CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 1/7 ÚLOHA Č.2 – STANOVENÍ ENZYMŮ (studenti pracují ve dvojicích) A) URČENÍ JATERNÍCH ENZYMŮ – ALT, AST Poruchy metabolismu jater se projevují ve změnách koncentrací některých nízkomolekulárních látek (typicky bilirubinu) v krevním séru a zejména hladin některých enzymů. Bilirubin, který se tvoří v RES převážně z hemoglobinu, je špatně rozpustný, a proto je tělními tekutinami transportován do jater vázaný na albumin (nekonjugovaný bilirubin). V buňkách jaterního parenchymu se na jednu nebo obě propionové kyseliny bilirubinu váže kys. glukuronová - tzv. konjugovaný bilirubin. Kromě obvyklé reversibilní vazby se může bilirubin vázat na albumin kovalentně ( -bilirubin), který koluje v organismu, dokud nedojde k vyloučení samotného albuminového nosiče z organismu. Obsah konjugovaného bilirubinu se zvyšuje zejména při závažných chorobách jater (ikterus), zvýšená hladina nekonjugovaného bilirubinu je známkou zvýšené hemolýzy. -glutamyltransferasa (GGT, GMT) je enzym vázaný na membrány, typický pro orgány parenchymového typu – vyskytuje se zejména v ledvinách, pankreatu a játrech. Pro klinickou praxi má význam prakticky jen enzym z jater a žlučových cest, které mají charakter cholestase (např. obstrukce žlučových cest); je to jeden z hlavních ukazatelů požití alkoholu. Aminotransferasy (transaminasy) ALT (GPT) i AST (GOT) jsou velmi důležité pro diagnostiku jaterních nemocí. Aktivita AST v séru bývá zvýšena i při jiných chorobách zejména při infarktu myokardu. Z poměru aktivit ALT a AST je možné usuzovat i na hloubku poškození orgánů – ALT je cytoplazmatický enzym, zatímco AST je lokalizován v cytoplazmě a zčásti v mitochondriích. Úkol: Stanovte aktivity obou enzymů (ALT, AST) ve vzorku pomocí komerčních kitů (před vlastním stanovením si řádně přečtěte přiložené návody). Do protokolu uveďte princip stanovení, jakým kitem bylo stanovení provedeno, tabulku naměřených hodnot, všechny výpočty, fyziologické hodnoty a hodnoty deklarované pro CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 2/7 kontrolní sérum. Okomentujte naměřené výsledky ve vztahu k fyziologickým a deklarovaným hodnotám a přesnost vlastní práce. CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 3/7 B) STANOVENÍ ENZYMOVÉ AKTIVITY ALKALICKÉ FOSFATASY Alkalická fosfatasa v séru pochází především z kostní tkáně (osteoblastů) a mikrosomů jaterních buněk, její aktivita v séru stoupá v důsledků nemocí těchto orgánů. Jako jeden z mála enzymů je alkalická fosfatasa vylučována žlučí do trávicího traktu, její zvýšená hladina v séru tedy může indikovat sníženou průchodnost žlučových cest (cholestasis). Aktivita tohoto enzymu se určuje nejčastěji na základě jeho schopnosti štěpit syntetický substrát p-nitrofenylfosfát, produkt p-nitrofenol má intenzivní žluté zbarvení. Úkoly: Změřte aktivitu alkalické fosfatasy několika níže uvedenými způsoby, současně posuďte vliv aktivátoru a inhibitoru. Reagencie: roztok 1: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát v glycinovém pufru roztok 2: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 1 mM MgSO4 v glycinovém pufru roztok 3: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 0.1 M KH2PO4 v glycinovém pufru 1. Dvoubodové stanovení Postupujte podle následujícího schématu: Po promíchání změřte absorbanci proti blanku při 400 nm. Současně proveďte stanovení s aktivátorem – Mg2+ ionty (roztok 2) a inhibitorem – fosfátem (roztok 3). Vypočtěte aktivitu alkalické fosfatasy v katalech, jestliže extinkční koeficient = 18.8 mM–1 .cm–1 . Posuďte vliv inhibitoru a aktivátoru. blank 1. vzorek neznámého séra 2. vzorek nez. séra (s aktivátorem) 3. vzorek nez. séra (s inhibitorem) Vzorek kontrolního séra Roztok substrátu 1ml roztoku 1 1ml roztoku 1 1ml roztoku 2 1ml roztoku 3 1ml roztoku 1 sérum - 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml kontrolního séra Inkubace 30 – 45 minut při laboratorní teplotě. 0,02 M NaOH 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml neznámé sérum 0,2ml - - - - CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 4/7 Do protokolu uveďte princip stanovení (rovnici reakce), jakým kitem bylo stanovení provedeno, tabulku naměřených hodnot, všechny výpočty, fyziologické hodnoty a hodnoty deklarované pro kontrolní sérum. Okomentujte naměřené výsledky ve vztahu k fyziologickým a deklarovaným hodnotám a přesnost vlastní práce. CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 5/7 C) IZOENZYMY LAKTÁTDEHYDROGENASY (LD) Pro diferenciální diagnostiku poruch různých orgánů má velký význam posouzení aktivit některých orgánově selektivních enzymů a zejména izoenzymů. V této úloze je demonstrován jeden z přístupů používaný při analýze izoenzymového spektra v krevním séru – při stanovení laktátdehydrogenasy (LD, LDH) je využito odlišné substrátové specifity izoenzymů. V jiných případech lze využít např. specifické inhibice jednoho izoenzymu protilátkou (kreatinkinasa). Tetramer LD vytváří 5 izoenzymů kombinací dvou typů podjednotek H (heart) a M (muscle): LD1 (H4), LD2 (H3M), LD3 (H2M2), LD4 (H3M) a LD5 (M4). K separaci a kvantifikaci jednotlivých izoenzymů se používají elektroforesa, ionexová chromatografie, resp. imunoprecipitace; jinou možností je právě využití různé substrátové specifity těchto izoenzymů. Distribuce izoenzymů v krevním séru: LD1 18-33 %, LD2 28-40 %, LD3 18-30 %, LD4 6-16 % a LD5 2-13 %. Izoenzym LD1 je vedle laktátu schopen poměrně účinně oxidovat i 2-oxobutyrát ( hydroxybutyrát), chová se tedy jako -hydroxybutyrátdehydrogenasa (HBD). Tento izoenzym se vyskytuje především v srdeční tkáni, jeho stanovení má hlavní význam při diagnostice infarktu myokardu. V játrech a plících je tohoto izoenzymu poměrně málo, nezanedbatelné aktivity však lze najít i v kosterním svalstvu, ledvinách a erytrocytech. Úkoly: a) Stanovení celkové aktivity LD v séru Proveďte stanovení celkové aktivity LD pomocí komerčního kitu (před vlastním stanovením si řádně přečtěte přiložený návod). b) Stanovení HBD v séru Proveďte stanovení aktivity HBD pomocí komerčního kitu (před vlastním stanovením si řádně přečtěte přiložený návod). Vyhodnoťte podíl izoenzymu LD1 na celkové aktivitě LD ve vašem vzorku. CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 6/7 Do protokolu uveďte princip stanovení (rovnici reakce), jakým kitem bylo stanovení provedeno, tabulku naměřených hodnot, všechny výpočty, fyziologické hodnoty a hodnoty deklarované pro kontrolní sérum. Okomentujte naměřené výsledky ve vztahu k fyziologickým a deklarovaným hodnotám a přesnost vlastní práce. Závěr: Do protokolu stručně shrňte všechny výsledky z tohoto cvičení. CVIČENÍ Z KLINICKÉ BIOCHEMIE ____________________________________ 7/7 Doplňující otázky: Co vyjadřuje Warburgův optický test? Vyjádři i rovnicí. (2 body) Co znamená „dvoubodové stanovení“ u stanovení enzymů? (2 body) Co vyjadřuje 1 katal? (1 bod)