ÚLOHA Č.4: IMUNOCHEMICKÉ METODY
(studenti pracují ve skupinách)
A) IMUNODOTTING
Imunodotting je analytická metoda využívaná pro detekci specifických proteinů ve směsi,
např. ve vzorku homogenátu tkáně či jiného biologického materiálu. Samotná detekce probíhá
na povrchu membrány (nejčastěji nitrocelulosové) pomocí specifických protilátek.
V prvních krocích dochází k nanesení směsi proteinů (v kapkách) na membránu, na které je
po jejich vazbě nutné všechna volná vazebná místa zablokovat. To se provádí pomocí
blokovacího pufru (obvykle zředěný roztok proteinů, které neinteragují s protilátkou), který
znemožní nespecifickou vazbu protilátky na prázdný povrch membrány, a tedy získání falešně
pozitivního výsledku. Následnou inkubací membrány se specifickými (primárními)
protilátkami dochází ke tvorbě imunokomplexů, které lze detekovat dvojím způsobem:
1. za použití další (sekundární) protilátky - protilátky proti celé škále primárních protilátek,
která je konjugována s enzymem (nejčastěji křenovou peroxidasou, HRP),
2. za použití primární protilátky, která je již konjugována s enzymem, umožňující
jednokrokovou detekci vzniklého imunokomplexu.
Komplex je zviditelněn enzymovou reakcí, při které dochází po přídavku substrátu (v případě
HRP se jedná o H2O2) ke vzniku barevného produktu.
Úkol: Pomocí metody immunodotting stanovte proteiny s oligohistidinovou kotvou
v buněčném lyzátu
Roztoky:
TBS pufr: 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH=7,6
Blokovací pufr: 4 % sušené netučné mléko v TBS
Barvící roztok: PONCEAU S
Roztok anti-oligohistidinových protilátek (ředění 1: 2000 v TBS pufru)
Roztok substrátu: 4-chloro-1-naftol (3 mg/ml methanolu) v TBS pufru
DOTTING
V mikrotitrační destičce geometrickou řadou nařeďte:
Vzorek č. 1 - buněčný lyzát E. Coli obsahující rekombinantní protein CV-IIL
s oligohistidinovou kotvou a Vzorek č. 2 – prostý buněčný lyzát E. Coli.
Od druhé jamky dále si nachystejte po 25 μl TBS pufru. Do první jamky pipetujte 50 μl Vzorku
č. 1 a pokračujte v ředění 25 μl z první jamky do 25 μl TBS pufru ve druhé jamce, promíchat a
z druhé jamky přenést 25 μl do třetí jamky, atd. …
Na 2 nitrocelulosové membrány pipetujte (po 5 μl) jednotlivé vzorky vzniklé ředěním Vzorku
č. 1. Vedle pipetujte vzorky vzniklé ředěním Vzorku č. 2. Jako negativní kontrolu napipetujte
5 μl Vzorku č. 3 (BSA).
První membránu použijte pro stanovení všech proteinů pomocí barvy PONCEAU S. Druhou
membránu použijte pro specifickou imunochemickou detekci rekombinačního proteinu CVIIL
s oligohistidinovou kotvou.
1) Barvení bílkovin
Nitrocelulosovou membránu promyjte 3x destilovanou vodou a vložte ji do roztoku
PONCEAU S na 5 minut. Pozadí odbarvěte 3x promytím v 3% kyselině octové.
2) Imunodetekce
Blokovaní
Membránu s nanesenými vzorky vložte do blokovacího roztoku a nechte míchat 15 minut.
Inkubace s protilátkou
Promyjte membránu 3x TBS pufrem a následně vložte membránu do roztoku protilátek a
nechte inkubovat za stálého míchání 1 hodinu. Membrána musí být plně ponořena do roztoku
protilátky. Po 1 hodině promyjte 3x TBS pufrem.
Detekce komplexu antigen-protilátka enzymatickou reakcí (křenová peroxidasa)
Připravte detekční směs:
5 ml methanolického roztoku 4-chloro-1-naftolu doplňte do 30 ml TBS pufrem. přidejte 20 μl
H2O2.
Vložte membránu do detekční směsi a nechte vyvíjet. Modré zbarvení by se mělo objevit do 5
minut.
Do protokolu uveďte princip imunodottingu, fotku membrán s popisem a zhodnocením
výsledku barvení a imunodottingu. Výsledek zdůvodněte.
B) IMUNOTURBIDIMETRIE
Kromě absorbce může při průchodu světla vzorkem, pokud jde o disperzní nebo koloidní
soustavu, docházet i k jeho rozptylování. Tohoto jevu se využívá v optické metodě zvané
turbidimetrie - optická metoda spočívající v měření procházejícího světla zeslabeného
difúzním rozptylem na částicích (zákalu), při které se měří intenzita světla procházejícího
vzorkem v původním směru paprsku. Naopak nefelometrie je optická metoda založena na
měření intenzity rozptýleného světla na dispergovaných částicích. Rozptýlené (Tyndallovo)
světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru
dopadajícího záření.
Turbidimetrické měření lze uskutečnit pomocí obvyklého fotometrického vybavení a úbytek
světla rozptylem při průchodu vzorkem se dá snadno popsat pomocí absorbance a dalších
veličin obvyklých ve fotometrii. Množství rozptýleného světla závisí na koncentraci a
velikosti částic a také na vlnové délce světla.
Turbidimetrie se nejčastěji využívá v imunochemických metodách k vyhodnocování
imunoprecipitačních reakcí, při kterých zákal tvoří imunitní komplexy vytvořené interakcí
specifických protilátek s antigenem – analytem.
Matematický popis zákalu (turbidity) - T - lze vyjádřit rovnicí:
T= (1/b).ln(Io/I),
kde b je tlouštka kyvety (odpovídá l – délce optické dráhy), Io počáteční intenzita světelného
paprsku, I intenzita paprsku po průchodu suspensí částic (imunitních komplexů).
Transferin
Transferin, nebo-li siderofilin, je bílkovina krevní plazmy, která váže a přenáší železo v
krevním oběhu do míst, kde je ho potřeba. Tento -glykoprotein je vytvářen v játrech a může
vázat dva atomy Fe3+
, čímž zajišťuje, že se tento prvek nevyskytuje v plazmě ve volné formě.
Za fyziologických podmínek je kapacita transferinu nasycena asi z 1/3, zbytek se nazývá
volná vazebná kapacita séra pro železo, která je k dispozici pro transport železa při zvýšených
požadavcích. Zvýšená hodnota transferinu se vyskytuje během těhotenství a při užívání
hormonální antikoncepce. Zpravidla klesá s věkem.
Fyziologické hodnoty
Muži, Ženy: 1,69 - 3,09 g/l
Snížená hodnota může indikovat
přebytek železa v organismu (hemochromatóza, hemosideróza)
anémii u dlouhodobých chorob a nádorových onemocnění
dlouhodobé jaterní choroby (porucha tvorby bílkovin v játrech)
nefrotický syndrom (onemocnění ledvin, které způsobuje ztráty bílkovin močí)
atransferinémii (dědičná porucha tvorby transferinu)
podvýživu (malnutrice)
akutní zánět (transferin patří mezi tzv. negativní proteiny akutní fáze, tzn., že
organismus reaguje na přítomnost zánětu v těle snížením jeho hladiny)
Zvýšená hodnota může indikovat
nedostatek železa v organismu
chudokrevnost z nedostatku železa
zvýšený rozpad červených krvinek
akutní zánět jater, aktivní cirhóza jater
nadměrný přívod železa (opakované transfúze)
alkoholismus
Úkol: Stanovte koncentraci transferinu ve vzorku pomocí komerčního kitu.
Před vlastním stanovením si řádně přečtěte přiložený návod.
Činidla:
Roztok 1: 35 mM imidazolový pufr pH 7; 4 % PEG, 150 mM NaCl
Roztok 2: 2 % kozí antisérum proti lidskému transferinu v 50 mM pufru HEPES pH 7,4; 9
mM EDTA
Kalibrační roztok: krevní sérum obsahující certifikovanou koncentraci lidského transferinu o
koncentraci 7g/l.
Použijte tento postup měření:
Vlnová délka 340 nm.
Měřte:
Vzorek Standard Reagent blank
Standard - 6 μl Vzorek
6 μl - Destilovaná
voda - - 6 μl
Činidlo 1 750 μl 750 μl 750 μl
Promíchá se a inkubuje 5 minut při 37ºC. Poté se odečte absorbance A1.
Činidlo 2 210 μl 210 μl 210 μl
Promíchá se a inkubuje 5 minut při 37ºC. Poté se odečte absorbance A2.
Do protokolu uveďte princip imunoturbidimetrie, jakým kitem bylo stanovení provedeno,
tabulku naměřených hodnot a graf kalibrační závislosti absorbance na koncentraci transferinu.
Okomentujte naměřené výsledky a přesnost vlastní práce.
C) IMUNOPRECIPITACE (hemaglutinace - stanovení krevních skupin AB0)
V současnosti se rozlišuje 32 systémů lidských krevních skupin. Nejznámější jsou
systémy AB0, Rh. Krevní skupiny AB0 systému jako první objevil vídeňský lékař Karl
Landsteiner v roce 1900 (identifikoval pouze 3 krevní skupiny). Všechny čtyři krevní skupiny
(A, B, AB, 0) popsal v roce 1907 český psychiatr Jan Janský. Krevní typy (skupiny) se v AB0
systému určují podle antigenů (látek vyvolávajících imunitní odpověď) přítomných na
povrchu červených krvinek. Tyto antigeny se nazývají aglutinogeny (shlukovatelné), podle
schopnosti aglutinovat (shlukovat) erytrocyty. Protilátky, přirozeně se tvořící proti těmto
aglutinogenům, se nazývají aglutininy (shlukující).
Antigeny AB0 jsou komplexní oligosacharidy, které se vyskytují na membránách
erytrocytů ve formě glykosfingolipidů a v sekretech jsou tytéž oligosacharidy přítomny ve
formě glykoproteinů. Specifickou povahu AB0 antigenů určuje terminální cukerné reziduum,
které představuje imunodeterminantu antigenu.
Prekurzorem pro biosyntézu antigenů A a B je antigen H (odpovídá krevní skupině 0),
který vzniká připojením L-fukosy (6-deoxy-L-galaktosy) vazbou α1-2 na terminální galaktosu
oligosacharidového řetězce pomocí enzymu fukosyltransferasy (kódovaná H lokusem na
chromozomu 19).
Gen AB0 lokovaný na chromozomu 9 má tři typy alel - dvě kodominantní (IA
a IB
) a
třetí recesivní (i). Alela IA
kóduje enzym N-acetylgalaktosaminyltransferasu, která připojuje
N-acetyl-D-galaktosamin na galaktosu antigenu H. Alela IB
se liší od alely IA
substitucí 4
nukleotidů a kóduje enzym galaktosyltransferasu, která připojuje na antigen H D-galaktosu.
Jedinci s krevním typem 0 mají v tomto genu deleci (posun čtecího rámce), proto
syntetizují inaktivní enzym.
Krevní
skupina
Typ aglutinogenů
(antigenů) přítomných
na povrchu ery
Typ aglutininů
(protilátek)
přítomných v plasmě
Typ krve, který
budou tyto
aglutininy srážet
Genotyp
A A anti-B B, AB IA
IA
, IA
i
B B anti-A A, AB IB
IB
, IB
i
AB AB - -
(univerzální
příjemce)
IA
IB
0 - (H)
(univerzální dárce)
anti-A
anti-B
A, B, AB ii
Druhým nejdůležitějším krevním systémem je Rh systém, který byl pojmenován
podle makaků Macaca mulatta (anglicky Rhesus Macaque), u kterých byl v roce 1940
objeven Karlem Landsteinerem a Alexanderem Weinerem Tento systém 50-ti antigenů
zahrnuje pět nejvýznamnějších – antigen C, antigen c, antigen D, antigen E, antigen e.
Nejsilnější – antigen D, se nazývá Rh faktor. Jedná se o integrální protein, a jestliže je
přítomen na povrchu buněčné membrány erytrocytů označuje se krev jako Rh+, v opačném
případě Rh-.
Určení Rh faktoru má velký význam zejména při transfůzích krve. Po špatné transfúzi
by došlo ke tvorbě protilátek proti antigenu D a následné hemolytické reakci.
Úkol: Stanovte krevní skupinu ve vzorku kapilární krve pomocí komerčního kitu.
Před vlastním stanovením si řádně přečtěte přiložený návod.
Do protokolu uveďte princip imunoprecipitace, jakým kitem bylo stanovení provedeno a jaké
krevní skupiny jste stanovili jednotlivým členům vaší pracovní skupiny.
Závěr: Do protokolu stručně shrňte všechny výsledky z tohoto cvičení.
Doplňující otázky:
Co je to imunoprecipitace? Uveďte příklad precipitační reakce. (1 bod)
Co je to avidita a afinita protilátek? Jaký je mezi nimi rozdíl? (2 body)
Jaké funkce plní železo v organismu? (1 bod)
Co je to fetální erytroblastóza a čím je způsobena? (1 bod)