TRANSFORMACE = PŘÍJEM EXOGENNÍ
DNA BAKTERIÁLNÍ BUŇKOU
1928: Griffith - Streptococcus pneumoniae - změny
virulence
1944: Avery, MacLeod, McCarty - důkaz
transformující aktivity DNA Streptococcus
pneumoniae
Terminologie
Transformace
-u baktérií: příjem cizorodé exogenní DNA, změna vlastností
-U eukaryot: nádorová transformace
Transfekce
- u bakterií: příjem volné fágové DNA
- U eukaryot: příjem volné DNA, buněčné nebo virové
Přirozená transformace
x
umělá transformace
Rozdíl ve schopnosti
přirozeně navodit stav
kompetence
U přirozené transformace
- rozdíly v příjmu
chromozomové
a plazmidové DNA,
OBECNÉ RYSY PŘIROZENÉ
TRANSFORMACE
Donorová buňka transformující DNA (volná)
Recipientní buňka ve stavu kompetence
příjem DNA a její začlenění do genomu
1. Vazba dsDNA na povrch recipientní buňky
2. Pohyb DNA přes buněčnou stěnu a membránu
3. Degradace jednoho řetězce DNA
4. Translokace druhého řetězce DNA do
cytoplazmy
5. Stabilní začlenění jednořetězcového úseku do
chromozomu homologní rekombinací (RecA+)
Přenos DNA transformací je citlivý k nukleázám (x transdukce, konjugace)
ZÁKLADNÍ KROKY PŘI TRANSFORMACI
Transformující DNA ve volném stavu
+
Kompetentní buňky
Vazba DNA na povrch buňky
Rezistence k DNáze
Vstup DNA do buňky
Začlenění DNA do genomu
Exprese
DONOR
RECIPIENT
Fáze eklipse
HR
Reparační procesy
(křížení dvou kmenů)
R-M
CHARAKTERISTIKA TRANSFORMUJÍCÍ DNA
DNA : chromozomová, plazmidová, fágová (transfekce)
velikost: 0,5 kb až několik desítek kbp
(zhruba 5-10 genů)
dsDNA, nativní stav
konc. 1-10 mg DNA/ml kompetentních buněk
ze 100-200 molekul DNA se inkorporuje jen jedna
u plazmidové a fágové DNA je nutných 10 000 molekul
Počet receptorů na povrchu buněk pro příjem DNA
S. pneumoniae: 80, B. subtilis: 50, H. influenzae: 5
STAV KOMPETENCE - ZNAČNÉ
ROZDÍLY MEZI JEDNOTLIVÝMI DRUHY
výsledek změn v buněčné stěně - syntéza
specifických proteinů
závislost stavu kompetence na fázi
růstového cyklu
závislost na hustotě buněk v populaci
(tvorba feromonů - quorum sensing)
fyziologické faktory - ovlivnění složením
media, teplotou a pH
STAV KOMPETENCE - STREPTOKOKY
vyžadováno kompletní medium
dochází k syntéze faktorů kompetence - asi 16
proteinů (bazické proteiny, nízká m.h., podobají se
fágovým proteinům a reagují s receptory buněčné
membrány pro příjem DNA)
mění se morfologie buněk - dlouhé řetízky
aktivují se autolyziny - částečná lyze buněčné stěny
stav k. trvá jen několik minut, ale šíří se v celé
populaci
(quorum sensing: koordinovaná exprese genů podle
aktuálního lokálního množství bakterií produkujících
signální molekuly) – využití reportérových genů
- S. pneumoniaeINTERVAL KOMPETENCE – S. PNEUMONIAE
NAVOZENÍ KOMPETENCE U B. SUBTILIS
pozdní stacionární fáze
účast Mg++ k aktivaci specifických nukleáz
(17 kD endonukleáza)
zpomalení syntézy DNA (jedna kopie
chromozomu)
syntéza nových polypeptidů (analogy
proteinů pro sporulaci, stres aj)
exprese genů pro reparaci DNA (SOB)
změna fyziologie a morfologie buněk
(změny v sedimentaci)
stav kompetence trvá několik hodin
využití
reportérových
genů
STAV KOMPETENCE - H. INFLUENZAE
regulováno interně, ve vhodném mediu až
100% buněk
blokáda buněčného dělení
tvorba transformazomů a specifických
povrchových proteinů
TRANSPORTNÍ A POMOCNÉ PROTEINY
K překonání buněčné stěny (fyzikální a elektrostatická
bariera) je vyžadován značný počet proteinů. Několik
proteinů má klíčovou úlohu, ostatní jsou pomocné:
A) PSCT proteiny: skupina proteinů úzce spjatá
s povrchovými aktivitami: pilus, sekrece, kompetence a
twitching (trhavý pohyb). Knokaut (Tn) těchto genů vede
k dramatickému snížení transformovatelnosti.
B) Další proteiny patří mezi Com (Bs) a jsou analogické u
různých druhů: ComEA – vazba a transport přes stěnu,
ComG zvyšuje porozitu, a řada dalších interagujících
proteinů (např. Por (periplazmatický protein u Hi), který
je esenciální pro přenos – asi zajišťuje optimální terciární
strukturu některého z faktorů kompetence. Další proteiny
fungují analogicky jako SSB proteiny.
C) Nukleázy – U Bs a Sp – štěpí navázanou DNA, a
nukleáza EndA u Sp štěpí pak jeden řetězec od 5´konce a
ta vstupuje 3´koncem do cytoplazmy.
SYSTÉMY NAVOZOVÁNÍ KOMPETENCE PRO PŘÍJEM
DNA U G+ A G- BAKTERIÍ
B. subtilis
N. gonorrhoeae
G+
G-
Regulace vývoje stavu kompetence pomocí quorum sensing u B. subtilis
Protein ComP (senzor) kontroluje
koncentraci feromonu ComX, po jeho
zachycení se sám fosforyluje a
přenáší fosfát na ComA (proteinregulátor
zprostředkující odpověď) –
fosforylovaný CamA-P působí jako
transkripční aktivátor několika genů
zodpovědných za kompetenci
Feromony pro kompetenci = malé
peptidy sekretované buňkami,
jejichž hladina odpovídá
koncentraci buněk v populaci.
Jsou vytvářeny jako prekurzory,
jako hotové jsou uvolňovány do
prostředí a nařeďovány, takže
vysoké koncentrace je dosaženo
pouze při vysokém počtu buněk.
Transformazomy u H. influenzae
TRANSFORMAZOMY U H. INFLUENZAE
Počet sekvencí na chromozomu = 734+ a 731-;
H. influenzae má 62% AT, takže by se statisticky očekávalo jen 8 míst,
a ne 1465 (sekvence je bohatá na GC).
61% těchto sekvencí se nachází v ORF, každá zhruba na 1 248 bp.
Specifická rozpoznávací sekvence na DNA
AAGTGCGGTCA (USS = uptake signal sequence;
DUS = DNA uptake sequence)
(u N. gonorhoeae: GCCGTCTCAA)
Zvyšování počtu plak
při stejné koncentraci
fágové DNA indikuje
stav kompetence.
Stáří kultury
Počet plak po infekci
buněk fágovými
částicemi se během
růstu kultury výrazně
nemění
Odráží omezený
počet receptorů
na povrchu buňěk
Genetický test pro ověření stavu DNA při transformaci
1. DNA Arg+
je přidána k
recipientním
buňkám Arg-
2. V různých
časových
intervalech je
přidána DNAáza
Časový interval I. 0 min Časový interval II. 2 min. Časový interval III. 15 min
DNA je
extracelulární a je
degradována
DNA je začleněna do
chromozomu a je
dvouřetězcová
DNA v buňce je
jednořetězcová a
nemůže se vázat na
recipientní buňku
3. Extrakce DNA
a její přidání k
buňkám Arg-
Transformanty
nevznikají
Transformanty
nevznikají
Transformanty
Arg+ vznikajíFáze eklipse =časový interval, kdy nelze DNA z povrchu
buněk odmýt ani ji v buňkách prokázat
Denaturovaná
DNA z brzlíku
neovlivňuje
příjem
DNA(PenR),
nativní ano a
snižuje tak
výsledný počet
transformantů
konstantní poměr
Těsně vázané markery M a N
m, n = citlivost k antibiotiku
M, N = rezistence k antibiotiku
Recipient
Donor o fenotypu Mn
Selekce na M
Stejně četné fenotypy
(n a N)
Fenotyp bude vždy N
(alela N nebude nahrazena)
Experimentální stanovení způsobu začlenění
exogenní DNA do genomu recipientní buňky
Fragmenty
DNA z donora
Experimentální důkaz začlenění
jednořetězcového úseku donorové DNA do
chromozomu recipientní buňky
Úsek hybridní DNA
ultracentrifugace
Sekvence
s vysokým
stupněm
homologie
Integrace ssDNA z donorového kmene do
recipientní DNA při transformaci
HE-markery - probíhá oprava ve prospěch donora
LE-markery - probíhá oprava proti donorové DNA
HE = high efficiency, LE = low efficiency
Hex- mutanty S. pneumoniae - defekty v reparaci
- všechny markery se chovají jako HE
heteroduplex ~ Donorová DNA
TRANSFORMACE DIMERNÍMI MOLEKULAMI
PLAZMIDOVÉ DNA
Dva geny se budou přenášet společně, pokud jsou tak blízko sebe,
že mohou být na stejném fragmentu DNA = kotransformace
Kotransformace genů a, b
nebo c s genem x (na
jednom fragmentu DNA)
není možná = geny nejsou
ve vazbě
Kotransformanty a+b+c+ nebo a+b-c+ nevznikají
A
B
A B
A B
A B
Naředění fragmentů DNA
sníží pravděpodobnost,
že buňka přijme
současně fragment A i B
Pokles frekvence kotransformace znaků
A a B je v obou případech odlišný
ZŘEĎOVACÍ TEST NA KOTRANSFORMACI
A a B nevázané
A a B vázané
Separace DNA ultracentrifugací
v CsCl
- replikovaná DNA je hybridní
- posun markeru z lehké DNA
na hybridní DNA odpovídá jeho
vzdálenosti od ori
MAPOVÁNÍ GENŮ U B. SUBTILIS S VYUŽITÍM
TRANSFORMACE
- DNA v prostředí: mořská voda, sedimenty, půda - z buňky uvolňována
při sporulaci nebo při lýzi buněk, ale i při běžné kultivaci
- Množství vysokomolekulární DNA: mikrogramy na 1 gram sedimentů
- Osud DNA: hydrolýza, avšak na nosičích (křemen, jíly, huminové
kyseliny) je chráněna před nukleázami
SCHÉMA PŘENOSU GENŮ VOLNOU DNA
VE VODNÉM PROSTŘEDÍ A V PŮDĚ
BIOLOGICKÉ FUNKCE PŘÍJMU DNA
1. Regulace genové exprese
Např. u neisserií: variace antigenních vlastností:
Exprese pilinových genů je regulována intrachromozomovou
rekombinací mezi silentními pilinovými geny a pilinovým
expresním lokusem nebo integrací silentního genu na
vstupující donorové extrachromozomové DNA (po
autolýze buněk) za tvorby intragenní minikazety
2. Protekce buněk před bakteriofágy
Různé kmeny S. pneumoniae mají RM systémy DpnI a DpnII
kodované alternativními kazetami ve stejném lokusu na
chromozomu. Oba systémy rozpoznávají stejnou cílovou
sekvenci, která se však liší stavem metylace. Fágy
propagované na jednom kmeni jsou restringovány na druhém
a naopak. Transformací DNA z donorového kmene změní
recipientní kmen díky homologní rekombinaci svůj RM
systém.
3. DNA reparace
Vstupující homologická DNA je použita pro rekombinační
reparaci lézí na DNA přítomných na chromozomu
recipienta. Transformace vede ke zvýšenému přežívání
kompetentních (sexuálních) buněk ve srovnání
s nekompetentními (asexuálními) buňkami po ozáření UV
světlem.
4. Zdroj živin a energie
(rozklad DNA extracelulárními nukleázami, příjem složek DNA,
např. nukleotidů specifickými dráhami) –
?? Rozklad jen jednoho řetězce??
BIOLOGICKÉ FUNKCE PŘÍJMU DNA
UMĚLE NAVOZENÁ TRANSFORMACE
A) Transformace u E. coli: Ovlivnění propustnosti buněčné stěny
divalentními ionty (Ca, Mg) a dimetylsulfoxidem - změna integrity a
organizace lipopolysacharidové vrstvy, vystavení buněk nízké teplotě,
hladovění. Vstupující plazmidy zřejmě nejdříve interagují se specifickými
kanály v povrchu stěny buněk (počet kanálů10 do 200). Teplotní šok 42-
45°C indukuje faktory zvyšující kompetenci. Přijímání DNA je
neselektivní, do buněk mohou vstupovat i zcela nepříbuzné
plazmidy.
Účinnost transformace plazmidů je vysoká, chromozomové DNA nízká
(mutace podjednotky D RecBCD-nukleázy zyvšuje účinnost příjmu
lineární chromozomové dsDNA)
B) Transformace zprostředkovaná PEGem. Postup vhodný pro G+,
které nemají přirozenou kompetenci. Bakterie je třeba zbavit
peptidoglykanové vrstvy (enzymy) a pak přenést do osmoticky
stabilizujícího media. Pak se přidá PEG, který fúzuje membrány (fúzogen) a
precipituje DNA. Následuje regenerace buněk na vhodných mediích.
C) Elektroporace (elektrotransformace)
D) Biolistická metoda
Fáze eklipse = doba, kdy nelze DNA z povrchu buněk odmýt ani ji v buňkách prokázat
1. 2.
Modely pro sekreci a příjem DNA při transformaci u G- a G+ bakterií
G+G-G-G-
sekretin