Tkáňové kultury E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 Tkáňové kultury (= TK, Tissue culture - TC) - růst živočišných buněk a tkání in vitro 1885 - ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku 1940 - EARLE, první kontinuálně kultivovaná linie, buňky myší pojivové tkáně, jejím subklonem je dnešní linie L929 Provozování tkáňových kultur spočívá v zajištění optimálních podmínek pro růst a přežívání kultivovaných buněk/tkání! (Pro jednoduchost se dále budou uvažovat jen buňky, problematika tkání a orgánů bude doplněna na závěr.) FYZIKÁLNÍ, CHEMICKÉ a BIOLOGICKÉ faktory, které je třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek. TEPLOTA Buňky se kultivují při optimální teplotě pro organismus, z kterého byly izolovány. Pro buněčné linie odvozené od člověka a běžných laboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37°C. Pro buněčné linie odvozené od poikilotermních živočichů (ryby, hmyz, háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25°C. Na CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejich komponenty) v kterých buňky rostou a plyny, které tato média obklopují případně jsou v nich rozpuštěny. i medu Veškeré komponenty použité pro přípravu médií musí být vysoké kvality, s minimem nežádoucích příměsí (minimální chemická čistota p.a. - pro analýzu) Základem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojem nezbytných iontů, a hrají významnou úlohu v zajištění vhodného pH (optimium většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280-320 mOsmol/L). Nejzákladnější ionty obsažené v médiích jsou: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cľ, S042", P043", HC03". Osmotický tlak je roven koncentracím rozpuštěných iontů/molekul 1 M NaCI = 1 Osm/L Na+ + 1 Osm/L Cľ = 2 Osm/L 1 M CaCU = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cľ = 3 Osm/L 1 M glukosy = 1 Osm/L Esenciální látky pro růst buněk Média musí také obsahovat sacharidy (většinou glukózu, jako zdroj energie), aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky. Většina zejména savčích buněk vyžaduje Insulin (příjem glukózy) Transferin (příjem železa) Selen (nezbytný pro funkci OXidaČně-redukČních enzymů) -takétzv. minimální přídavek do médií Další doplňky Lipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteiny extracelulární matrix, proteiny séra, nukleosidy,... Mnohé z těchto látek jsou suplovány přídavkem séra (5 -10 - 20%), v některých případech i jinými zdroji málo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňky jsou ochranné látky jako 2-(3-merkaptoetanol (snižuje oxidatívni stres a může sloužit i jako zdroj síry) a antibiotika (ochrana proti mikroorganismům případně selekční agens) Základní média v tkáňových kulturách Základem jsou tzv. Earliho soli: chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, síran horečnatý, dihydrogenfosfát sodný B M E WÍth EBSS - základní (basal) médium s Earliho solemi Alfa M E M - alfa modifikované Eaglovo médium D M E M - Dulbekovo MEM, běžné pro adherentní buněčné linie RPMI 1640 - zejména buňky hematopoetického původu IMDM - Iscovovo modifikované Dulbeccovo médium, vhodné pro rychle rostoucí buňky HaiTIOVO F12 - médium bohaté živinami, často v kombinaci 1:1 s DMEM jako základ pro kultury bez séra DMEM - high glucose ayoyl-L-autemln* 221 SOS S.S* L--i glnlno 11 ;.d r-:' <:< 111 ■:■ rl-J ■> 2 11 S4 D.IHI L-Cvdn* 2 HQ S IS SS 0.20 I L-HI :-1dln* 11 yd ■:■ 111 ■:■ rl d * - H ; O 2 ID 42 0.2 L-loolouoln* ISI IDI 0.S02 L-Lnunlnn IS 1 IDE 0.S02 L-LyrJn* ; < lik i lilt ISS I4S 0.7SS L -T.V-111 ■:■ n 1 n ■!■ 141 SO 0.20 I L-F1i«nylalanln« III SS 0.4 L-Bnrlnn IDE 42 0.4 L-Ttirnnnlna 1 IS SS 0.7SS L-Tr,T't'plian 2D4 IS 0.0734 L-TwT'lfnp IS 1 72 0.JSS L-Villni 117 S4 0.S0J Cliolln* ohlorld* 140 4 0.02SS EMIakI'lin pantliona* 477 4 O.OOSSS F0ll« .".('Id 441 4 0.00S07 llidlnimldn 122 4 0.0S2S Pyrldoiln* liydroolilorld* 2D4 4 0.0 ISS FlbnliYln S7S 0.4 0.00 I0S Tlilamln* hydroolilorld* 337 4 D.D11B NnniJ-bl ISO 7.2 D.D4 Calcium Dilurldn (Caai-i Hiuj 147 214 I.I Ftrrlo Nlta* (FifllOSJS'S H2CQ 4*4 0. 1 0.00024S P*qn*dum Sultt* tf\S04-7 H2C0. 244 200 0.313 Fstecdum CHI*rid* (KCn 7i 40 D Z.ii Sodium Hoarbona* (MaHCOS) S4 S700 44,01 Sodium Ctilurldn (MaCI) SS S400 1 10.S4 Sodium Fliooolu* monobaolo ■ Ha H i P-.-4-1 H II4 141 O.S IS EMSuoo :t (»itio ») ISS 4E00 2S - nejčastěji bovinní fetální*, ale i jiné zdroje - lidské, koňské, kozí, myší,... - embryonálí (fetální), novorozenecká, dospělá * fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek) - různé stupně kvality - testy na přítomnost endotoxinů - testy na snášenlivost konkrétním typem buněk - testy na přítomnost virů - různé země původu (USA, Austrálie,...) - různé šarže (lot number) normální x inaktivní sérum - inaktivace séra = 30 (45) minut při 56 °C => inaktivace komplementu atd... Při přípravě médií je pH nastaveno/doladěno HCI (1M) a NaOH (1M). pH v kultuře se mění v důsledku metabolismu buněk, zejména produkcí laktátu a C02 V průběhu kultivace je udržováno: 1) Přítomnými ionty, zejména fosfátovými (z fosforečnanů) 2) Proteiny s pufračními schopnostmi 3) Systémem H2C03 / C02 4) Alternativně silně pufrujícími látkami jako je HEPES, BES, TES K orientační detekci pH média v kultuře slouží fenolová červeň přidávaná do médií. <6 7 <8 PH Pufrační systém H2C03 / C02 (NaHCCg C02 + H20 = H2C03 = H+ + HC03" http://www2.biomed.cas.cz/d331/vade/ph.html Kultivace : otevřená - s výměnou plynů (zejména přísun C02 z vnějšku) uzavřená - bez výměny plynů (používá se ~ 1/4 množství NaHC03) - Při otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s navýšeným obsahem C02, standardně 5% C02 (regulovaný přísun ze zásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častěji spontánním odparem ze zásobníku. V některých speciálních případech je vhodné použít polotekutá až pevná média Takové médium se připraví přídavkem: - Agaru (je třeba dávat pozor na přehřátí složek média během přípravy, teplota by neměla být vyšší jak 40°C) - Metylcelulósv - Fibrinogenu (po aktivaci -> fibrín / fibrinová síť) - je možné použít i čistě syntetické polymery, např. metakrvláty (hydrogely) Trvanlivost a uchování médií a jejich doplňků Idoporučení výrobce - dodavatele! - Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20°C) - Většina složek média (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy,..) je stabilní po dobu jednoho roku při 4°C a tmě - Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je třeba ho přidávat samostatně ze zamražené zásoby. Jeden rok při 4°C se ale ještě považuje za akceptovatelný, možno nahradit médii s Glutamax a pod. - Sérum při 4°C až 2 měsíce, při -20°C až 3 roky - Obecně při teplotách pod -70°C je vše stabilní minimálně 1 rok - Stabilita je závislá na tekutosti / zmrzlosti roztoku, což je ovlivněno složením a koncentrací rozpuštěných komponent. Např. soli a glycerol posouvá bod tuhnutí k nižším teplotám (při -20°C není 10% roztok glycerolu úplně zmrzlý) a DMSO k vyšším teplotám (tuhne už při ~ +6°C) 3iologické faktory - v kultuře roste ještě něco navíc než požadujeme = čistota kultury / sterilita - Jiné buněčné linie (zkreslení výsledků buněčnou specializací, dominance invazní buněčné linie = zánik původní buněčné linie) - Plísně, kvasinky, bakterie (toxiny, vyčerpání média = zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) - Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) 1. PREVENCE + MONITORING! 2. LÉČENÍ PROVOZ - Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor, nevětrá se přímo okny, ale pokud možno přes ventilační systém s filtrací - Pravidelně se provádí úklid a desinfekce povrchů (prostředky na bázi chloru-SAVO, Jodu-Ajatin, 70% EtOH,....) - LTC je periodicky vysvěcována germicidní (širokospektré UV) lampou - Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před vlastní prací si desinfikují ruce příslušnými prostředky (minimálně použití 70% EtOH) - S kulturami se pracuje pokud možnou pouze ve Flow-boxu Čisté materiály se podle své odolnosti / vlastností sterilizují-desinfikují: (čistý z čistých surovin nebo po důkladném omytí speciálními detergenty) autoklávováním (120°C, 20-30 minut) - solné roztoky, některé pufry, agar, želatina/kolagen, některý plastik,., suchým teplem (180°C, 3 až 4h) - sklo, vzácně některý plastik (do 120°C) zářením gama (vzácně i UV - jen povrchy) - plastik, sklo filtrováním - vzduch (HEPA filtry s póry 0,3 jim), roztoky hlavně média a séra běžně přes filtry s póry 0,2 jim) omytím (2-5% aldehydy, 70% EtOH, 2-5% fenol, 5-10% peroxid vodíku,....) - nástroje, pracovní plochy, některý plastik, sklo (celkově může být málo účinné a požkozující čištěný materiál) plamenem -kovy, sklo parami alkylačních činidel - někdy kombinace s autoklávováním (etylén oxid), speciální aplikace jako dekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždy problém pro obsluhu! Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika. Kritéria pro antibiotika: - nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus buněk - musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu - netoxické a bezpečné pro uživatele - kompatibilní s ostatními složkami média - rozpustné v netoxických rozpouštědlech a) Ochranné proti mikroorganismům Nejčastěji penicilin/streptomycin nebo gentamycin, příležitostně tetracykl b) Selekční (viz. Příprava transgenních linií) Neomycin (G418, geneticin), Hygromycin, Puromycin c) Speciální Mitomycin C Antibiotikum likviduje mechanismus účinku mechanismus rezistence Penicilin (samostatně se neužívá.) G+ ISES Penicilin G G+ ISES Ampicilin G+,G- Penicilin/streptomycin G+,G- Pe nic i lin/s t re p t omic i i\í neomycin G+,G- Gentamycin G+, G-, mykoplazmata IP, aminoglykosidové ICinamycin G+, G-, mykoplazmata IP, arninoglykosidové Streptomycin G+,G- IP, aminoglykosidové mutace v genu pro S 12 ribozomálrá protein, inaknVace pros trédroctvím aminoglykosidové transferázy (Podává s e obvykle v kombinaci, kvůli vysokému riziku vzrákti rezistence.) Neomycin G+,G- IP, aminoglykosidové Paromomycin G+, G-, ň. protozoa, omezeně telminti IP, aminoglykosidové Spektinomycin G-, G+ (gonokoky) IP, b akteňostatický účinek s traktu mě podobné aminoglykosidum. mutace v genu pro ribozomální protein S5. Tyl os in Tetracyklin MytomycinC G+, mykoplazmata G+,G-G+,G- IP, makrolidové IP Isynt. DNA ztráta permeability buněčné stěny Polymyxin Amphotericin B (makro lidové) Nystatin G-kvasrnky, plísně kvasinky, plísně Polypeptid s hydrofôbním koncem, který funguje jako kationic ký de terge nt. V azb a na lipid A bakteriálních LPS, vytván póry do cytoplazmaticke membrány vazba na s teroly memb rány hub, vytváří kanály do buněčné membrány vazba na s teroly memb rány hub, vytváří kanály do buněčné membrány Přehled nejčastěji používaných antibiotik G+ ... grampozitivní bakterie G-... gramnegativní bakterie IP ... inhibuje proteosyntézu ISBS ... inhibuje syntézu bakteriální stěny V kultuře nebo v zásobních roztocích něco roste co tam nemá být (plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary, kulovité až vláknité, někdy řetízky) Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na žlutou = pokles pH) Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu Mikroskopické barvení na celkovou DNA (zviditelnění mikroorganismů, zejména endoparaziti) Stanovení specifických antigénu (Imunocytochemie, western blot) Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou Kontrolní kultivací médií samotných nebo po přídavku specifických substrátů Výsledky experimentů nejsou reprodukovatelné / jsou chaotické Buňky jsou citlivější ke stresu LECENI Likvidace zasažené kultury Kombinací antibiotik Kultivací buněk v kompatibilním organismu (např. v břišní dutině = ascites) Mycoplasmata - Běžným VIS mikroskopem prakticky nejsou vidět - Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána) DETEKCE (je třeba kukltivovat bez antibiotik - možné přežívání na pozadí): - Vitální barvení na DNA (Hoechst) - Detekce specifických DNA sekvencí pomocí PCR In situ hybridizace (RNA , DNA) - Měření enzymatické aktivity, systémy s transgenními buňkami (fy. Invivogene, - (Inkorporace uracilu (mycoplasmata) X uridinu (eukaryontní buňky)) ZDROJE: - infikované buňky v TC! - práce se zvířaty v laboratoři TC - pracovníci laboratoř TC LÉČENÍ: - Kombinací antibiotik - Pasážováním buněk v kompatibilním organismu (ascites - volně v břišní dutině) Survival of MG on Various Substances Cotton 4 days Feathers 4 days Rubber 2 days Hair 3 days Straw 2 days Ear 4 hours Shavings 8 hours Nose 1 day Wood lday Skin <4 hours Feed 4 hours Buffer 1 day Viabilita některých druhů mycoplasmat za různých podmínek Investigations into the survival of Mycoplasma galtisepHcum, Mycoplasma synoviae, and Mycoplasma iowae on materials found in the poultry house environment. N.H. Christensen, Christine A. Yavari, A.J. McBain, and Janet M Bradbury, Avian Pathology (1994) 23:127-143. Cotton 2 days Feathers 3 days Rubber 8 hours Hair 8 hours Straw 12 hours Ear 4 hours Shavings 4 hours Nose 12 hours Wood 12 hours Skin 0 hours Feed 0 hours Buffer ■ NT Shimizu, T.( Nagatomo, H>, and Nagahama, K. Zentralblatt fur Bakteriologie (1990), Supplement 20,950-952. Survival oř MG under Various Conditions Sunlight <15 to 120 min UV light 30 - 90 min Well water with 1% serum 7 days Well water 4 - 5 days 50% soil extract 1 - 3 days Dry at 4° C 61 days Dry at 20° C 10 -14 days Survival of MS under Va rious Conditions Sunlight 30 to 120 min UV light 30 - 60 min Well water with 1% serum 1 - 2 days Well water 1 - 2 days 50% soil extract 1 - 2 days Dry at 4° C 51 - 77 days Dry at 20° C 10 - 21 days Obecné schéma léčení buněčných linií v LTK na mycoplasmata Myco plasma-positive Cell Line Secure Mycoplasma-positive Aliquots as Frozen Baclí-up Antibiotic Treatment with BM-Cyclin Quinolone Mycoplasma PCR Testing Mycoplasma-megative Mycoplasma-positi ve Expand Cells, Freeze Master Stnclí. Store in Liquid Nitrogen. Discard Mycu-plaí ma-posit i ve BacJc-ups BM-Cycl iiwesistani Quinolone-resislänl (1) Repeal Treatment of Unhealed Aliquot with BM-Cycl in (2) Treatment of Untreated Aliquot iMlh a Quinolone (1) BM-Cyclin Treatment (2) Treatment of Untreated Aliquot vah another Quinolone f j) Other E lim i nation Method Příklad postupu léčení buněčné kultury na mycoplasmata přípravkem BM-cycIin fy Roche Treatment w w w vv vv Passaging Mycoplasma Testing vv l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l'l' 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Days 1 ti It ílí 1111 Antibiotic-free Medium 1122 1122 1122 Medium with 10 u.g/ml BM-Cyclin 1 or 5 ug/ml BM-Cyclin 2 Účinnost komerčně dostupných antibiotik v léčení kultur napadených mycolpasmaty Uphoff & Drexler 2001 n - počet testovaných buněčných linií Zdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovaná mycoplasmaty (vitální barvení pomocí Hoechst 33258) MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit MycoZap™ Mycoplasma Elimination Reagent Průtokový cytometr / Flow-cytometer (FACS) YM///IIU11 í! ill HERA Inkubátor / termostat s regulací teploty a složení atmosféry Flow-box = laminární box Inverzní mikroskop, nejlépe s fázovým kontrastem (Nomarského -vnitřní struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) - plastické znázornění povrchů) Počítač částic (hemocytometr, Burkrova komůrka, Coulter Counter, FACS,..) Lednice a mrazáky Kontejner s tekutým N2 (-196°C), nebo extrémně hluboko-mrazící box (-150°C a méně) Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor Centrifuga Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický) Automatické pipety Technické zázemí - umývárna, sklad, šatna,... Podle způsobu kultivace - Adherentní (většina, rostou přichyceny k podkladu) - Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu) Podle původu a vlastností - Primokultury Buňky izolované většinou ze zdravé tkáně (obecně zdravý genom, ale většinou omezené možnosti kultivace/dělení buněk) - Permanentní linie Nejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případně ze zdravé tkáně a imortalizované (většina chyby v genomu -> nestabilita, jsou ale nesmrtelné), adaptace na podmínky in vitnolU PROLIFERACE = dělení buněk Hierarchie hematopoézy Hsc £hematopoetická kmenová buňka t MPP CO multipotentní progenitor Myeloid ▼- myeloidní progenitor SP Jf— O MEP ^-? Lymphoid -V 1 1 Stem Cell Mu Hi polent progenitor CMP lymfoidní ! 1 progenitor ~o GMP ▼ T ▼ ▼ ▼ aryocyte T Eosinophil T ^ Neutrophil Basophil ^ ^ CLP Pro-8 Pro-T O O Pre-B i , l * O O O BCell TCell NKCell Committed progenitor Erythrocyte destičky Macrophage Mature cells Dendritic Cell PRIMOKULTURY PERMANENTNÍ LINIE heterogení klon omezená životnost (H.l.) nesmrtelné Většinou náročnější na kultivaci Obecně snadno kultivovatelné variabilita izolací genetická nestabilita BUŇKY NORMÁLNÍ IMORTALIZOVANÉ NÁDOROVÉ diploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidní /polyploidní senescence / Hayflick limit nesmrtelnost nesmrtelnost Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst je nezávislý na kontaktu s posdložkou (anchorage-independent) +++/- specifické růstové faktory +/- specifické růstové faktory +/--- specifické růstové faktory netvoří nádory netvoří nádory tvoří nádory A) Buňky se v kultuře nedělí - je třeba periodicky měnit kultivační médium (terminálne diferencované, postmitotické buňky) B) Buňky se v kultuře dělí = proliferují - je třeba je pasážovat (většina buněk primokultur i permanentních linií) Pasážování - periodické „ředění buněk", obecně spojené i s výměnou média Adherentní linie* - mechanicky nebo enzymatickým štěpením vazeb buňky / substrát; buňka / buňka Enzymy - trypsin, colagenáza,..; inaktivace spec. inhibitory, vyředěním, nadbytkem proteinů (např. sérem) Podpůrné látky - EDTA (zejména vychytávání Ca2+) Suspenzní linie - prostým ředěním * Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu, na kterém rostou. Běžně se používá ošetření 0.01 - 0.1 % roztokem želatiny (prasečí, hovězí) v dH20. Podle potřeby a typu buněk se používají ale i ostatní proteiny ECM. Proliferaci buněk v kultuře charakterizuje růstová křivka s 3 fázemi Stacionární fáze Logaritmická (růstová) fáze Čas Dále je buněčná proliferace charakterizována: Buněčná - denzita - počet buněk na ml nebo cm2 - konfluence - počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2, častěji „%" plochy) Generační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délka buněčného cyklu Doubling time - čas potřebný ke zdvojnásobení buněk v populaci Hayflickm/ limit - v případě většiny primokultur počet možných dělení, buněčně specifické (senescence - stárnutí buněk, „quiescence -klid/spánek buněk") Počítáním buněk - v mikroskopu (Búrkrova komůrka / hemocytometr) - přístroji (Coulter counter - počítač částic, FACS - , průtokový cytometr, potřeba vnitřního standardu) Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku) - Inkorporace 3H thymidinu (měří se přírůstek radioaktivity, celkový, nebo u jednotlivé buňky) - Inkorporace BrdU (bromdeoxyuridinu, analog thymidinu), množství BrdU se stanoví pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce) - Celkové množství DNA v buňce -> stanovení fáze buněčného cyklu G0/G1: 27.9 ± 1.9% 5: 57.8 ±5.1% G2/M: 14.2 ±5.0% —'-■■i "E 2 GO/G1 D43 G2/M 50 100 150 200 250 Prútokový cytometr (Flow-cytometr / FACS) □ Band or Long Paa& Filter Photo Multiplier Tube FL1 n _ 585W2 9DJ10 4SB NM 3lue Laser Beam SpliUet DM 56DEP DM640LP Fluorescence Cc lection Lens Red Diode Laser Focusing Lens 4G2.-10 FSC Diode Přírůstek celkových proteinů - nepoužitelné u buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (ECM) Stanovení enzymatické aktivity (enzymy permanentních metabolických drah) - testy využívající tetrazoliové soli (např. MTT, WST-1), které jsou redukovány na barevné formazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různě citlivé pro jednotlivé enzymatické (oxidačně redukční, NADP) systémy a i vhodné pro různé typy buněk) Stanovení exprese specifických proteinů spřažených s proliferací - imunohistochemicky (jednotlivé buňky) - western blotem (celkově v populaci) (PCNA, Ki-67, cykliny, inhibitory na cyklinech závislých kináz (cyklin-dependentní kinázy),.. Nedílnou součástí sledování proliferační aktivity buněk je i detekce jejich životaschopnosti = viability, která je spojená s buněčnou smrtí = apoptózou, případně s nekrózou Analýza viability a apoptózy MM rul* -»Oj V ^ ' mhochonď changes, f. \ r 1 rr:ui • n patter phological Jt f " ico-ser tí d membrane breakdown * * ^r^ \ normal O^n^raTion Apoplosis miiochonďr 13I rwrpľicfofly preserved nuclear c lunge* intact membranes apoptotic bodies nami condensation ice 11 oitírting} fragmentation secondary necrosis A) Testy založeny na kompaktnosti zdravé buňky a jejím „správném" chování / funkci - Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, ...) - Schopnost vylučovat barviva živými buňkami (eosin, bromfenolovou modř pro detekci ve VIS, propidium iodid pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS) - Enzymatická aktivita, nejčastěji esterázy (fluorescein diacetát pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS, možno kombinovat s propidium iodidem) - U adherentních buněk lze hodnotit počet adherovaných a plovoucích (mrtvých / apoptických buněk - Změny ve struktuře cytoplasmatické membrány -> anexin / fosfatidylseriny B) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrů - Fragmentace DNA (elektroforeticky = tzv. apop. žebříček DNA, in situ = TUNEL test, Comet assay) - Aktivita specifických proteáz = kaspásy, detekce fragmentace substrátů kaspás - Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2 - Kompaktnost mitochondrií (změny v polarizaci m. membrány, vylití cytochromu c) V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme, aby si buňky dlouhodobě zachovali stabilní genotyp i fenotym. Přitom u nádorových linií je udržení stabilního genotypu už z principu problematické. Změny kultivačních podmínek mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií, ale vedou zejména ke změně fenotypu => diferenciaci, a to jak cílené tak náhodné. DIFERENCIACE JE PRAKTICKY VŽDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERAČNÍCH PARAMETRŮ, PŘÍPADNĚ I S APOPTÓZOU. Parametry analýzy diferenciace: - změny v morfologii buněk - změny v expresi genů: detekce specifických mRNA a specifických proteinů (v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy) - funkční testy (fagocyty - fagocytóza; nervy - přenos signálu, depolarizace membrány, produkce mediátorů; svaly - odpověď na stimulus, kontrakce; epitely - produkce mucinů;.....; transplantace a sledování jak se transplantované buňky zapojí do funkce dané tkáně) Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk (M <£> i i SF t SF S+fiA l S SF+FtA / SF serurn-free semm-tree , semrn + RA 1 semm , zztmUtěě +RA 1 semrrWree , Days of differerrtisaion Oj CO 0246246246 SF f SF S+RA J S A í SF SF+RA f S f■ ■(■;a f SF semrn-free =; semm +RA serum ^ setwi + RA serum-free t_ semm-ťree +RA ^emm-ŕree + RA serwn-free ^ tfi a> 2 » i ■y to N-CAM Cytokeratin Endo-A : í Ž í í Li_ + + U_ II to o> to o) to T—- - ^ 6 days c Non-differentiated SFÍSF S-tfíAfS S-tftAISF ii SF*tRA / S SF-«fíAŕSF I ^Hb^'''-'^í I i RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů neuroektoderm entoderm Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk ♦ buněčná jádra ♦ cytokeratin EndoA pozitivní buňky - entoderm ♦ N-CAM pozitivní buňky - neurony A) Tkáňová banka nebo darem např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com) B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů Izolace nádoru, jeho enzymatická disociace na buněčnou suspenzi, kultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonů a jejich charakterizace v průběhu kultivace -> linie musí vykazovat dostatečnou stabilitu v průběhu kultivace, aby byla zachována reprodukovatelnost výsledků. Popis nově získané linie by měl obsahovat co nejvíce její chrakteristik. Původ (typ nádoru, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího ustanovení, charakterizace fenotypu i genotypu,..) C) Příprava primokultur z živočišných tkání Příprava myších embryonálních fibroblastů MEF - mouse embryonic fibroblast PEF - primordial embryonic fibroblast Připravují se nejčastěji z 13.5 denních embryí (11-13.5 dpc.) Gravidní samice se usmrtí a vypreparuje se děloha s embryi Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány Zbytek embrya se enzymaticky a mechanicky rozruší a po odstraněn kompaktních zbytků, se suspenze vyseje na kultivační misku Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují (-6-15 pasáží ~ 24-60 dnů, Hayflick limit) Příprava stromálních buněk kostní dřeně BMSC - bone marow stromal celis Vypreparujeme stehenní kost, odstřihneme hlavice a propláchneme (např. injekční stříkačkou) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky (lze i kost navrtat a odsát (např. injekční stříkačkou) = možné autotransplantace). Po 24 hodinách kultivace odstraníme médium se zbylými krevními elementy opláchneme a přidáme nové médium. Stromální buňky postupně vytváří nepravidelné kolonie fibroblastům podobných buněk Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny w« f™ Pozn. potkaní a lidské rostou lépe jak myší # li Příprava myších ES buněk ES - embryonic stem, embryonální kmenové Linie ES buněk na feederu MEF Homogenní populace ES buněk Permanentní kultivace - selekce buněk s odlišnými vlastnostmi než měly ty původní - časově a finančně náročné • Empiricky je za stabilní považováno 10-30 pasáží v závislosti na buněčné linii a i na kultivačních podmínkách. • Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) než primokultury (zde ale nevýhoda Hayflickova limitu). • Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsou známy kultivační podmínky, kdy dlouhodobě (> 100 pasáží) v zásadě nemění své vlastnosti. Obecně v kultivačním médiu a) se zvýšeným obsahem séra (20-100%) b) se sérem (10-20-50%) s přídavkem DMSO (5-10%) c) vzácně se sérem (10-20-50%) a přídavkem glycerolu (10%) Buňky je třeba zchlazovat postupně na ~ -80°C, poté se přenesou do ultra-hlubokomrazícího boxu (~ -185°C) nebo do tekutého N2 (-196°C) k trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysoké koncentrace buněk ~ >107 buněk na ml média. Postupné zchlazování - V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího boxu (~ -80°C), teplota klesá rychlostí ~ 1°C za 1 minutu - Zanořováním do par N2 - V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do hlubokomrazícího boxu, po 3 hodinách k trvalému uchování - V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20°C), pak na 3 hodiny do hlubokomrazícího boxu, následně k trvalému uchování Rozmrazování buněk Buňky je třeba rychle převést z hlubokého zamražení (~ 190°C) na kultivační teplotu, opláchnout zamražovací médium (centrifugací) a vyset k další kultivaci. Druhý den po vysetí je vhodné vyměnit kultivační médium za nové a odstranit tak zbytky buněk, které zamražení/rozmražení nepřežily. Kryo-zkumavky V zamraženém stavu v tekutém N2 (v termosce, lokální přeprava) V zamraženém stavu v isolačním boxu se suchým ledem (C02) (na velké vzdálenosti, zásilkové společnosti mývají i službu s doplňováním suchého ledu) Živé v kultuře, v kultivační nádobce s nadbytkem média (v závislosti na buněčném typu 1 - 3 dny) Tkáně (s výjimkou krve) se přepravují podchlazené (ne zmrzlé) ve výživných médiích, často s kryo-protektivy Fyzikální metody - Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur - Centrifugace (G0/G1 buňky jsou nejlehčí) a) v gradientu b) elutrace (centrifugace s protiproudem média) - FACS, sortrování pomocí flow-cytometru - Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání) Chemické metody - Deprivace růstovými faktory (sérem) - Deprivace odstraněním iso-leucinu z média - Deprivace Ca2+ - Přídavek hydroxyurei, inhibice RNA syntésy -> blok DNA syntézy - Dvojitý thymidinový blok - Mitotické jedy, inhibují reorganizaci mikrotubulů / dělícího vřeténka (kolchicin, kolcemid, nocodazol, ...) - zejména zviditelnění chromozomů, karyotipyzace Srovnání synchronizace v buněčném cyklu deprivací sérem (A) a kontaktní inhibicí (B) Serum Deprivation t = o h t = 24 h Contact Inhibition t = 18 h Příklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací sérem myší fibroblasty linie NIH/3T3 Serum withdrawal Serum addition i—Ae hrs^--Í-i—I—I—I ' ' 0 4 7 9 1 H-h Hours after 2 18 24 30 serum stimulation 12 18 24 G, G, hJ\l G. í Princip dvojitého bloku přídavkem nadbytku thymidinu - nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu A s B TdR 16 hr DNA SYNTHESIS Release 9 hr TdR 1 & hr MITOTIC INDEX 8 10 12 proximal Elutriation_ Boundary Elutrační kyveta / hylzna - separace buněk pomocí protiproudého gradientu na speciální centrifuze - elutrátoru distal Současná kultivace více buněčných typů - Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem - Vhodné mechanické vlastnosti podkladu atd. V případě přímého kontaktu odlišení buněk na základě jejich vlastností - Exprese specifických proteinových markem na povrchu buněk - Selekce díky expresi nějakého proteinu (enzymu, fluoreskujících proteinů,.. - Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomycinem C,..) Pokud je třeba maximálně minimalizovat riziko vzájemné kontaminace - Buňky v kultuře jsou odděleny polopropustnými membránami - chemickými faktory: NiCI, NiS04, Dimethylsulphate, N-methyl-N-nitrosouera (MNU), benzo[a]pyrene diol epoxide, 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) - biologickými faktory: viry - virus Epstein Barrové, virus myší leukémie, virus Rousova sarkomu, SV40 vektory (plasmidy / viry) exprimujícími transformující protein, např. antigen SV40 large T nebo adenovirus E1A,.. Cílené genetické manipulace Změny genetické informace, vložením, poškozením nebo vypnutím - Vektory plasmidové a virové - Chemicky nebo fyzikálně - viz. imortalizace Nhe\ a) Infekcí-viry b) Chemicky lipofekce: obalení vektoru s lipidy a fúze komplexu s cytoplasmatickou membránou Ca2+ precipitace: vysrážení vektoru na povrchu buněk v komplexu s Ca2+ a jeho pohlcení buňkou endocytózou transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený diethylaminoethylem je endocytován do buňky transferofekce: vektor je navázán na transferin a přes transferinový receptor endocytován do buňky c) Mikroinjikace d) Elektroporace - narušení buněčné membrány elektrickým výbojem a difúze vektoru do buňky e) Nucleofekce - elektroporace v kombinaci s chemií, přenos vektoru do jádra f) Biolisticky - vektor navázaný na partikuli (zlato, wolfram) je vstřelen do tkáně, buněk Adherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízké účinnosti transfekce nebo jejich konfluenci tvoří samostatné kolonie, které lze mechanicky, případně za pomoci proteáz (trypsin, kolagenáza) oddělit Suspenzní buňky pod selekčním antibiotikem je třeba rozklonovat mezním ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růst v polotekutém / viskózním médiu (agar apod.) Nejběžnější selekční antibiotika pro savčí buňky G418 / Neomycin, Hygromycin B, Puromycin Tkáně umíme kultivovat / připravovat jen velice omezeně, většinou jde pouze o uchování po určitou dobu, podobně jako orgány. U orgánů je již aktuální otázka přívodu živin, kyslíku a odvodu metabolitů a C02. Orgány je tedy třeba mít metabolický utlumeny (podchlazením) a nebo napojeny na oběh s živinami simulující krevní zásobení. V současné době je zvládnutá problematika krve (lze zamrazit), částečně pak epidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněk pankretu (Langernhansových ostrůvků) z prasat. Velkým příslibem pro transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk. Epidermis - primokultury prasečích / lidských keratinocytů pěstované na syntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis po popáleninách apod. Částečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocyty jsou vysety do reaktoru na rozvodné potrubí z polopropustných membrán. Celý takový bioreaktor pak připomíná skutečná játra s krevní oběhem a odvodem žluči. Hepatocyty se však zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobému uskladnění a tak využití podle potřeby. Doporučená literatura: Lesko, J. a kol.: Práce s tkanivovými kulturami, Bratislava, Vydavatelstvo slovenskej akademie ved 1975, s. 212. X X Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Uvod do molekulární biologie buňky. Ustí nad Labem, Espero Publishing 1998, 630 s. Alberts, B. a kol.: Molekular biology of the cell. New York & London, Garland Publishing, Inc. 1994, 1294 s. Spector, D. L. a kol.: Cells. A laboratory manual. Volumes 1, 2, 3. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998, 3 197 s. Cellis, J. E. a kol.: Cell Biology. A laboratory handbook. San Diego, London, Academic Press Inc. 1994, Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 1832 s. Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc. 1995, 728 s.