Komplementové metody metody využívající faktu aktivace komplementového systému komplexem – antigen-protilátka, KFR • •Složky reakce: Ab, Ag, C, ERY, hemolyzin •· Ab- vyšetřované sérum •- chceme v něm prokázat protilátku / komplement v séru je tepelně inaktivován / •· známý specifický Ag •- jsou-li v séru Ab, vytvoří se imunokomplex IK • •· KOMPLEMENT - zdrojem nejčastěji sérum morčete (váže se na IK a aktivuje protilátku) •hemolytický komplex: komplex Ag /beraní ERY/ a protilátky ~ EMBOCEPTORu /hemolyzinu/, získaného imunizací králičího séra beraními erytrocyty ®aby došlo k hemolýze je nutná spoluúčast KOMPLEMENTU a inkubace 30 minut při 30 °C ® KFR •průběh reakce: •* POZITIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru je Ab •protilátka v séru vytvoří komplex s Ag – na něj se naváže komplement. Po přidání hemolytického systému nezbývá již komplement do 2. části reakce •® k hemolýze NEDOJDE: •* NEGATIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru není Ab •- v 1. fázi reakce se nevytvoří IK – komplement se nevyváže a zbývá do 2. fáze reakce, kdy aktivuje hemolyzin •® DOJDE k hemolýze: • KFR •- velmi záleží na množství komplementu – každý vzorek se musí titrovat, aby bylo množství komplementu konstantní •- použití: •· diagnostika příjice /syfilis/, bruceózy, pasteurely •· ve virologii průkaz protilátek téměř všech virových nákaz •· typizace neznámých Ag nově izolovaných virů •· průkaz protiorgánových Ab • Vyšetření komplementového systému •a) Stanovují se hladiny jednotlivých složek K v séru – • za pomoci antisér, většinou proti C3, C4, C1q •b) Celková aktivita komplementové kaskády-se provádí testem CH50 – (50% hemolýza způsobená komplementem), stupeň hemolýzy závisí na množství přidaného K, nepřímá úměra, hemolýza - spektrofotometrie •Využití: K detekci poruch nedostatečnéh mn. Nebo defektů složek K systému •Reakční směs: •2%nálev krvinek, Ab(hemolyzin), C komerční (vyšetřované sérum) •Výsledek: lýze buněk, vyčeření • • Principy metodik Ag+Ag=IK, CIK, DIK 1. Využívající fyz – chem vlastností – CIK- největší makromolekuly séra mohou být preciptovány pomocí PEG (polyetylénglykol). Precipitát je úměrný mn. cirkulujících CIK Vyšetření cirkulujících a deponovaných IK •Principy metodik •Ag+Ag=IK, CIK, DIK •1. Využívající fyz – chem vlastností – CIK- největší makromolekuly séra mohou být preciptovány pomocí PEG (polyetylénglykol). Precipitát je úměrný mn. cirkulujících CIK • Vyšetření CIK •2. CIK na sebe váží C1 – C3 složky K. V první fázi se odstraní nenavázaný C1q. V druhé fázi se stanoví koncentrace C1q, jež odráží i hladinu CIK (totéž pro C3,C4) •3. průkaz vazbou na buňky, které exprimují receptor pro Fc gragment IgG. Lze využít trombocyty, Žírné b., fygocyty •Využití: Pro monitoring jakýchkoliv zánětlivých procesů. Pro diagnostiku imunokomplexových chorob je důležitější průkaz IK deponovaných v tkáních. To se provádí po bioptickém odběru vzorku z tkáně (kůže, svaly, ledviny) pomocí přímé fluorescence se prokazuje uložení IgG Zákalové reakce metoda probíhající v roztoku •Princip: při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množstvím mn. Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag F4k46-o494 *NEFELOMETRIE – rozptyl monochrom. světla měřeného pod úhlem, měří se intenzita záblesků světla odraženého od IK (Tyndal. efekt), výbojka nebo laser TURBIDIMETRIE – úbytek monochrom. světla o 320nm při průchodu vzorkem v kyvetě měřeného ve stejné rovině Výhoda: možnost automatizace, rychlost provedení, přesnost, ale vyšší cena, dioda, méně přesná •Využití: Stanovení c Ig, hlavních sérových proteinů, stanovení sérových bílk.(složky C, proteiny akut. fáze (CRP – stand. 2mg/l, transferin, alfa2 – makroglobulin) •Úskalí: V prec. křivce je třeba vymezit oblasti: •a)zóna využitelná pro měření, tj oblast nadbytku Ab •b)Kritický bod, oblast ekvivalence, zde leží nejvyšší konc. Ag, kterou lze ještě měřit • •c)oblast za krit. bodem, zde nelze měřit •Dva režimy stanovení a)End point – měří se v prostředí polyetylénglykolu b)Rate kynetický systém – měří se kineticky , v krátkých časových intervalech Imunoblotting •SOUTHERN BLOTTING • vyvinut v r. 1970, k detekci DNA, molekuly DNA se přenášejí z agarózového gelu na membránu k nalezení části sekvence DNA či konkrétního genu v genomu •NORTHERN BLOTTING •slouží k detekci RNA •přenos nám umožňuje zjistit přítomnost, nepřítomnost a relativní množství specifických RNA sekvencí •WESTERN BLOTTING •slouží k detekci bílkovin •touto metodou dokážeme najít jednu bílkovinu v množství jiných, přičemž určit i délku daného proteinu •je závislá na použití velmi kvalitních Ab zaměřených na vybranou bílkovinu •Podstatou blottingu: izolovaná látka (obvykle separovaná) se přenáší na membránu. • •Podle typu přenosu se bloty liší: •Difůzní blotting: v přenosovém pufru •Vakuový blotting: přenos pomocí vakua •Kapilární blotting: přenos kapilárními silami přes filtrační papír •Tankový elektroblotting: k přenosu využito el. pole (2-3l pufru), na boku nádoby - elektrody •„Semi dry“ blotting: využití plošných elektrod (100 ml) •Kapkovací dot blotting: bílkoviny nejsou rozseparovány – imobilizace jednotlivých vzorků • • •Používané membrány: •Nylonová – elektrostatická interakce •PVDF (polyvinylen difluoridová) – hydrofilní interakce •Nitrocelulosová – hydrofilní interakce • •WESTERN BLOT •3 kroky: •1. SDS PAGE (gradientová elektroforéza) •2. BLOTTING •3. IMUNODETEKCE SDS PAGE Nejpoužívanější metodou je PAGE – SDS elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (sodium dodecyl sulphate). Umožňuje následné určení relativních molekulových hmotností jednotlivých proteinových frakcí. Polyakrylamidové gely se připravují kopolymerací polymerů – akrylamidu a N,N’–methylen-bis-akrylamidu (BISu). Polymerací akrylamidu vznikají dlouhé řetězce polymerů, zařazení BISu způsobuje zesílení „můstky“, které vznikají z bifunkčních zbytků BISu. Vytvořená polyakrylamidová matice nese elektrický náboj a je chemicky dost inertní. Pro stanovení Mr se používá SDS detergent. - SDS – sodium dodecylsulfát – TENZID, váže se v poměru 1,4 g SDS/ 1 g bílkoviny ® udílí bílkovinám UNIFORMNÍ náboj, její vlastní náboj pozbude významu a dělení může probíhat podle velikosti molekul. •WESTERN BLOTTING •Blotovacím zařízením pro semi-dry blotting přeneseme rozdělené proteiny pomocí el. proudu. •Sestavíme blotovací zařízení pro semi-dry blotting •Na grafitovou elektrodu umístníme filtr. Papíry navlhčené transferovým pufrem, pak nitrocelulózovou membránu, gel s proteiny a další navhčené filtr. Papíry •Přiložíme elektrody a zapojíme ke zdroji Molekula určitého proteinu postupuje v gelu až do momentu, kdy velikost pórů je menší než velikost molekuly a ta se v tomto místě gelu „zasekne“. Použitím směsi standardních bílkovin se známou Mr a po sestrojení kalibrační křivky je možné vypočítat Mr jednotlivých frakcí WB •IMUNODETEKCE •Z membrány odřízneme sjezd s proteinovými standardy a obarvíme amidočerní, propláchneme v prom. roztoku •Inkubace s primární protilátkou v blokov. roztoku •a následně se sekundární protilátkou v blokovacím roztoku. •Promyjeme a vložíme do substrátového roztoku, dokud se neobjeví bandy (barví se proteiny) •Vyvolávání ukončíme namočením membrán do vodovodní vody, • • •