titl CZ OPVK_MU_vlevo_2 •Design sekvence PCR primerů •Hana Konečná • • •CEITEC - MU •Centrální laboratoř - Proteomika • titl CZ OPVK_MU_vlevo_2 • definice • aplikace • modifikace • syntéza • purifikace • kontrola kvality • design sekvence • zásady navrhování • software OLIGO 7 • praktická ukázka OLIGONUKLEOTIDY zahlavi CZ oligonukleotid • krátká jednořetězcová struktura • DNA nebo RNA (event. PNA) • hydroxyl na obou koncích (normálně na 5´- konci fosfát) oligonukleotid syntetický oligonukleotid primer orientace! polymeráza! zahlavi CZ Aplikace syntetických oligonukleotidů • primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PCR • syntéza genů a rekombinantní proteiny • hybridizační sondy pro klonování • místně cílená mutageneza • sekvenování a genetické profilování • diagnostika – testy a biosensory • gene arrays • blokace genové exprese antisense oligo • potenciální léčiva a DNA vakcíny • NMR studia interakcí DNA-protein • strukturální rentgenová analýza NA • zahlavi CZ Modifikace • degenerace • konce řetězce • báze • fosfát • cukr • PNA zahlavi CZ Degenerované oligonukleotidy Příklady: ACG TAC GTA CGT ACG TAC nedegenerovaný ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T zahlavi CZ Degenerované oligonukleotidy M A or C R A or G W A or T S C or G Y C or T K G or T V A or C or G H A or C or T D A or G or T B C or G or T N G or A or T or C X G or A or T or C 2-deoxyinosin zahlavi CZ Modifikace na 5´- konci sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR postsyntetické modifikace zahlavi CZ Modifikace na 3´- konci derivatizovaná matrice zahlavi CZ Real-Time PCR • 2x značená sonda • REPORTER • QUENCHER zahlavi CZ Další modifikace páteř cukr zahlavi CZ Terapeutika nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby zahlavi CZ ANTISENSE oligonukleotid • • oligonukleotid nebo analog • komplementární k segmentu RNA nebo DNA • vazbou inhibuje jejich normální funkci RNA s katalytickou aktivitou zahlavi CZ Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end • nenabitá molekula • vazba k DNA/RNA PNA DNA zahlavi CZ Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin • nenabitá molekula • vazba k DNA/RNA PNA DNA zahlavi CZ Vlastnosti PNA zahlavi CZ Locked Nucleic Acid 2'-O, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjímečná biostabilita LNA zahlavi CZ OLIGONUKLEOTIDY design syntéza purifikace EXPEDITE 8909 New Campus_07 zahlavi CZ Syntéza oligonukleotidu • syntéza na pevné fázi • od 3´-konce k 5´-konci • bezvodé prostředí zahlavi CZ Kontrola kvality BioCADlab • anex • RP • HPLC • Perfúzní chromatografie n-1 soli zahlavi CZ 2chrom Perfúzní chromatografie klasický sorbent POROS zahlavi CZ Maldi-TOF MS CE zahlavi CZ PAGE yield2 gel_purity VÝTĚŽEK zahlavi CZ New Campus_28 New Campus_31 Textové pole: PURIFIKACE • Sephadex • RP cartridge • HPLC PURIFIKACE zahlavi CZ DESIGN OLIGONUKLEOTIDU • manuální • počítačový Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primeru • vysoce specifické • netvoří dimery a vlásenky • stabilní duplexy s aktivní sekvencí • nepříliš stabilní 3´-konec www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Oligo_Design/index.html zahlavi CZ oligo OLIGO 6 OLIGO 7 (od roku 2008) • PCR primery, • hybridizační sondy • sekvenační primery • • • TaqMan sondy • primery pro nested PCR • molecular beacons • siRNA • • zahlavi CZ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Terminologie PCR primerů forward primer… část sekvence + vlákna reverse primer… část sekvence - vlákna zahlavi CZ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Terminologie forward primer… část sekvence + vlákna reverse primer… část sekvence - vlákna polymeráza polymeráza zahlavi CZ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Nasedání PCR primerů zahlavi CZ * 1 ATGGCTTCTG CTCAATCTTT CTACAACCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA 51 TGTCATGGTT GTGGACGATG ATCATGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA 101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT 151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT 201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT 251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA 301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT 351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA 401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA 451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA 501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT 551 AAAAAAAAAA AAAAAATTGT AAATCGTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA 601 TCTTAGTTTA AAACTAGCTG ATATTCTTCA AATCGACTGT TCTTATAAGT 651 AATCAACCAA TTAGCATCAA TCACAATAAA TTGTAAACAC TTCAATGAAA 701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT 751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC 801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA 851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT 901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG 951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA 3´ * + 5´ CTT CTG CTC AAT CTT TCT AC 3´ FORWARD 5´ TGA AGA ATA TCA GCT AGT TT 3´ REVERSE 5´ zahlavi CZ sequence-window-1 sequence-window-2 sequence-window-4 sequence-window-5 sequence-window-6 zahlavi CZ search options zahlavi CZ available subsearches zahlavi CZ PCR window zahlavi CZ primers key info Priming Efficiency PE Score zahlavi CZ duplex formation graph • HAIRPIN intramolekulární • DIMER intermolekulární zahlavi CZ hairpins window zahlavi CZ zahlavi CZ zahlavi CZ database window zahlavi CZ restriction enzyme search result zahlavi CZ false priming sites of M13 zahlavi CZ DNA concentration calculator zahlavi CZ zahlavi CZ zahlavi CZ zahlavi CZ LITERATURA §Artificial DNA: Methods and Applications; Khudyakov, Y.E., Fields, W.A., Ed. (2003) §PCR Primer: A Laboratory Manual (2003) §OLIGO Primer analysis software, Version 7 zahlavi CZ OPVK_MU_vlevo_2 Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky“(CZ.1.07/2.3.00/09.0132) Discovery is not in seeking new landscapes, but in having new eyes… Marcel Proust