VÝZNAM MUTAGENEZE U BAKTERIÍ Vyhledání genu a stanovení jeho funkce praktické využití modifikovaných kmenů (biotechnologie) příprava vakcín Výhody mikroorganismů při mutagenezi vysoká přirozená variabilita haploidní genom (malá velikost) velký počet potomstva za krátkou dobu snadný přenos genů snadná selekce Způsoby mutageneze klasická mutageneze (chemomutageny, fyzikální faktory) transpozonová mutageneze (biologické mutageny) mutátorové kmeny (mutace v reparačních mechanizmech) mutageneze in vitro NOMENKLATURA Genotyp: třípísmenový kód (zkratka) psaný kurzívou Gen je označen zkratkou trpA, alely trpA1 a) Standardní alely se označují znaménkem +, např. trp+ b) Mutantní alely se označují znaménkem -, např. trpFenotyp: Velké písmeno na začátku ne kruzívou, např. Trp. Standardní fenotyp se označí +, např. Trp+, mutantni -. Symbol není vždy totožný s označením genotypu. Např. fenotyp Nif- může mít podstatu v nifX- nebo nodX- (různé geny). Rezistence: r (R), s (S), uváděné jako exponenty (TetR) delece = ∆ inzerce = :: plazmid, profág = E. coli (RP4, φ80) ∆ TcR x TetR ZÁKLADNÍ TYPY MUTACÍ U BAKTÉRIÍ se změnou v morfologii kolonií se změnou citlivosti (k antibiotikům, toxickým látkám, záření, fágům aj.) v požadavcích na růstové faktory (auxotrofní) se změnou v produkci látek (např. pigmentů) supresorsenzitivní (citlivé k supresorům) supresorové (vedoucí ke vzniku supresorů) ovlivňující reparační a rekombinační schopnosti vedoucí ke vzniku mutátorových kmenů se změnou citlivosti k teplotě – vysoké nebo nízké (teplotně senzitivní) Mutace letální x kondicionálně (podmíněně) letální Neschopnost růstu při nízké teplotě Změna struktury esenciálního proteinu Citlivost k chladu Neschopnost růstu při zvýšené teplotě Změna struktury esenciálního proteinu Citlivost k teplotě Růst v přítomnosti fágaZtráta receptoruRezistence k fágu Růst na mediu obsahujícím inhibiční koncentraci antibiotika Zábrana vstupu do buňky, změna cílové molekuly (složky ribozomu), detoxikace antibiotika Rezistence k antibiotiku Nedochází ke změně barvy v mediu obsahujícím cukr a pH indikátor Ztráta enzymu katabolické dráhyZkvašování cukrů Neschopnost růstu na mediu postrádajícím daný růstový faktor Ztráta enzymu biosyntetické dráhyZměna ve výživě Nepravidelné granulární kolonie namísto hladkých lesklých kolonií Ztráta nebo změna lipopolysacharidové vnější vrstvy Drsné kolonie Malé drsné kolonie namísto velkých a hladkých kolonií Ztráta nebo modifikace povrchových kapsulárních struktur Ztráta kapsuly Kompaktní kolonie namísto plochých Ztráta bičíku, nefunkční bičíkZtráta pohyblivosti Detekce mutantPodstata změnyTyp mutace Důležité genotypy: - auxotrofie - suprese - restrikce - lacZ - přítomnost plazmidů - přítomnost profágů - přítomnost Tn a IS - reparace - rekombinace - rezistence k fágům POSTUPY PŘI IZOLACI MUTANT Skríning (vyhledání mutant na základě pozorovatelné změny fenotypu: Růst na indikátorových mediích (utilizace cukrů – tvorba kyselin - změna pH – změna barvy) – podobně jako při odlišování druhů Obohacování (zvyšování počtu mutant) penicilinová metoda. inkorporace radioaktivního prekurzoru (radioaktivní sebevražda). Selekce (růst za podmínek, při nichž roste jen mutant, buňky standardního typu nepřežívají nebo nerostou /pozitivní selekce/, nebo nerostou mutanty, ale buňky standardního typu přežívají /negativní selekce/ - např. rezistence/citlivost k vnějším faktorům Replikování (přenos kolonií na medium s odlišným složením: chybění živin n. růstových faktorů, přítomnost inhibitorů růstu (aminokyseliny, antibiotika, bakteriofágy, aj) IZOLACE MUTANT NA GRADIENTNÍCH PLOTNÁCH antibiotikum 100% 0% 108 102105Počet buněk Prototrofy rostou a tudíž hynou, auxotrofní mutanty nerostou a přežívají (negativní selekce) auxanografie Trp1- Trp2- Trp3- Fenotypy mutant A- a // b B- b // c C- c // d blokáda přeměnyA- B- C- enzymy SCHEMATICKÉ ZNÁZORNĚNÍ POSTUPU PŘI STANOVENÍ NÁSLEDNOSTI REAKCÍ PŘI BIOSYNTÉZE AMINOKYSELIN POMOCÍ AUXOTROFNÍCH MUTANT Prodleva v čase před tím, než je mutace detekovatelná Doba, která je nutná k tomu, aby mutace byla na všech kopiích chromozomu 1 2 3 VZNIK SEKTOROVÝCH KOLONIÍ JAKO DŮSLEDEK SEGREGAČNÍHO LAGU Izolace supresorsenzitivních mutant Tyto mutanty mají nesmyslný kodon v některém z genů. Vyskytují se v množství 1-1,5% mezi mutanty jakéhokoliv znaku. Detekují se tak, že se do mutantů vnese transdukujícím fágem alela supresorového genu (sup-) – lze vnést též na plazmidu. Jestliže se kolonie mutant daného znaku (tj. různých mutant v tomto znaku, nejen sus!) přerazítkují na selektivní plotny s fágem, který obsahuje supresor vyrostou jen ty, které nesou mutaci podmíněnou vznikem nesmyslného kodonu, nikoliv ty, které mají jiný defekt v příslušném genu. Mutace v genu sup (gen pro tRNA) Důkaz: vnesení fága se sus, který na tomto kmeni poroste IZOLACE SUPRESORPOZITIVNÍCH MUTANT (Su+) Důkaz: vnesení fága se Su+, reverze fenotypu mutace reverze Vznik supresorové mutace (Su+) PŘÍKLAD SUPRESOROVÉ MUTACE A JEJÍ DŮKAZ KŘÍŽENÍM supA = mutantní alela genu pro tRNA schopná suprimovat TEORETICKÉ PŘEDPOKLADY FLUKTUAČNÍHO TESTU (LURIA A DELBRÜCK 1943) Pravděpodobnost mutace je velmi nízká, ale stejná pro každou buňku (10-6-10-10 b/generaci) Uvažujeme-li určitou kulturu, pocházejí z jedné buňky, pak na konci kultivace bude počet mutant odrážet dobu, ve které mutace vznikla (tj. ve které generaci). Vzhledem k nízké pravděpodobnosti mutace lze předpokládat, že i počty mutant v jednotlivých klonech budou rozděleny podle Poissonovy řady - to proto, že záleží na generaci, ve které k mutaci došlo. Proto se budou významně lišit počty mutant v jednotlivých kulturách a v kultuře, kde byly buňky pěstovány dohromady. Při fyziologické adaptaci reagují buňky na přítomnost látky v prostředí - to působí jako indukční agens, které indukuje adaptivní odpověď (např. tvorbu enzymů apod). Počet reagujících buněk z různých kultur (klonů) je zhruba stejný. Změna znaku StrS StrR Mutace? Adaptace? Kontrola: důkaz citlivosti výchozí kultury ke streptomycinu Stejný počet buněk Výpočet chi-kvadrátu a stanovení průkaznosti rozdílů Závislost konečného počtu mutant na době, v níž mutace proběhla 1 mutace: celkem 8 kolonií 2 mutace: celkem 6 kolonií Počty rezistentních bakterií z nerozdělené kultury a samostatných kultur Alikvoty z nerozdělené kultury Samostatné kulturyAlikvoty z nerozdělené kultury Samostatné kultury PROVEDENÍ FLUKTUAČNÍHO TESTU Má se rozhodnout, zda rezistence ke streptomycinu je výsledkem adaptace nebo mutace (zda jsou mutanty přítomny v kultuře před vystavením buněk selekčnímu agens nebo se objevují až poté) 1. Ověří se, zda je výchozí kultura citlivá k streptomycinu 2. Řada zkumavek s mediem bez streptomycinu se naočkuje malým a stejným množstvím buněk 3. Stejné množství buněk se naočkuje do Erlenky s objemem, který je součtem objemů v jednotlivých zkumavkách 4. Kultury se ponechají inkubovat 24 hod 5. Kultury se vysejí ve stejném množství na plotny se streptomycinem 6. Vyhodnotí se počty kolonií na jednotlivých plotnách a srovnají se 7. Vypočte se χ2 a stanoví se, zda existují průkazné rozdíly v počtech kolonií na plotnách 8. Průkazný rozdíl v počtu kolonií na plotnách z jednotlivých kultur ve srovnání s počty na plotnách z jedné kultury svědčí o tom, že rezistence ke streptomycinu vznikla mutací. REPARACE MUTAČNĚ POŠKOZENÉ DNA A. Přímé reparace 1. fotoreaktivace 2. dealkylace B. Nepřímé reaparace 1. Excizní reparace bázová nukleotidová řízená metylací 2. rekombinační /postreplikační/ 3. reaparace kroslinků C. Inducibilní reparace 1. SOS-odpověď 2. adaptivní odpovědi na alkylační poškození na environmentální stres Genetický aparát pro reparaci DNA - velmi konzervativní - asi 100 genů - distinktní dráhy, které se mohou prolínat AP-místo Chybná báze Tyminový dimer TYPY REPAROVATELNÝCH POŠKOZENÍ NA DNA Vznik AP míst = nejčastější spontánní mutace (depurinace je 100x častější než depyrimidinace) STÁDIA FOTOREAKTIVACE DNA obsahující dimer Vazba fotolyázy v místě dimeru (6-7 bp) Monomerizace dimeru za přítomnosti světla (365-400 nm) uvolnění fotolyázy FADH2 Folát/deazaflavin fotolýza Zachycení světla Alkyltransferáza: 6O-Metylguanin-DNAmetyltransferáza (6O-MGT= Ada-protein) nemetylovaná forma metylovaná forma Transkripční aktivátor Rozpoznání chybné báze glykozylázou, vznik AP-místa Vyštěpení chybné báze Resyntéza chybějícího úseku, spojení mezery DNA- ligázou Přerušení cukrfosfátových vazeb AP-endonukleázami Odstranění dR s chybějící bází BÁZOVÁ EXCIZNÍ REPARACE DNA-GLYKOZYLÁZY PŮSOBÍCÍ NA POŠKOZENÉ DNA DNA obsahující poškození (T-T, chybný pár bazí aj) NUKLEOTIDOVÁ EXCIZNÍ REPARACE (SHORT PATCH REPAIR) Vazba UvrA2B1 disociace UvrA vytvořeni preincizního komplexu vazba UvrC vytvoření incizního komplexu štěpení cukr-fosfátové kostry vyštěpení krátkého oligonukleotidu o délce 11-13 b resyntéza chybějícího úseku DNA - jako templát slouží řetězec bez poškození spojení mezery DNA-ligázou 4-5b -x-- 8b SOS UvrABC excinukleáza DNA-polI Metylace DNA místně-specifickými metylázami Rodičovská molekula Dceřiné molekuly DNA krátce po replikaci Plně metylované dceřiné molekuly DNA REPARACE ŘÍZENÁ METYLACÍ (REPARACE NA DLOUHOU VZDÁLENOST) A-C A-T UvrD DNA polymeráza III A C MutS rozpozná chybnou bázi a vytvoří smyčku na DNA, na kterou se váže MutL, což umožní navázání a aktivaci MutH, která štěpí G v GATC - poté DNA-helikáza odmotá jednořetězec a ten je nahrazen reparační syntézou POSTREPLIKAČNÍ REKOMBINAČNÍ REPARACE Vznik mezery při syntéze DNA vazba proteinu RecA navození homologního párování neporušeného a porušeného řetězce reparační syntéza DNA podle sesterského řetězce rekombinace homologních řetězců poškození zůstává v jedné z molekul a je opraveno později DNA obsahující cross-link Komplex UvrABC (endonukleáza) rozštěpí cukrfosfátovou kostru na jednom řetězci po obou stranách DNA-polymeráza I rozšíří mezeru svou 5´-3´ exonukleázovou aktivitou Za účasti RecA dojde k výměně řetězců ze sesterského duplexu (rekombinační reparační náhrada) Komplex UvrABC vyštěpí oligonukleotid obsahující cross- link Mezera je zaplněna podobně jako při nukleotidové excizní reparaci (DNA-polI, DNAhelikáza, DNA-ligáza) REPARACE MEZIŘETĚZCOVÝCH SPOJENÍ (CROSS-LINK) Vyštěpený dvouřetězcový fragment 12 bp 9 b 3 b SOS-ODPOVĚĎ geny din = damage induced, SOS-genes (31 genů u E. coli) 1. Indukce SOS mutageneze 2. Excizní reparace dlouhých úseků 3. Zvýšená schopnost reparace ds zlomů 4. Indukce profágů (lambda, P22, f80) 5. Indukce tvorby kolicinů 6. Zmírnění restrikce 7. Inhibice buněčného dělení SOS-odpověd u E. coli Neindukovaný stav: represor LexA se váže na operátory asi 30 SOSgenů a reprimuje jejich expresi Po indukci: ssDNA se váže na RecA za tvorby nukleoproteinového filamenta, které váže LeX a štěpí ho, což vede k expresi SOS-genů PRŮBĚH SOS-REPARACE Slabá exprese všech genů DNA bez poškození Poškození DNA Silná exprese všech genů O = operátor RecA LexA LexA = dimer, podrobující se autokatalytickému štěpení za účasti RecA* (koproteáza) RecA* helikální filament RecA-DNA SOS-MUTAGENEZE (ERROR-PRONE = CHYBY NAVOZUJÍCÍ) - POSLEDNÍ ZÁCHRANA UmuD se působením RecA mění na UmuD´, reakce je však pomalejší než štěpení LexA a proto je přednostně indukována standardní SOS-odpověď - ke štěpení UmuD dochází až při vysoké hladině RecA DNA-polIII vytváří komplex s proteiny UmuC, UmuD a RecA, čímž dochází k inhibici opravy čtení umu = UV-indukovaná mutageneze Mutace fága lambda Regulace SOS-mutageneze u E. coli Před poškozením reprimuje LexA transkripci SOS-genů včetně operonu umuDC Po mírném poškození DNA se RecA váže na ssDNA za tvorby RecAnukleoproteinového filamenta, které se váže na LexA a ten je štěpen – dochází k expresi všech SOS-genů včetně umuDC (trimer UmuD2C) Po vysokém poškození se nahromadí RecA-np filamenta, která pak navodí štěpení UmuD a vytvoří se UmuD´2C. UmuC vázaný na UmuD´2 je mutagenní polymeráza, která je schopná replikovat místa s poškozením za vzniku chyb (vkládá náhodně nukleotidy). TLS = translesion synthesis SCHÉMA SOS MUTAGENEZE Komplex UmuD´2C působí jako mutagenní polymeráza UmuD UmuD´ Silné poškození DNA RecA-ssDNA (RecA*) DNA-polymeráza V + Další mutagenní polymerázy u bakterií Polymeráza IV – produkt genu dinB u E. coli (jeden z SOS genů) - Je příbuzná proteinu UmuC - gen dinB je regulován represorem LexA - při replikaci vytváří chyby i na nepoškozené DNA - vytváří mutace v DNA infikujících fágů lambda untargeted mutagenesis (UTM) Biologická funkce?? – umožňuje replikaci DNA poškozené jinými typy poškození než těmi, která způsobuje UV Ada-protein = alkytransferáza, Alk-proteiny = glykozylázy REGULACE ADAPTIVNÍ ODPOVĚDI K POŠKOZENÍ VYVOLANÉMU ALKYLACÍ aktivátor transkripce aktivace Ada indukující signál Ada CH3 Regulace adaptivní odpovědi V buňce bez poškození se nachází jen několik molekul Ada proteinu. Po poškození DNA alkylační látkou přenáší Ada protein (metylatransferáza) alkylové skupiny z metylovaných fosfátů DNA na aminokyseliny umístěné na N- konci své vlastní molekuly, čímž se konvertuje na transkripční aktivátor (1), nebo přenáší alkylové skupiny z metylovaných bází na aminokyseliny na svém C-konci, což vede k inaktivaci Ada-proteinu (2). Ke vzniku (1) dochází jen při silném poškození DNA, při nízkém poškození jsou pouze odnímány metylové skupiny z bází a protein Ada se inaktivuje. Vystavení E. coli netoxickým koncentracím peroxidu vodíku vede ke zvýšení následné schopnosti korigovat DNA poškození způsobované vyššími dávkami této látky. Adaptace k oxidativnímu stresu je nezávislá jak na alkylačním poškození, tak SOS odpovědi, a nevyžaduje ada, lexA nebo recA proteiny. V přítomnosti peroxidu je indukováno nejméně 30 proteinů ze dvou regulonů. OxyR funguje jako pozitivní regulátor devíti genů, z nichž čtyři byly identifikovány: kataláza/peroxidáza, glutationreduktáza, mangan superoxiddismutáza, a NAD(P)H-dependentní alkylhydroperoxidreduktáza. Regulace adaptivní odpovědi V buňce bez poškození se nachází jen několik molekul Ada proteinu. Po poškození DNA alkylační látkou přenáší Ada protein (metylatransferáza) alkylové skupiny z metylovaných fosfátů DNA na aminokyseliny umístěné na N- konci své vlastní molekuly, čímž se konvertuje na transkripční aktivátor (1), nebo přenáší alkylové skupiny z metylovaných bází na aminokyseliny na svém C-konci, což vede k inaktivaci Ada-proteinu (2). Ke vzniku (1) dochází jen při silném poškození DNA, při nízkém poškození jsou pouze odnímány metylové skupiny z bází a protein Ada se inaktivuje.