Jméno a UČO:

            Datum:



                   Detekce aktivity askorbát peroxidasy v polyakrylamidovém gelu


TEORETICKÝ ÚVOD


            Askorbát peroxidasa (APX) je enzym zodpovědný za detoxifikaci peroxidu vodíku u
rostlin. U rostlin se vyskytují tři izoenyzmové formy lišící se lokalizací v buňce. Všechny
askorbát peroxidasy katalyzují reakci:


           2 askorbát + H[2]O[2]                        2 monodehydroaskorbát + 2 H[2]O


            Role askorbát peroxidasy při obranné reakci byla podpořena pozorováními, že její
aktivita narůstá při aplikaci různých enviromentálních stresů. V některých případech však můžeme po
infekci rostliny patogenem pozorovat drastický pokles její aktivity, který poté potencuje nekrózu
buněk způsobenou převážně oxidačním stresem.


            Využití nativní polyalkrylamidové elektroforézy pro stanovování aktivit celé řady
enzymů má převážně největší význam při studiu aktivace jednotlivých izoenzymových forem. Toto
stanovení aktivity APX je založeno na schopnosti askorbátu redukovat nitro-blue tetrazolium (NBT) v
přítomnosti N,N,N´,N´-tetraethylendiaminu (TEMED) na nerozpustný barevný formazan. V přítomnosti
H[2]O[2] je APX schopna zabránit tvorbě formazanu díky velmi rychlé oxidaci askorbátu. Proto je
aktivita APX pozorována na gelu jako achromatický proužek.


POSTUP PRÁCE


Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci z listů po aplikaci cryptogeinu a kontrolních listů po
aplikaci vody sesbíraných v časových intervalech 0h, 12h a 24h po aplikaci.  Vzorky udržujte
konstantně při 4°C.


Izolace askorbát peroxidasy


1.      0.3 g tkáně vložte do třecí misky, zmrazte v tekutém dusíku a rozetřete v 0,6 ml izolačního
pufru (100 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 5 mM askorbát, 1 mM EDTA).

2.      Homogenát přeneste do 1.5 ml zkumavky a centrifugujte při 12 000 x g 5 min při 4°C.

3.      Supernatant přeneste do nové 1.5 ml zkumavky a opět centrifugujte při 20 000 x g 40 min při
4°C.

4.      Odsajte supernatant a uchovávejte ho na ledu.





Příprava polyakrylamidového gelu  (12%)



1.      Gel propláchněte vodou, vložte do elektroforetické vaničky a přilijte elektroforetický pufr
obsahující 2 mM askorbát.


2.      Spusťte elektroforézu na 30 minut při konstantním proudu 15 mA/gel. Elektroforézu
provádějte při 4°C.


Příprava a nanesení vzorků


1.      Smíchejte 20 µl enzymového izolátu s 4 µl nanášecího pufru.

2.      Na gel nanášejte 15 µl jednotlivých izolátu v následujícím pořadí:


    Gel č.1: (15 µl izolátu): voda 0h, voda 12h, voda 24 h, mezera, cry 0 h, cry 12 h, cry 24h


  3.  Elektroforézu provádějte při konstantním proudu 15 mA/gel po dobu 2 hodin při 4 °C.


Detekce aktivity askorbát peroxidasy v gelu


Všechny následující kroky budou prováděny při pokojové teplotě.

1.      Ekvilibrujte gel 5 minut v 20 ml ekvilibračního pufru I (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 2mM
askorbát).

2.      Poté inkubujte gely 10 minut v 20 ml ekvilibračního pufru II, do kterého přidejte 6 µl
peroxidu vodíku.

3.      Poté gel promyjte 1 minutu v 20 ml promývacího pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0)) a
ponořte ho do detekčního pufru(50 mM fosfátový pufr (pH=7.8), 28 mM TEMED, 2.45 mM NBT). Aktivita
askorbát peroxidasy bude detekována jako achromatický proužek na tmavém pozadí.


VYHODNOCENÍ


-          Srovnejte změny aktivity askorbát peroxidasy po aplikaci cryptogeinu ve srovnání s
kontrolou (voda) v závislosti na čase.

-          -Výsledek zdůvodněte.