Čipy pro analýzu genomu Jitka Malčíková 15.10.2013 Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie CEITEC MU Logo CMBGT_verze 5 final zakladni_CZ FN Brno_modra_obdelnik Analýza genomových změn §Detekce nebalancovaných genomových změn úamplifikace, delece – CNV – copy number variations úCGH čipy ú §Detekce uniparentální dizomie, genotypizace úSNP čipy ú §Detekce mutací, polymorfismů úResekvenační čipy ú §Analýza epigenetických změn úChIP on chip, čipy pro stanovení metylace, DNAse-chip ú ú nanodrops Výchozí materiál - DNA §Kvantifikace DNA úMěření absorbance nukleotidů A260 úStanovení čistoty A260/A280 – 1.8-2.0 (<1,8 kontaminace proteiny) A260/A230 >2.0 (<2 kontaminace organickými látkami – guanidinium isothiokyanát, alkohol, fenol nebo jinými buněčnými komponentami – karbohydráty. Nanodrop – Malá spotřeba materiálu (1ul) – Plný spektrální rozsah 190–840 nm Nanodrop Pedestal%20Long%20Path Nanodrop Pedestal%20Short%20Path NanodropPedestal%20Loading Výchozí materiál - DNA §Kontrola kvality DNA úElektroforéza CGH - komparativní genomová hybridizace Kohybridizace značené DNA vzorku a kontrolní DNA www.advalytix.com (Beckman Coulter) na sondy navázané na sklíčku úarray CGH na normální metafázní chromozomy úKlasická CGH, HR-CGH úMetoda molekulární cytogenetiky Typy CGH CGH §Klasická CGH (Kallioniemi et al 1992) úRozlišení 5 -10 MB úCitlivost – 50% aberantních buněk ú §HR-CGH – High resolution CGH (Kirchhoff et al. 1998) úPokročilý algoritmus analýzy obrazu úVyšší rozlišení (~3 MB), vyšší citlivost ú §ArrayCGH (aCGH, matrix CGH) (Solinas-Toldo et al. 1997) úVysoké rozlišení – závisí na typu čipu (1kb – 1MB) úCitlivost – 30-40% aberantních buněk CGH_vysledek http://web.ncifcrf.gov (NCI-Frederick) Rozdělení aCGH podle typu sond §Úseky genomové DNA vložené do vektorů úYAC (Yeast Artificial chromosome) - 200 -1000 kb úBAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb úPAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb úKosmidy – 30-40 kb ú §cDNA - 1-2 kb úPouze genové oblasti úHorší schopnost detekce jednokopiových změn ú §Oligonukleotidy - 25-85 bazí ú Rozlišení aCGH §Rozlišení čipu je dáno délkou a hustotou pokrytí DNA sond § úBAC ~ 1Mb úcDNA – 1-2 kb úOligonukleotidy – i pod 1 kb Platformy aCGH §Cílené úAnalýza vybraných „hot spot“ oblastí spojených s konkrétním onemocněním §Chromozómové §Celogenomové úSondy rozmístěné úrovnoměrně po genomu úv určitých intervalech útilling arrays – přesné mapování delecí, translokací Tiling arrays §Tiling = „obklad“ úPřesné mapování s vysokým rozlišením ú ú ú ú ú ú ú úaCGH, resekvenační, ChIP on chip, MeDIP-chip, DNAse-chip ú Agilent CGH ruzna rozdeleni chipu Oligonukleotidové aCGH Agilent úSondy 60 bazí, SurePrint technology – in situ synthesis printing ú úRůzné formáty – vzdálenost sond určuje rozlišení úLidský genom – 1x1M - vzdálenost sond 2,1 kb/1,8 kb v RefSeq genech – 2x400K - vzdálenost sond 5,3 kb/4,6 kb v RefSeq genech – 4x180K - vzdálenost sond 13 kb/11 kb v RefSeq genech – 8x60K - vzdálenost sond 41 kb/33 kb v RefSeq genech úDalší organismy: myš, krysa, kráva, pes, kuře, šimpanz, makak Rhesus, rýže úCustom arrays Oligonukleotidové aCGH Roche NimbleGen úSondy 60 bazí úSpecifické aplikace úCytogenetic Arrays - CGx úCNV Arrays úWhole Genome Tiliinig Arrays úCGH Whole-Genome Exon-Focused Arrays ú úFormáty ú4.2M, 2.1M, 3x1.4M, 3x720K, 6x630x, 12x270x, 12x135K, 385K, 4x72k (Chromosome Tilling) ú úDalší organismy: myš, krysa, kráva, pes, kuře, makak Rhesus, Caenorhabditis elegans, Drosophila, Zebrafish, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Plasmodium falciparum Postup - Agilent 200-500 ng gDNA 50 ng gDNA Výsledky aCGH delece 9p izochromozom 17 Krátká delece mono a bialelická Delece + amplifikace SNP čipy §Čipy umožňující rozlišit nejen CNV, ale i SNP § §SNP – jednonukleotidové polymorfismy úV lidském genomu asi 15 mil identifikovaných polymorfismů úAsociace s onemocněními (Polymorfismus vs mutace) § §Určení alelového statusu, haplotypu úGenotypizace, asociační studie § §Detekce uniparentální dizomie § SNP www.marshall.edu Uniparentální disomie (UPD) mutace monosomie trisomie UPD Normální karyotyp * CNN LOH – copy number neutral loss of heterozygozity úVyskytuje se u řady onemocnění úGerminální vs somatická úHeterodisomie vs isodisomie ú Princip SNP čipů §Sondy pro detekci CNV jako u CGH čipů + sondy speciálně navržené pro detekci SNP §Jednobarevná detekce – na čip se hybridizuje pouze označená testovaná DNA §Vyhodnocení úsrovnání s kontrolní DNA hybridizovanou na druhém čipu úporovnání s daty uloženými v softwaru - soubor kontrolní DNA Affymetrix úSNP6 úDélka sond 25 bazí ú946 000 CNV sond, 906 600 SNP sond úNerovnoměrné rozložení sond – více v genech úVyšší rozlišení pro UPD, vhodné pro genotypizaci úCytoScanHD úDélka sond 49 bazí ú2.6 millionu CNV sond z toho 750,000 "genotype–able" SNPs úVzdálenost sond v genových oblastech 0,4-0,8kb úDetekce oblastí identických původem úStanovení mozaicismu úOnkoScan FFPE úPro degradovanou DNA z parafinových bločků (FFPE – formalin fixed parafin embedded) ú~900 nádorově asociovaných genů úDetekceLOH, CNN LOH + některé somatické mutace Princip SNP čipů - Affymetrix 25b sondy záměna 13. nukleotidu - největší vliv na sílu vazby při neshodě Illumina Bead array úBeadChip úVíce formátů ú4, 12, 24 vzorků na čip ú300 tis - 2,45 mil markerů ú ú Princip SNP čipů - Illumina 2X 50b, allele specific extension 1x 50b, single base extension; pouze A/G, A/C, T/C, T/G (dvoubarevná metoda) T* A* C* G* Infinium HD Bluegnome úCytoSNP - 850K ú24sure – PGS úPreimplantační screening – detekce aneuploidií všech 24 chromosomů ú24sure+ - PGD úPreimplantační genetická diagnostika – screening emryí nositelů reciprokých translokací úDalší specifické úCytochip-focus – špatná kvalita DNA – amniocentéza, odběr chodiových klků úCytoChip Cancer úCytoChip ISCA ú ú Agilent úHuman Genome CGH+SNP Microarrays ú2x400K, 4x180K ú60b, SNPs pouze v místech rozpoznávaných restrikčními endonukleázami Princip SNP čipů - Agilent Postup -SNP6 250 ng gDNA Výsledky SNP arrays – analýza CNV amplifikace + delece + bialelická delece Výsledky SNP arrays – analýza CNV SNP Array → amplifikace + delece Výsledky SNP arrays - uniparentální disomie Výsledky SNP arrays – identifikace oblastí identických původem (stanovení konsanguinity) Výsledky SNP arrays - genotypizace SNP Array → SNP genotyping Využití CGH, SNP čipů §Nádorová genomika úV nádorových buňkách často změny genomu – primární i sekundární §Klinická genetika úPřesnější charakterizace mikrodelečních syndromů úIdentifikace genomových změn u pacientů s mentální retardací i jinými vrozenými postiženími §Farmakogenomika §Prenatální a preimplantační diagnostika §Asociační studie – asociace SNP i CNV s řadou onemocnění (revmatoidní artritida, diabetes, nádorová onemocnění) §Evoluční studie Resekvenační čipy Affymetrix úStejný princip jako detekce SNP úKrátké oligonukleotidy – 25mery úTypizovaná báze na 13. pozici úSNP = testovány 2 varianty X resekvenování = testovány 4 varianty Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix §Sekvenace mnoha kb současně § § § § §Citlivost - 10-25% mutovaných alel ve vzorku §Problematické oblasti – GC bohaté, repetitivní Format 49 100 169 Sequence Capacity 300 kb 100 kb 50 kb Resekvenační čipy - postup 100 long range PCR ~ 5kb Protokol - 3 dny Resekvenační čipy - výstup Nutné ověřit sangerovým sekvenováním Resekvenační čipy APEX úArrayed Primer EXtension úProdloužení sondy o jeden nukleotid komplementární ke vzorku ú4-barevná technologie – nutné speciální vybavení ú Resekvenační čipy - závěr §Paralelní sekvenace více oblastí §Detekce mutací, na které je čip navržen §Screeningová metodika §Komerčně dostupné „diagnostické“ čipy úRoche – platforma Affymetrix úCytochrom P450 – FDA approval, CE-IVD úP53 v testování úNení nutné ověřovat výsledek úJen 1 gen , ale velmi rychlé, „user friendly“ (protokol max 2 dny) úAPEX úDostupné čipy pro konkrétní geny + možný vlastní design úNutné ověřit Sangerovým sekvenováním úResearch use only ú ú ú Epigenomika na čipu §ChIP on chip ú §MeDIP-chip § §DNAse-chip § §Studium regulačních oblastí genomu úNa čipu sondy pro sekvence promotorů, enhancerů, silencerů, responzivních elementů úTilling arrays ChIP on chip §Chromatin immunoprecipitation on chip § §Mapování vazby proteinů na DNA § §Studium vazebných míst transkripčních faktorů,… ChIP-on-chip CHIP on chip MeDIP-chip ú §Methyl-DNA immunoprecipitation § §Detailní mapování metylace celého genomu § §DNA metylována na cytosinu v CG dinukleotidech – regulace genové exprese úImunoprecipitace s protilátkou proti 5-metyl-cytosinu MeDIP-chip MeDIP-chip DNAse-chip § §Mapování míst bez nukleosomů – otevřený chromatin, transkripčně aktivní §Hypersensitivní ke štěpení DNasou I §Po štěpení fragmenty ~1,2kb úPredikce regulačních elementů ú DNAse-chip DNAase Chip ...pokračování příště – 29.10.2013 §Statistické metody u čipových technologií §Boris Tichý § §Využití čipových technologií v onkologii, mimo onkologii §Martin Trbušek