Úloha do laboratorního cvičení – C8102 Speciální metody
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ( HPLC )
Analýza metabolických markerů:
stanovení inosinu, adenosinu a jejich 2´-deoxy forem
Teoretická část úlohy:
Úvod do problematiky stanovovaných metabolických markerů
Základní principy a charakteristiky ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii ( HPLC )
Způsoby kvalitativního a kvantitativního vyhodnocení výsledků v HPLC
Seznámení se s vývojem HPLC metod a jejich validacemi
Praktická část úlohy:
HPLC separace zvolených analytů – charakteristika separačního systému a
chromatografických podmínek
Vyhodnocení výsledků v HPLC – identifikace a kvantifikace látek
Srovnání výsledků, získaných různými způsoby kvantitativního hodnocení
Validace metody – statistické vyhodnocení
Úvod do problematiky stanovovaných metabolických markerů
Puriny a jejich metabolity jsou přirozeně se vyskytující látky, které se v lidském těle
účastní řady důležitých biochemických procesů. Purinové nukleotidy, společně
s pyrimidinovými tvoří základ nukleových kyselin a vyskytují se dále jako součást některých
koenzymů. Jejich přítomnost v organismu není závislá na příjmu potravou (jak je tomu
například u vitamínů), ale všechny potřebné nukleotidy jsou v těle syntetizovány
z příslušných prekurzorů.
Obecně řečeno jsou nukleotidy fosforečné estery pentos (ribosy nebo deoxyribosy), ve
kterých je na uhlík C1´sacharidu vázána purinová nebo pyrimidinová báze. Při jejich
odbourávání jsou nejprve hydrolyzovány na nukleosidy (ztráta fosfátu). Následuje cyklus
metabolických přeměn, jejichž konečným produktem je v lidském organismu kyselina
močová, která je z těla vylučována močí. Volné purinové báze jsou však touto cestou
metabolizovány jen zčásti, další část je vrácena zpět k syntéze nových nukleotidů (tzv.
purinový cyklus). Celý tento cyklus je ovlivňován správným působením příslušných enzymů,
jejichž nerovnovážné působení může vést k závažným metabolickým poruchám.
Deficit adenosindeaminasy (ADA)
Jedná se o metabolickou poruchu, která postihuje imunitní systém. Deficit ADA je
spojen s často se opakujícími infekcemi a je jednou z příčin tzv. těžkého kombinovaného
imunodeficitu. Klinické projevy (nejčastěji to bývají plicní infekce, kandidóza, chronické
průjmy) se projevují už od narození a postižení tímto onemocněním obvykle bez léčby během
jednoho roku umírají. Prvním krokem diagnostiky deficitu ADA je průkaz adenosinu a
2´-deoxyadenosinu v moči. Při nedostatku zmíněného enzymu totiž dochází v těle
k hromadění těchto metabolitů a k jejich následnému nadměrnému vylučování.
Deficit purinnukleosidfosforylasy (PNP)
Nedostatek enzymu PNP je v porovnání s ADA poněkud vzácnější, avšak jeho deficit
bývá opět spojován s poruchami imunity. Díky deficitu PNP dochází k hromadění
specifických enzymových substrátů (guanosinu, inosinu, 2´- deoxyguanosinu,
2´- deoxyinosinu), které jsou ve zvýšené míře pro organismus toxické. Všechny zmíněné
metabolity jsou v tělních tekutinách za normálních okolností téměř nedetekovatelné, proto
jejich vylučování a prokázání v moči patří k prvním krokům v diagnostice této metabolické
poruchy.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high-performance liquid chromatography HPLC)
je v současnosti nejrozšířenější separační technikou, užívanou v klinických a
bioanalytických laboratořích, která slouží k identifikaci a kvantifikaci bioanalytů. Její stále se
zdokonalující instrumentace a s tím související vývoj nových metod pomáhají efektivně
analyzovat stále širší spektrum biologicky významných analytů.
Základní principy a charakteristiky vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC)
Chromatografii lze obecně definovat jako fyzikálně-chemickou metodu, která je
založená na distribuci látek mezi tzv. stacionární (SF) a mobilní fázi (MF). Stacionární fází je
tuhá látka nebo kapalina, ukotvená na tuhém nosiči, zatímco mobilní fáze je výhradně tvořená
tekutinou. Stacionární fáze je umístněna v chromatografických kolonách, kterými protéká
mobilní fáze, hnaná v případě vysokoúčinné kapalinové chromatografie pomocí
vysokotlakého čerpadla.
Na fázovém rozhraní mezi SF a MF dochází k opakovanému dynamickému procesu
sorpce a desorpce stanovovaných látek, který je pro každou látku charakterizován tzv.
distribuční konstantou KD. Tento parametr udává poměr rovnovážné koncentrace látky
strávené v SF k rovnovážné koncentraci látky strávené v MF. Pro rozdělení dvou látek je
nutné, aby se jejich distribuční konstanty dostatečně lišily.
Základní instrumentace HPLC je znázorněna níže. Mobilní fáze je podle potřeby
smíchána z vodné a organické složky a pomocí vysokotlakého čerpadla přiváděna na kolonu.
Mezi kolonou a čerpadlem je umístěno zařízení pro dávkování vzorku, ze kterého je proudem
mobilní fáze vzorek unášen na kolonu. Na výstupu z kolony je umístěn detektor, z něhož je
signál veden obvykle do osobního počítače.
K nejběžněji používaným kolonám v klasické HPLC patří
částicové kolony (A), kdy je tělo kolony, vyrobené např.
z nerezové oceli, naplněno částicemi sorbentu o definovaném
průměru a velikosti pórů. Na částicích je pak navázána funkční
skupina, udávající charakter stacionární fáze. Alternativou k těmto
kolonám jsou kolony monolitické (B). Jedná se o separační média,
která můžeme přirovnat k jedné veliké částici, mající tvar i objem
zcela zaplňující vnitřní část kolony. Výhodou oproti částicovým
typům kolon je absence mezičásticových prostor, kdy je mobilní
fáze nucena protékat póry monolitu. Vysoká pórovitost a
mimořádně nízký odpor vůči proudění kapaliny je předpokladem
vysokých průtokových rychlostí, vhodných k velmi rychlým separacím.
V naší úloze použijeme monolitickou kolonu s reverzní fází C18, kde je monolit
tvořen oxidem křemičitým a uzavřen v trubici z poly(ether-ether-ketonu). Navázání funkční
skupiny je provedeno následnou reakcí v již vytvořené koloně. Křemičitanové monolity se
skládají z dobře uspořádaných, přibližně stejně velkých skeletů, prostoupených téměř
monodisperzními póry o velikosti 1 um. V porovnání s částicovou kolonou stejných rozměrů
a porozity poskytují monolitické kolony kratší doby analýz, nižší tlaky při vyšších
průtokových rychlostech, lepší reprodukovatelnost i životnost.
Chromatografické systémy s reverzními fázemi (RP-HPLC) jsou majoritní technikou
s více než 85% aplikací a často jsou první volbou při vývoji a optimalizaci nových HPLC
metodik. Mobilní fáze v RP-HPLC je polární. Obvykle je tvořená vodnou složkou (voda nebo
zředěný roztok kyseliny, báze nebo pufru) a organickou složkou (s vodou mísitelné organické
rozpouštědlo, nejběžněji metanol nebo acetonitril). Stacionární fáze má nepolární charakter,
kdy se nejčastěji jedná o navázané uhlíkaté řetězce na povrchu nosiče (nejčastěji oktadecyl
C18 či oktyl C8).
Mezi faktory nejvíce ovlivňující separaci v RP-HPLC patří eluční síla mobilní fáze,
její iontová síla a pH. Voda jako nejběžněji používaná složka mobilních fází má nízkou eluční
sílu, proto se zvyšujeme přídavkem organické složky (metanol, acetonitril), která má eluční
sílu vyšší. Eluční síla některých rozpouštědel stoupá v následujícím pořadí:
voda < methanol < acetonitril < propan-2-ol < dioxan < tetrahydrofuran
Iontová síla je určena přítomností solí v mobilní fázi a roste s jejich koncentrací.
Iontová síla ovlivňuje sílu interakcí separovaných látek se stacionární fází díky změně
solvatačního obalu molekul. S vyšší iontovou silou je solvatační obal molekul tenčí a
interakce se stacionární fází se více projevují. Maximální doporučovaná koncentrace solí je 50
mM. Koncentrace protonů ovlivňuje ionizovatelné molekuly (např. organické kyseliny a
báze). Zde je nutné si uvědomit, že ionizace molekuly vede v případě reverzní stacionární
fáze k dramatickému poklesu retence a je proto ve většině případů žádoucí se jí volbou pH
vyhnout. Na druhou stranu je možné volbou pH cíleně ionizovat součásti matrice vzorku a
zjednodušit si tak výsledný chromatogram. pH mobilní fáze nastavujeme v rozmezí daném
většinou pH stabilitou stacionární fáze (např. pH 2-8) použitím vhodného pufru.
Zádrž analytů na koloně je hodnocena pomocí tzv. retenčních charakteristik. Základní
veličinou je retenční (eluční) čas tr, což je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení
maximu eluční křivky (vrcholu píku analytu). Lze se také setkat s pojmem retenční (eluční)
objem, který udává objem mobilní fáze, která proteče kolonou za dobu retenčního času.
Mírou retence dělených látek je tzv. kapacitní (retenční) faktor ki , který charakterizuje
selektivitu a slouží ke srovnání separace a retence analytu v různých systémech. Dá se
vyjádřit pomocí následující rovnice
kde tr je retenční čas analytu a tm je tzv. mrtvý čas, což je čas složky, která se pohybuje se
stejnou rychlostí jako mobilní fáze a není na koloně vůbec zadržována (tzv. inertní látka).
Retenční čas, který pak analyt stráví ve stacionární fázi se nazývá redukovaný retenční čas tr´
a určí se rozdílem retenčního a mrtvého času
ki =
(tr – tm)
tm
Hlavním cílem HPLC analýz je dosažení co nejlepšího rozdělení látek v co nejkratším
čase, tzv. s co nejvyšší účinností. Parametr, který hodnotí separační systém z pohledu jeho
účinnosti je vyjádřen počtem teoretických pater N a charakterizuje míru rozmývání složek
vzorku při transportu kolonou (rozšiřování elučních zón). Tento parametr lze experimentálně
zjistit z naměřených parametrů dosazením do vztahu
kde tr je retenční čas analytu, w je šířka píku při základně a wh šířka píku v polovině výšky.
čas (min)
odezvasignálu
tr
tm
w1
w2
inertní látka analyt
∆t
wh1
wh2
čas (min)
odezvasignálu
tr
tm
w1
w2
inertní látka analyt
∆t
wh1
wh2
Pro porovnání účinnosti kolon různých délek je používán tzv. výškový ekvivalent
teoretického patra H, který vyjadřuje délku kolony, připadající na jedno teoretické patro.
Při rozdělení dvou složek vzorku je snaha o dosažení co nejpřijatelnějšího rozdělení.
Pro hodnocení míry vzájemného překrývání dvou sousedních píků se používá veličina zvaná
rozlišení R.
kde tr1 a tr2 jsou retenční čas analytů a wh1 a wh2 jsou šířky píku v polovině jejich výšky.
Rozlišení lze vypočítat z retenčních časů analytů a šířek píků. Z hodnoty R lze
odhadnout míru překrývání sousedících píků. Při hodnotě R = 1 jsou píky překryty z 2 %
plochy. Odděleny z 99,9 % a více jsou při hodnotě R ≥ 1,5.
tr´ = tr – tm
H
N
L
=
R =
½ (wh1 + wh2)
tr2 - tr1
N = 5,54
wh
tr
( )
2
= 16
tr
( )
2
w
Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení výsledků v HPLC
K identifikaci látek slouží retenční čas, který lze získat z chromatografického
záznamu. Další možností identifikace látek je použití specifických detektorů, jakými jsou
např. NMR nebo MS detektor.
Při kvantitativním stanovení se hledá vztah mezi množstvím eluované látky a plochou
zaznamenaného píku (v případě symetrického píku Gaussova tvaru je možné počítat i s
výškou píku). Problém však často nastává s určením začátku a konce píku a s nastavením
způsobu integrace ve vyhodnocovacím softwaru. Určení plochy je poté nepřesné a vede k
chybně provedené kvantifikaci. Jelikož má vyhodnocení dat v HPLC relativní charakter, je
možné vztah mezi plochou nebo výškou píku a neznámou koncentrací stanovovaného analytu
určit empiricky pomocí standardů. Při kvantitativním stanovení pak lze použít například
následující metody:
Metoda vnějšího standardu (metoda kalibrační křivky)
Metoda přídavku standardu
Metoda vnitřního standardu
Metoda vnějšího standardu
Tato metoda patří mezi nejjednodušší způsoby kvantifikace a je známa jako metoda
kalibrační křivky. Analyzují se při ní roztoky standardů o známé, ale rozdílné koncentraci a je
hledána závislost mezi koncentrací a plochou (případně výškou) píku. Metoda přídavku
standardu předpokládá linearitu kalibrační závislosti, kdy pro kalibrační přímku lze napsat
vztah
kde a je úsek na ose y, b je směrnice kalibrační přímky (vyjadřuje citlivost) a xi je hodnota
veličiny X pro koncentraci ci. Obvykle se měří 5 – 7 bodů přímky, přičemž každý bod se
doporučuje měřit alespoň 2 – 3x, aby se dosáhlo co nejspolehlivějších výsledků. Tento způsob
kvantitativního vyhodnocení je vhodný pro práci se standardy a v případě, kdy má vzorek a
standard srovnatelné vlastnosti. Nelze jej použít pro složité reálné vzorky, u kterých není
možné zanedbat vliv matrice. Je třeba vždy ověřit statistickou významnost úseku a.
Metoda přídavku standardu
Principem tohoto kvantitativního stanovení je přídavek přesného a známého množství
standardu stanovované látky ke vzorku. Lze se setkat s několika variantami této metody:
Metoda jednoho přídavku standardu: První analýza vzorku o určitém objemu Vi a neznámé
koncentraci ci zjistí plochu Ai.. Po přidání známého objemu standardu Vs o známé koncentraci
cs se stanoví plocha Asi a pro neznámou koncentraci ci pak platí vztah
Tato metoda snižuje riziko systematických chyb, naopak ale zvyšuje riziko výskytu chyb
náhodných.
ci =
(Asi (Vi+Vs)-AiVi)
Ai csVs
xi = a + bci
Metoda více přídavků standardu: K roztoku vzorku jsou přidávány přídavky standardů
v celých násobcích předpokládané koncentrace. Poté je vynesena závislost plochy píku na
změnách koncentrace a s použitím extrapolace regresní přímky je stanovena neznámá
koncentrace sledovaného analytu. Neznámá koncentrace cx odpovídá podílu odezvy
původního vzorku A0 a směrnice přímky b
Metoda přídavku standardu do konstantního objemu: Stejné podíly vzorku o objemu Vi a
neznámé koncentraci ci, k nimž jsou přidány různé objemové jednotky standardu Vs (n = 1, 2,
3…) o koncentraci cs jsou doplněny na stejný konečný objem Vc a je změřena plocha píku An.
Z přímkové závislosti, kdy je směrnice b a úsek a určen graficky, pak pro neznámou
koncentraci platí
Výhodou této metody kvantitativního stanovení je fakt, že koncentrace standardu
v jednotlivých přídavcích nemusí být použita pro výpočet.
Metoda vnitřního standardu
Metoda je založená na přídavku chemické látky, tzv. vnitřního standardu, která je
svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi podobná stanovovanému analytu a k jejíž eluci
dochází v blízkosti stanovovaného analytu. Tento způsob kvantifikace eliminuje vliv změny
pracovních podmínek a má dvě varianty provedení:
Metoda přímého porovnání: Známý objem vnitřního standardu Vis o známé koncentraci cis se
přidá k roztoku analyzovaného vzorku o neznámé koncentraci analytu cx a k roztoku
standardu o známé koncentraci cs. Po analýze jsou v jednom experimentu stanoveny plochy
píků analytu Ai a vnitřního standardu Ais,i a ve druhém experimentu plochy píků standardu As
a vnitřního standardu Ais,s. Hledané koncentrace je následně stanovena z následujícího vztahu:
Metoda kalibrační křivky: K několika roztokům standardu je přidán konstantní objem
vnitřního standardu Vis o jedné známé koncentraci cis. Z kalibrační přímky, znázorňující
koncentrace standardů cs na poměru ploch standardu As a vnitřního standardu Ais je poté
přímo odečtena koncentrace hledaného analytu cx.
cx
b
A0
=
a
cx =( )b ( )V
cs Vs
Ai
cx =
As Ais,i
Ais,s
cs( () )
Vývoj metod v HPLC a jejich validace
Analytická metoda popisuje konkrétní využití analytické techniky a příslušné
metodiky ke stanovení konkrétního analytu. Volba chromatografických podmínek by měla
vést k tomu, aby byly analyty co nejlépe a nejrychleji separovány v co nejkratším čase. Při
vývoji metody se vychází z nejen z teoretických principů, ale také z experimentálních
zkušeností a literární rešerše. Celková analýza je ovlivněna řadou faktorů, mezi které patří
například výběr stacionární fáze a rozměrů kolony, pH a složení mobilní fáze, teplota, průtoková
rychlost apod. Optimalizací zmíněných faktorů hledáme nejvhodnější podmínky pro stanovení
daného analytu.
Většina metod, používaných v praxi, musí být v rámci tzv. systému kontroly kvality
(QC) validována. Validací se rozumí ověření a prokázání vhodnosti určitého postupu pro
zamýšlené použití a k získání relevantních dat. Mezi nejběžnější validační parametry v HPLC
patří:
Správnost (accuracy) – těsnost shody mezi výsledkem měření a přijatou referenční
hodnotou. Poměr množství analytu získaného měřením k přijaté referenční hodnotě je
nazýván návratností nebo výtěžností (recovery), přičemž přijatelná výtěžnost by se měla
pohybovat v rozmezí 95 – 105%. Výtěžnost v HPLC se nejčastěji vyhodnocuje analýzou
vzorku s přidaným standardem na minimálně třech koncentračních hladinách v co nejširším
kalibračním rozsahu. Počet paralelních opakování by se měl pohybovat kolem 7 a relativní
směrodatná odchylka pro každou koncentrační hladinu by neměla být větší než 3%.
Rozdíl mezi výsledkem měření a přijatou referenční hodnotou je pak nazýván chybou
výsledku, kdy celková chyba stanovení může být ovlivněna chybou systematickou
(předvídatelně se měnící) a/nebo náhodnou (mění se nepředvídatelným způsobem).
Systematické chyby jsou způsobeny např. nesprávnou kalibrací (pipet, odměrných baněk,
analytických vah a podobně) a lze je odstranit či minimalizovat, chyby náhodné vznikají
v průběhu celého postupu stanovení zcela nahodile a nelze je žádným způsobem odstranit.
Přesnost (precision) – hodnota, udávající míru těsnosti shody mezi vzájemně
nezávislými výsledky analýz, získaných za daných podmínek. Lze ji vyjádřit jako:
Opakovatelnost (repeatability) – těsnost shody výsledků, získaných opakovaným použitím
téže metody, na identickém materiálu, v téže laboratoři týmž pracovníkem během krátkého
časového rozmezí.
Mezilehlá přesnost (intermediate precision) – přesnost měření, kdy se nemění postup,
materiál, místo stanovení, ale sleduje se v delším časovém úseku, případně může zahrnovat
lehkou variabilitu – novou kalibraci, nového pracovníka, nový přístroj apod.
Reprodukovatelnost (reproducibility) – těsnost shody mezi vzájemně nezávislými výsledky,
získanými měřením stejného materiálu stejnou metodou různými laboratořemi, operátory, na
různé instrumentaci v různý čas apod.
Linearita (linearity) – schopnost metody poskytnout v daném rozsahu přijatelnou
lineární korelaci mezi koncentrací analytu a získaným signálem. Pro určení linearity se volí
minimálně 5 vzorků o různých koncentračních úrovních, pokrývajících rozsah v celé měřící
oblasti. V některých farmakologických a bioanalytických případech se využívají také
nelineární závislosti, které lze následně linearizovat popisem funkce nebo speciálními
matematickými aparáty.
Mez detekce (limit of detection, LOD) – odpovídá koncentraci, pro kterou je
analytický signál statisticky významný od šumu
Mez stanovitelnosti (limit of quantification, LOQ) – koncentrace, při které přesnost a
správnost stanovení dovoluje kvantitativní vyhodnocení.
Nejčastějším způsobem určení zmíněných parametrů je výpočet například s využitím poměru
signálu a šumu, ze směrodatné odchylky odezvy a ze směrnice kalibrační přímky
kde sd je směrodatná odchylka výšky šumu a b je směrnice přímky z kalibrační
závislosti výšky píku na koncentraci.
Selektivita metody (method selectivity) – schopnost přesného a správného určení
analytu i v přítomnosti interferujících látek (matrice). Neselektivní metoda dává signál, který
neodpovídá skutečnému obsahu analytu, ale je zesílen signálem rušivé složky. Pokud je k
dispozici matrice vzorku, analyzujeme matrici, dále vzorek bez matrice i bez analytu (v
případě HPLC nastříkneme mobilní fázi), standardní roztoky sledovaných látek, kontrolní
vzorky (matrice + standardy stanovované složky), vzorky s přídavkem standardní
(stanovované) složky. Zjistíme, zda interference pochází ze srovnávacího vzorku metody, pak
je potřeba odstranit zdroj interference (kontaminace rozpouštědla, laboratorního nádobí,
přístrojů atd.) nebo pochází ze srovnávacího vzorku matrice a je nutné optimalizovat extrakci
vzorku, předseparaci (čištění vzorku). Odezva interferujícíchh látek musí být menší než 1%
odezvy nejnižší koncentrační hladiny analytu ve vzorku.
Dynamický rozsah (range, working interval) – interval hodnot měřeného analytu, pro
který je validací potvrzeno, že metoda je v něm aplikovatelná. Spodní mez určuje mez
stanovitelnosti, shora je určen měřením vzorků s různým obsahem analytu.
Robustnost (robustness) – míra kapacity metody poskytovat shodné výsledky při jejím
reprodukování za nepatrně změněných podmínek. V případě HPLC by měla robustní metoda
dávat přijatelné výsledky (např. retenční čas, plocha píku, rozlišení) i když dochází v
experimentálních parametrech (např. složení mobilní fáze, pH, teplota kolony, průtoková
rychlost) k mírné odlišnosti od požadovaných v důsledku běžné nepřesnosti (např. nepřesnosti
odměrného nádobí, pomocných přístrojů). Robustnost je experimentálně zjišťována pomocí
záměrného vnášení malých změn do metody a zkoumání jejich důsledků.
Test způsobilosti HPLC – test způsobilosti systému (system suitability test, SST) je
testem pro určení vhodnosti a validity chromatografického systému před jeho použitím a bývá
nedílnou součástí metody. Provádí se vždy na počátku každého měření, při změně systému
případně při podezření na chybně fungující systém. Obvykle se provádí následující:
Test opakovaného nástřiku
= 6 nástřiků a určení relativní směrodatné odchylky RSD (měla by být menší než 1,5 %)
Test linearity
= z 5 bodů o různé koncentraci sestavit kalibrační závislost a určit koeficient determinace
(hodnota koeficientu determinace by neměla dosahovat menší hodnoty než 0,990)
LOQ
b
10 sd
=LOD
b
3 sd
=
Praktická část úlohy
Přístroje a zařízení
• HPLC systém 10 AVP fy SHIMADZU:
• odplyňovač GT-154
• systémová řídící jednotka SCL-10AVP
• pumpa LC-10AVP
• pícka CTO-10ASVP
• PDA detektor SPD-M10AVP
• řídící software Class-VP 5.02
• 2 monolitické kolony 100 x 4.6 mm, Onyx C18
• injekční stříkačka se speciálně upravenou jehlou pro dávkování vzorků
(Hamilton)
• mikropipety
• ultrazvuková lázeň
• odměrné baňky a další běžné laboratorní vybavení
Chemikálie
• standardy bází nukleosidů (koncentrace 10mM):
2’-deoxyinosin (dIno)
inosin (Ino)
2’-deoxyadenosin (dAde)
adenosin (Ade)
• thiomočovina (0,002% roztok ve vodě)
• mobilní fáze pro měření vzorků a standardů
= vodný roztok fosfátu sodného o koncentraci 15mM a pH 3,8; metanol pro
chromatografii
Obecný postup při práci s kapalinovým chromatografem
Sběr dat – obsluha řídícího software a sběr dat se provede dle pokynů vedoucího
cvičení. Jako kvantitativní parametr bude odečítána plocha píku. Všechna měření se provádí
nejméně třikrát.
Příprava dávkovače a vzorku před nadávkováním vzorku na kolonu – roztok vzorku
se na kolonu dávkuje dávkovacím kohoutem. Před zahájením vlastního měření je nutné
propláchnout dávkovací kohout destilovanou vodou, metanolem nebo mobilní fází (jinak
hrozí nebezpečí kontaminace z předchozích vzorků). Vzorek dávkovaný na kolonu musí být
čirý, částice nebo zákal mohou nevratně znehodnotit kolonu. Vzorky obsahující rozpuštěné
plyny (např. metanolické roztoky) je třeba před nástřikem důkladně odvzdušnit v
ultrazvukové lázni.
Naplnění smyčky dávkovače – při plnění dávkovací smyčky o objemu 20 µl se páčka
dávkovače přepne do pohotovostní horní polohy. Pro analýzu se pomocí injekční stříkačky
bere dostatečné množství vzorku, aby byla naplněna celá dávkovací smyčka (přibližně 25 µl).
Do dávkovacího otvoru se jemně zasune jehla injekční stříkačky (nezasouvat násilím na
doraz) a tlakem na píst injekční stříkačky se naplní dávkovací smyčka dávkovače (na konci
odpadní kapiláry odkápne přibližně 3-5 kapek). Při dávkování vzorku do smyčky je nutné
kontrolovat přítomnost bublinek v injekční stříkačce. Do systému se nesmí dostat plyn!
Nástřik vzorku na kolonu – v momentě, kdy je software připravený sbírat data, se
páčka dávkovače otočí do pravé spodní polohy. Tím se uvnitř dávkovače přepne směr toku
mobilní fáze tak, že na kolonu prochází mobilní fáze přes smyčku dávkovacího ventilu, kam
jsme před chvílí nadávkovali roztok vzorku. Jehla se poté vytáhne.
Pracovní postup
Změření testovací směsi – testovací směs (aceton, benzen, toluen) se měří v základní
mobilní fázi pro RP-HPLC (70 % MeOH). Měření testovací směsi se optimálně provádí vždy
před začátkem a po skončení celého měření. Porovnáním píků (retenční čas, rozlišení, počet
teoretických pater, asymetrie) testovací směsi se ověřuje, zda nedošlo ke změně vlastností
kolony během měření (např. kontaminací kolony těžko eluovatelnými látkami ze vzorku).
Změna pracovní mobilní fáze – změna mobilní fáze se provede dle instrukcí
vedoucího cvičení. Je nutné se řídit obecnými postupy, které zajistí 100% mísitelnost dvou po
sobě jdoucích mobilních fází a dostatečnou ekvilibraci kolony mezi dvěma mobilními fázemi.
V našem systému se osvědčily následující podmínky pro výměnu mobilní fáze: 1) změnit
procento organické složky ze základního stavu (70 % metanolu) na procento použité v cílové
mobilní fázi (v našem případě 8 % metanolu); 2) zaměnit vodnou složku z deionizované vody
za 15 mM vodný roztok fosfátu sodného o pH 3,8. V obou případech ponechat protéct alespoň
10 kolonových objemů pro dostatečnou ekvilibraci kolony – přibližně 15 minut při průtoku 2
ml/min.
Stanovení mrtvého retenčního času (tm) – mrtvý retenční čas se stanovuje látkou,
která není zadržovaná stacionární fází (v případě RPLC se používá např. thiomočovina) a to
v takové mobilní fázi, která se používá pro měření vzorků. Mrtvý retenční čas udává dobu, za
kterou projde zcela inertní látka vůči sorbentu systémem až na detektor. Mrtvý retenční čas je
nutné znát např. pro výpočet kapacitního faktoru, který má přímý vztah k termodynamickým
vlastnostem separace (distribuční konstanty). Je možné jej navíc použít pro porovnání
výsledků získaných na jiném chromatografickém systému pomocí totožné metody.
Analýza standardů nukleosidů – připravte si roztok každého standardu o koncentraci
0,05 mM a proveďte 3x analýzu každého standardu. Určete eluční pořadí analytů a
vypočítejte základní retenční charakteristiky.
Částečná validace metody
Opakovatelnost – připravte směsi všech čtyř standardních látek v ekvimolárním
množství na 2 koncentračních hladinách – 0,5 a 0,005 mM. Každou směs 5x proměřte. Určete
směrodatnou odchylku (SD), relativní směrodatnou odchylku (RSD) a intervaly spolehlivosti
pro retenční časy a plochy píků. Případné odlehlé hodnoty z vyhodnocování nezapomeňte
vyloučit.
Linearita – linearitu ověřte měřením 6 koncentrací standardu. Krajní koncentrace je
nutno volit tak, aby bylo možné určit dynamický rozsah metody – minimálně jeden kalibrační
bod u hladiny limitu detekce a jeden nad hranicí linearity. V našem případě sestrojte
kalibrační křivky v rozsahu koncentrací 0,001 – 1 mM a z koeficientů determinace určete, zda
je závislost lineární ( kritická hodnota koeficientu determinace je 0,999).
Limit detekce a kvantifikace: Z předchozího měření sestrojte závislost výšek píků na
koncentraci standardů a pomocí směrodatné odchylky šumu vypočtěte příslušné parametry.
Analýza neznámého vzorku – proveďte analýzu neznámého vzorku a určete
koncentrace jednotlivých analytů nejprve odečtem z kalibrační závislosti (testování linearity)
a poté přídavkem 1 a 2 přídavků standardů. Proveďte test shodnosti získaných výsledků.
Vypracování protokolu
Měření testovací směsi – uveďte základní retenční charakteristiky píků včetně základního
statistického vyhodnocení (průměr, rozpětí, směrodatná odchylka, relativní směrodatná
odchylka, interval spolehlivosti + odlehlost bodů). Jako mrtvý čas použijte retenční čas
acetonu.
Analýza standardů - uveďte základní retenční charakteristiky píků včetně základního
statistického vyhodnocení (průměr, rozpětí, směrodatná odchylka, relativní směrodatná
odchylka, interval spolehlivosti + odlehlost bodů). Jako mrtvý čas použijte retenční čas
thiomočoviny.
Validace metody – uveďte vypočtené parametry i s jejich statistickým vyhodnocením
Analýza neznámého vzorku – uveďte stanovené koncentrace jednotlivých nukleosidů
v neznámém vzorku a srovnejte výsledky, získané různými postupy kvantifikace. Výsledky
okomentujte.
Doporučená literatura
Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi I. a II., Praha 2013
Eckschlager K., Horsák I., Kodejš, Z.: Vyhodnocování analytických výsledků a
metod, Nakladatelství technické literatury Alfa, Praha 1980