Speciální seminář z biologie
nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
FN Brno, PřF a LF MU Brno
MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.
MOÚ Brno, PřF MU Brno
2013
Seminář 5
Angiogeneze, apoptóza,
metastázování
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
FN Brno, PřF a LF MU Brno
MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.
MOÚ Brno, LF a PřF Brno
Apoptóza
Některé znaky: kondenzace buňky a jádra, kondenzace chromatinu,
fragmentace jádra a rozpad buňky na apoptotická tělíska, nenahodilá
fragmentace DNA (žebřík na ELFO), uvolňování specifických faktorů z
mitochondrií do cytoplasmy, aktivace kaskád kaspáz, ..
z přednášky Molekulární biologie nádoru
Měření apoptózy
• FCM fyzikálních změn (změna velikosti jádra, DNA
content)
• TUNEL (TdT navazuje na konce DSB dUTP* )
• Annexin V (váže se na fosfatidylserin, který je při
apoptóze externalizován)
• Exprese TTG – tkáňové transglutaminázy
• Aktivní (štěpená) forma Caspase 8,9,3
• Štěpné produkty účinků kaspáz (M30 – fragmenty CK
18)
Morfologický obraz apoptózy
• Apoptotická buňka
• Úklidová reakce histiocytů/makrofágů
– „Starry sky“ pattern – obraz hvězdného
nebe
– Absence ostatních buněk zánětu
Burkitův lymfom: typický obraz
„hvězdného nebe“
• Buňky jsou
vysoce mitoticky
i apoptoticky
aktivní (Ki67pozitivní,
BCL2–
negativní)
• Makrofágy
s fagocytovanými
apoptotickými
tělísky mohou
tvořit obraz
„hvězdného
nebe“.
BCL2: B-cell leukemia/lymphoma 2
• První apoptotický gen objevený v savčích buňkách díky své roli v
maligní přeměně B-buněk. Objeven v r. 1984 (Tsujimoto) jako
produkt translokace t(14;18) u b. linie B-ALL
• Poprvé popsána nová třída proto-onkogenů: ne aktivátory
buněčné proliferace, ale represory buněčné smrti.
• Folikulární lymfomy (+cca 30% DLBCL) často nesou translokaci
t(14;18), ta vede k vysoké expresi bcl-2
Bcl-2 jako diagnostický nástroj
• Folikulární lymfom – pomáhá v diff dg oproti
folikulární hyperplázii – morfologicky podobné
obrazy
• Burkittův lymfom – masivní apoptotická
aktivita (starry sky), negativní průkaz bcl-2
• Oba lymfomy vycházejí ze stejného
diferenciačního stádia B lymfocytů (buňky
folikulárního centra) – rozdílná cesta
explozivní proliferace vs. kumulativního
přežívání
Detekce přestavby t(14;18)
Dual-color, Dual Fusion Translocation Probe
Výsledek hybridizace:
•Negativní buňky: dva zelené a dva
oranžové signály (2G + 2O)
•Pozitivní buňky s reciprokou translokací
t(14;18): jeden oranžový, jeden zelený,
dva fúzní (1O + 1G + 2F)
Vývoj B lymfocytů
(1) Prekurzory B lymfocytů vznikají dělením pluripotentní hematopoietické
kmenové buňky v kostní dřeni, kde - bez přítomnosti antigenu - probíhá
první část vyzrávání B lymfocytů. Dochází k přeskupování genových
segmentů – V(D)J rekombinaci - nejdříve těžkých a pak lehkých řetězců.
Nezralé B lymfocyty pak exprimují na svém povrchu přeskupený receptor a
prodělávají selekční procesy: testována je autoimunita a schopnost přežít v
periferních lymfatických tkáních.
Jares P et al. 2007, Nature Rev Cancer 7: 750-762; Jana Koptíková
Úloha germinálního cetra v diferenciaci B
lymfocytu
Klein U and Dall-Favera R. 2008, Nature Rev Immunol 8: 22-33, Jana Koptíková
• Tmavá zóna GC je tvořena rychle se dělícími centroblasty, u kterých dochází k somatickým
hypermutacím. Spojeno s intenzivní proliferací.
• Proliferující B lymfocyty vytlačují klidové buňky na periferii foliklu, kde tvoří tzv. plášťovou
zónu.
• Světlá zóna je tvořena nedělícími se centrocyty, u kterých dochází k izotypovému přepnutí.
Vznikají paměťové a plazmatické buňky. Spojeno s masivní apoptózou a diferenciací.
Exprese povrchových molekul B
lymfocytů v průběhu jejich vyzrávání
Pavelka Karel. 2007, Remedia 17: 440-447
Úloha germinálního cetra v diferenciaci
B lymfocytu
Klein U and Dall-Favera R. 2008, Nature Rev Immunol 8: 22-33
Pro diferenciaci antigenem aktivovaných B buněk jsou typické:
•výrazná proliferace
•snížená citlivost na poškození DNA (SHM, CSR)
•aktivní telomeráza
•silná vnímavost k apoptóze
Poškození DNA vznikající v
germinálních centrech
• Chyby v procesech
somatických hypermutací
(SHM) a izotypového
přepnutí (CSR), které jsou
fyziologicky cíleny na
imunoglobulinové řetězce,
mohou:
• způsobit hypermutace nebo
translokace některých
protoonkogenů (BCL6, cmyc,
BCL2, CCND1, NF-κB a
dalších) a
• být příčinou vývoje
některých nehodgkinských
lymfomů.
Klein U and Dall-Favera R. 2008, Nature Rev Immunol 8: 22-33
Chyby v SHM a CSR vedou k vývoji
lymfomů
• Burkittův lymfom: t(8;14) ⇒
↑ c-myc
• Folikulární lymfom: t(14;18)
⇒ ↑ BCL2
• Lymfom z buněk plášťové
zóny: t(11;14) ⇒ ↑ cyklin D1
• Difúzní velkobuněčný lymfom
B buněk: aberace BCL6, NFκB,
PRDM1, c-myc, …
• Lymfoplasmacytoidní lymfom:
t(9;14) ⇒ ↑PAX5
Klein U and Dall-Favera R. 2008, Nature Rev Immunol 8: 22-33
B-CLL
MCL
(IgH-CCND1)
Přesahy: double-edged sword
∼∼∼∼ advanatge with liability
Výhoda
1011 různých protilátek
liability: přítěž, břímě,
překážka, odpovědnost,
závazek, náchylnost, povinnost,…
Nevýhoda
riziko lymfomů
Lymfomy se dvěma zásahy (DHL)
• „Double-hit lymphomas“: Původně označení B lymfomů, které nesou
zároveň přestavbu genu c-myc a genu BCL2; obecněji označení pro
lymfomy s násobnými primárními genetickými změnami (c-myc plus další
změna/změny – včetně triple-hit a quadruple-hit).
• Specifická skupina onemocnění s charakteristickým klinickým chováním:
agresivní, rezistentní ke standardní terapii, s rizikem brzkého relapsu.
(WHO 2008: BCLU – B-cell lymphoma, unclasifiable)
• Medián přežití odhadován mezi 4,5 a 18,5 měsíci, tedy výrazně kratší
než BL a (IPI-) odpovídající DLBCL.
• Velmi pravděpodobně v současnosti podhodnocená (co do výskytu)
skupina – možná více než 10 (14)% high-grade lymfomů.
Lindsley RC and LaCasce AS. 2012, Curr Opin Hematol 19: 299-
304
Kazuistika
• muž/53let (J.B. nar. 1959)
• 22.8.2012 probatorní biopsie infiltrátu mezenteria při explorativní
laparotomii na Chirurgickém oddělení Městské nemocnici
Hustopeče (MUDr. Podskalan)
• klinická diagnóza: Sarkoma radicis mesenterii inoper.
generalisatum
• diagnostikován (1. čtení) v Bioptické a cytologické laboratoři MDgK
plus spol. s r.o. Újezd u Brna, prim. MUDr. Jarmila Klusáková, Ph.D.,
předběžný závěr: lymfom
• září 2012 – 2. čtení: ÚPA FN Brno Bohunice
MUDr. Podskalan, MUDr. J. Klusáková, Ph.D.
Výsledky ÚPA FN Brno Bohunice
Morfologické a imunofenotypické znaky mezi BL a DLBCL:
•morfologicky: četné mitózy a apoptózy, proliferační aktivita dle
Ki67 90-100%, obraz hvězdného nebe (BL), populace nádorových
buněk ale polymorfnější a morfologicky odpovídá více DLBCL: buňky
středně velké a velké, často s vezikulárními jádry s prominujícími
nukleoly
•IHC: GC fenotyp (CD10+, BCL6-) a silná difuzní pozitivita BCL2
•závěr: neklasifikovatelný agresivní lymfom s rysy DLBCL a BL,
nutné zvážit double-hit lymfom
•LMP - FISH: t(14;18), t(8;14), 8q24
MUDr. M. Moulis
Naše výsledky
MUDr. M. Moulis
eosin hematoxylin: středně
velké a velké buňky
centroblastického vzhledu;
úsekovitě naznačen obraz
hvězdného nebe
Ki67: proliferační aktivita
extrémně vysoká, 95-100%
BCL2: difuzně pozitivní CD79a: difuzně silně pozitivní
Naše výsledky
MUDr. M. Moulis
Výsledky LMP: FISH t(14;18)
• t(14;18)(q32;q21) – IgH/BCL2 („dual fusion translocation probe“)
• Výsledek: 77% jader s translokací, tj. pozitivní ⇒ vysoká exprese BCL2
K. Lišková, R. Hrabálková
c-myc a Burkittův lymfom
• Téměř všechny případy BL
souvisí s translokací genu c-myc
(chromozom 8) buď s genem
pro těžký imunoglobulinový
řetězec µ (chromozom 14) nebo
lehký řetězec κ nebo λ
(chromozomy 2 a 22).
• 80% případů BL má translokaci
t(8;14)(q24;q32).
• Případů s translokacemi
t(2;8)(p11;q24) a
t(8;22)(q24;q11) je asi po 10%.
Výsledky LMP: FISH t(8;14)
• t(8;14)(q24;q32) – IgH/MYC („dual fusion translocation probe“)
• Výsledek: 1% jader s translokací, tj. negativní
K. Lišková, R. Hrabálková
Naše výsledky: FISH 8q24
• 8q24 – přestavba genu c-myc („break apart rearrangement probe“)
• Výsledek: 28% jader s translokací, tj. pozitivní ⇒ vysoká exprese c-Myc
K. Lišková, R. Hrabálková
←
• Většina DH lymfomů jsou de novo případy bez předchozí historie
indolentního lymfomu. 15-20% DH lymfomů je diagnostikovaných u
pacientů s předchozím indolentním onemocněním, nejčastěji folikulárním
lymfomem.
• V literatuře detailně dokumentovány případy s ohnisky (high-grade)
„Burkitt-like“ (DH) lymfomu na pozadí histologicky (low-grade)
folikulárního lymfomu.
Náš výsledek:
t(14;18)(q32;q21) - negativní (77% jader s translokací)
8q24 – pozitivní (28% jader s translokací)
Lymfomy se dvěma zásahy
Hwang YY et al. 2011, Diagn Pathol 6: 63; Kobayashi H et al. 2011, Int J Hematol 93: 112
Lymfomy se dvěma zásahy
• U Burkittova lymfomu je přestavba c-myc primární genetickou změnou,
obvykle není doprovázena dalšími chromozomálními aberacemi.
Translokace t(8;14) je nejčastější přestavbou c-myc, představuje 80%
případů BL.
• U double-hit lymfomů se má za to, že přestavba c-myc je sekundární,
vznikající na podkladě již existující primární změny a relativně vysoké,
časté chromozomální komplexity. Odpovídá tomu i mnohem častější
výskyt přestavby c-myc s genem pro lehký imunoglobulinový řetězec
nebo s jiným, neimunoglobulinovým genem.
Náš výsledek:
t(8;14)(q24;q32) - negativní (1% jader s translokací)
8q24 – pozitivní (28% jader s translokací)
Lindsley RC and LaCasce AS. 2012, Curr Opin Hematol 19: 299-
304
Lymfomy se dvěma zásahy
Aukema SM et al. 2011, Blood 117: 2319-2331
• Většina přestaveb c-myc je
zprostředkována AICDA ve zralých B
buňkách (E).
• Zlomy BCL2 a CCND1 jsou
pravděpodobně zprostředkovány
RAG1/2 v prekurzorových B buňkách (A,
B).
• ⇒ Přestavby MYC/8q24 jsou sekundární
zásahy u případů s přestavbami
BCL2/18q21 nebo CCND1/11q13 (C, D).
• Načasování zásahů u DHL BCL6+/MYC+ a
BCL3+/MYC+ je méně jasné, protože
přestavby těchto genů
zprostředkovávají stejné mechanismy
(F).
Onkogeny zapojené do vývoje
lymfomů
MYC, BCL2, CCND1 (BCL1)
BCL6
•lokalizován v pozici 3q27
•exprimován v mnoha tkáních, ale u B buněk omezen na buňky GC,
nutný pro vytvoření GC
•transkripční represor mnoha genů účastnících se apoptózy,
odpovědi na poškození DNA, regulace buněčného cyklu, proliferace
a diferenciace; cílové geny např. BCL2, p53, IRF4
•„vypnutím p53“ umožňuje somatické hypermutace a izotypové
přepnutí (tj. rekombinace), také „non-Ig genů“ (včetně sebe)
•aberace BCL6: hypermutace, translokace - 50% s Ig lokusem, 50%
jiní partneři
•translokace BCL6 u asi 30-40% DLBCL, některých FL, MALT
Onkogeny zapojené do vývoje
lymfomů
MYC, BCL2, CCND1 (BCL1), BCL6
BCL3
•lokalizován v pozici 19q13
•člen rodiny IκB
•vyšší exprese ve zralých než nezralých B buňkách
•účastní se vytváření GC
•translokace t(14;19) se vyskytuje u řady leukémií a lymfomů
z přednášky Molekulární biologie nádoru
Angiogeneze
Angiogeneze v bioptické
diagnostice
• Součást „stromální reakce“ – odezvy a
remodelace mikroprostředí
• Specifický „vascular pattern“
– Myxoidní liposarkom
– Endometriální stromální sarkom
– Haemangiopericytom
– G3, G4 gliomy (mozkové nádory)
– Endokrinní nádory
Kvantifikace angiogeneze
• Exprese VEGF / VEGFR (IHC, ELISA)
• Měření vaskulární denzity
– Počet cév na jednotku plochy
– Poměr plochy cév k celkové ploše tumoru
Angiogeneze vs. angioinvaze
• Angiogeneze – novotvorba cév (uvnitř tumoru a v jeho
bezprostředním okolí) – pod vlivem proangiogenních faktorů –
obecný znak nádorů, zejména ale nikoli výhradně maligních (např.
v okolí prekanceróz)
• Angioinvaze – vrůstání nádorových buněk do lumen cév – znak
výhradně maligních nádorů, klinicky významný faktor svědčící pro
vysokou pravděpodobnost metastatického rozsevu. Uvádí se při
histologickém vyšetření malignit a je součástí TNM klasifikace
některých typů tumorů (např. ledviny, testes)
Angioinvaze – nádorový čep invaduje stěnu lymfatické kapiláry
a šíří se v jejím lumen (immunohistochemicky znázorněny endothelie
lymfatické cévy, protilátka anti-podoplanin - D2.40)
Angiogenic and lymphangiogenic microvessel density in breast carcinoma: correlation
with clinicopathologic parameters and VEGF-family gene expression
Modern Pathology (2005)
Microvessel density was assessed microscopically and by image cytometry, and was
compared with tumor histology, grade, stage, lymph node metastasis, hormone
receptors, HER2/neu status, and expression of VEGF, VEGF-C and VEGF-D by
immunohistochemistry or quantitative RT-PCR. Strong correlation was observed between
visual and image cytometric microvessel density using D2-40 but not CD31 (P=0.016 and
0.1521, respectively). Image cytometric CD31 microvessel density correlated with
tumor size, grade, stage and lymph node metastasis (P=0.0001, 0.0107, 0.0035 and
0.0395, respectively). D2-40 microvessel density correlated with tumor stage
(P=0.0123 by image cytometry) and lymph node metastasis (P=0.0558 by
microscopy). Immunohistochemical VEGF signal in peritumoral blood vessels correlated
with image cytometric CD31 and D2-40 microvessel density (P=0.022 and 0.0012,
respectively), consistent with the role of VEGF in blood and lymphatic vascular growth.
Intratumoral VEGF-C and VEGF-D expression by quantitative RT-PCR correlated with
D2-40 (P=0.0291 by image cytometry) but not with CD31 microvessel density, which
could suggest a selective role of VEGF-C and VEGF-D in lymphangiogenesis. CD31 and
D2-40 microvessel density correlated significantly with several prognostic factors,
including lymph node metastasis. Thus, measurements of angiogenesis and
lymphangiogenesis may have utility for breast cancer pathology, particularly for
estimation of metastatic risk.
Metastatická kaskáda
z přednášky Molekulární biologie nádoru
Sentinelová lymfatická uzlina (SLU)
• Koncept SLU je založen na teorii, že invaze nádoru do první
uzliny ve svodném lymfatickém povodí předurčuje nádorový stav
celého povodí.
• Pokud tedy není metastáza zjištěna v první uzlině, je bez
metastáz i celé regionální lymfatické povodí.
• Pokud je první uzlina metastatická, je nutná radikální disekce
uzlin.
⇒ Celkový stav uzlin je možno určit excizí jediné z nich. Lze tak
předejít zbytečné radikální excizi uzlin (např. u ca prsu až 70%
případů)
• Poprvé popsáno 1960 u karcinomu parotidy.
• Identifikace SLU pomocí injikace kontrastní látky (radioaktivní
indikátory, patentní modř).
Co je to sentinelová uzlina?
• První mízní uzlina, která drenuje mízu z
ložiska nádoru.
• Nemusí být nejbližší.
• Může jich být více než jedna.
Sentinelová uzlina
SNB
Vyhledání SNB – radioaktivně
značený albumin a patentní
modř
Vyšetření SNB
Smysl vyšetření SNB
• Ušetřit pacientku dissekce axilárních
uzlin…
• …a tím dlouhodobých následků,
především lymfedému.
Smysl vyšetření SNB
• Správně rozpoznat metastazující
onemocnění.
– Indikována dissekce axily (chrání před
recidivou v axile).
– Metastazující karcinom prsu nutně vyžaduje
chemoterapii (chrání před vzdálenými
metastázami).
Velikost metastáz v SNB
• Už od jednotlivých nádorových buněk!
– ITC – isolated tumor cells
• Jednotlivé buňky nebo klastry buněk do 0,2mm,
bez známek invazivního růstu, obvykle v
periferním splavu uzliny.
– Mikrometastáza 0,2mm – 2,0mm
– Makrometastáza >2,0mm
• Klinický význam
– Stran lokální recidivy
– Stran celkového přežití
Makroskopický obraz excidovaného kožního melanomu
a sentinelové uzliny, materiály zbarveny patentní modří
(Mikro) metastázy
Mikrometastáza melanomu v sentinelové uzlině – v HE a
po imunoreakci s protilátkou proti HMB-45
Imunohistologie - melanA
Ne všechno je vidět v HE
Kompletně vyšetřená uzlina
Algoritmus vyšetření SNB
• ČAS / PŘESNOST
• A) peroperačně (20 minut)
– zatíženo falešnou negativitou, zejména v případě malých
metastatických lolžisek
• B) klasicky (3 dny)
– nutnost druhé operace (příjem do nemocnice, anestezie…)
• C) kombinace
– Kompletní včetně IHC metod – zcela vyjímečný postup
– Makroskopické posouzení + peroperační histologie – zachytí
velké metastázy (většina), u malých meta se v současné době
v definovaných případech ustupuje od další operace
Děkujeme za pozornost