn10 1. Konzervativní transpozice: Do chromozomu se začlení oba řetězce transpozonu 2. Replikativní transpozice: Do chromozomu se začleňuje jen jeden řetězec transpozonu nebo MODEL REPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE kointegrát 1. Vytvoření jednořetězcových zlomů v donorové a cílové DNA transponázou, spojení volných konců 2. Replikace transpozonu 3. Vznik kointegrátu 4. Rozklad kointegrátu: a) homologní rekombinací v recA+ b) místně specifickou rekombinací působením resolvázy MODEL TRANSPOZICE PROSTŘEDNICTVÍM TVORBY KOINTEGRÁTU (meziprodukt replikativní transpozice) MECHANISMUS REPLIKATIVNÍ TRANSPOZICE Rozklad kointegrátu zprostředkovaný místně-specifickým enzymem kódovaným transpozonem (resolváza u Tn3) nebo rekombinačním aparátem hostitelské buňky (RecA) Evoluce konjugativních plazmidů obsahujících geny pro rezistenci k antibiotikům mobilizace nekonjugativních plazmidů kondukcí ÚLOHA TRANSPOZONŮ PŘI EVOLUCI R-PLAZMIDŮ každý transpozon může být přenášen nezávisle přesná excize – úplná ztráta transpozonu nepřesná excize – ztráta části transpozonu DELECE POZOROVANÉ V MÍSTĚ ZAČLENĚNÍ IS1 V LOKUSU GAL E. coli Chromozomová přeskupení navozená transpozony a. Vznik delece intrachromozomovou rekombinací mezi dvěma stejně orientovanými transpozony b. Vznik inverze intrachromozomovou rekombinací mezi dvěma opačně orientovanými transpozony VZNIK DELECÍ A INVERZÍ PO TRANSPOZICI INVERZNÍ TRANSPOZICE Tn Tn fúze replikonů bez Tn Změna typu flagelinu jako důsledek změny orientace transpozonu u Salmonella typhimurium (variace fází) Promotor p řídí expresi flagelinového genu H2 a represoru rH1 Z promotoru p je exprimován H2 a rH1, je tvořen H2, exprese H1 je potlačena Není exprimován H2 a rH1, exprese H1 probíhá působení místně specifické rekombinázy 1kb Z promotoru p je exprimován H2 a rH1, je tvořen H2, exprese H1 je potlačena Není exprimován H2 a rH1, exprese H1 probíhá Inverze úseku obsahujícího promotor prostřednictvím Hin-invertázy Změna typu flagelinu jako důsledek změny orientace transpozonu u Salmonella typhimurium (variace fází) - II Čtení bez zastávky Vznik kompletního promotoru kombinací promotorových sekvencí -35 a -10 Vznik funkčního promotoru inzercí dvou IS21 (R a L) IS3 působí jako mobilní promotor CHARAKTERISTICKÉ RYSY TRANSPOZICE frekvence transpozice 10-4 až 10-7/cílový replikon specifita začlenění je pro různé elementy různá, liší se pro různé replikony (chromozom x plazmidy) – využití malých definovaných plazmidů mutace v genu pro transponázu ovlivňuje specifitu místa začlenění transpozice vyžaduje neporušenost koncových IR u Tn3 je známa imunita k transpozici podmíněná přítomností sekvencí IR FREKVENCE TRANSPOZICE transponáza je v buňkách přítomna ve velmi nízkých koncentracích (0,15 molekuly na buňku) aktivita transponázy se obtížně detekuje preference působení transponázy v cis: působí přednostně na DNA, z níž byla transkribována po uvolnění z DNA dochází k rychlému rozkladu transponázy REGULACE TRANSPOZICE Tn10 IE = inside end; OE = outer end Tnp = transponáza; Inh = inhibitor transponázy Místo vazby transponázy Koncová sekvence (TIP) Defektní Tnp a Inh Regulace transpozice Tn5 Regulace transpozice Tn10 prostřednictvím antisense RNA Pin řídí transkripci transponázového genu, Pout řídí transkripci antisense RNA, která je stabilnější než mRNA Při vysokém počtu kopií Tn10 je párování antisenseRNA a mRNA častější, k transpozici nedochází Při nízkém počtu kopií Tn10 dochází k párování antisenseRNA s mRNA jen vzácně a transpozice probíhá GENOM BAKTERIOFÁGA Mu (dsDNA, 37 kb) S-konec C-konec Represor c reguluje negativně expresi genů A a B kódující transponázu A protein se váže ke koncům genomu Mu, což stimuluje B protein. Vazba probíhá na 22 bp sekvencích. Vzniklý komplex = transpososom. Na 3´koncích vznikají zlomy, stejně je zlomena DNA v hostitelském chromozomu. Po infekci bakteriální buňky se DNA fága MU začleňuje náhodně do chromozomu konzervativní transpozicí Pomnožování fágových genomů probíhá replikativní transpozicí, čímž dochází k inaktivaci genů hostitelské buňky, která následně umírá Reprodukční cyklus fága Mu Po infekci buněk se fág začlení do genomu zřejmě konzervativní transpozicí, během lytického cyklu se množí replikativní transpozicí. V obou případech jsou místa začleňování profága zcela náhodná Konjugativní transpozony Konjugativní transpozony (CTn) = integrované elementy (18-500 kbp), které se samy vyčleňují z chromozomu donora, samy se přenášejí konjugací do recipienta a tam se začleňují do chromozomu Mobilizovatelné transpozony (MTn) = menší integrované transpozony (do 15 kbp), které se vyčleňují a přenášejí za účasti konjugativních transpozonů Současná terminologie Ctn : Conjugative transposon MTn: pro mobilizovatelné transpozony, dříve Nbu (non-replicating Bacteroides units) ICE – integrative and conjugal elements – pro integrující se elementy SXT – site-specific integrating elements CTn – nesou geny kódující: 1. integrázu a excisionázu (protein pro excizi), 2. proteiny vytvářející přenosový aparát jímž se pohybuje DNA z buňky do buňky 3. mobilizační proteiny, které vytvářejí jednořetězcové zlomy v oriT (geny tra jsou podobné genům plazmidu RP4 nebo F) 4. další produkty, zodpovídající za jiné znaky (např. rezistence k antibiotikům) PRŮBĚH PŘENOSU KONJUGATIVNÍCH TRANSPOZONŮ Transpozon začleněný do chromozomu se vyčlení a vytvoří kružnicový intermediát. Do recipientní buňky se přenáší kopie jednoho z řetězců prostřednictvím multiproteinového párovacího aparátu spojujícího obě buňky. Přenesená jednořetězcová kopie se změní na dvouřetězcovou formu, která se začlení do chromozomu recipientní buňky Mechanismus přenosu konjugativního plazmidu Tn916 Transpozon je excidován z chromozomu pomocí enzymů Int a Xis a cirkularizován. Cirkularizace umožní expresi genů tra z promotoru P Z místa oriT je zahájen přenos DNA ve formě jednořetězce. V recipientu se přenesená DNA cirkularizuje, doplní se druhý řetězec a transpozon se integruje do chromozomu. transpozony typu Tn916 mají široké rozmezí hostitelů – gen tetR je rozšířen u mnoha bakterií - Transpozon se exciduje z DNA v donorové buňce. Podobně jako fág lambda, Tn916 potřebuje dva proteiny: Int a Xis. - Excize vyžaduje dva zlomy poblíž začleněného transpozonu - Nejdříve integráza vytvoří posunuté zlomy poblíž konců transpozonu – sekvence jsou náhodné a liší se podle místa začlenění transpozonu v donorové DNA – a nejsou tudíž komplementární - Tyto sekvence se přesto párují za tvorby kružnicového transpozonového intermediátu – v místě spojení je heteroduplexní spojující sekvence. - V donorovém místě po vyčlenění transpozonu vzniká krátká delece - Kružnicový intermediát se nemůže replikovat, ale je přenesen do jiné buňky procesem podobným konjugaci plazmidů. - Transpozon má své vlastní oriT místo a tra geny (jsou podobné plazmidu RP4 a F). - Iniciace transferu začíná vytvořením zlomu v oriT a do recipientní buňky je přenesen jeden řetězec. - V recipientní buňce se konce transpozonu spojí a je dosyntetizován komplementární řetězec. - Int protein kódovaný transpozonem pak integruje transpozon do DNA recipientní buňky vytvořením tupých konců v její DNA – proto nevznikají duplikace cílové DNA. Proces přenosu konjugativních transpozonů Tn916 a CTnDOT MODEL EXCIZE A INTEGRACE KONJUGATIVNÍCH TRANSPOZONŮ Tn916 A CTnDOT Spojovací chromozomové sekvence (XXX/YYY nebo QQQ/RRR jsou původně vzájemně komplementární). Šipky naznačují místa vzniku posunutých zlomů před excizí nebo před integrací MOBILIZACE GENETICKÝCH ELEMENTŮ KONJUGATIVNÍMI TRANSPOZONY (PŮSOBENÍ IN TRANS) Mobilizovatelný rezidentní plazmid nese geny kódující proteiny vytvářející zlom v jeho DNA, CTn zajišťuje vytvoření multiproteinového párovacího aparátu CTn navozuje excizi rezidentního mobilizovatelného transpozonu (MTn) - CTn poskytuje proteiny pro excizi a cirkularizaci a pro přenos ssformy MTn do recipienta, kde se MTn již samostatně integruje do chromozomu Přenos Tn918 do S. aureus prostřednictvím konjugativního plazmidu ( příklad „hitch-hiking“) Transpozon se inzertuje do konjugativního plazmidu Str. feacalis a tento komplex je přenesen do S. aureus, kde se plazmid nereplikuje, Tn se vyčlení a začlení do chromozomu S. aureus.