Souhrn předchozí přednášky •Genetické metody –mutageneze/“screen“ –komplementace –identifikace •Buněčný cyklus –Průběh a regulace BC –Synchronizace buněk –Mechanismy regulace párování –Homothalické kmeny • • • • Cvičení: 5.12., A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby Osnova přednášky •Regulace transkripce –při párování a sporulaci –Gal4 transkripční faktor •hybridní systémy •aplikace –modifikované kvasinkové hybridní systémy Regulace buněčných programů 800px-Yeast_lifecycle - haploidní buňky se mohou párovat (za vzniku diploidních buněk) - - diploidní buňky mohou sporulovat (za vzniku haploidních buněk, diploidní se nepárují) - - diploidní buňky indukují meiosu … (haploidní neindukují meiosu) - - sporulace závisí na C a N Signální dráha – a faktor Wang et al., Nature, 2004 Aktivace transkripce (čím více je signálu tj. a-faktoru, tím více se aktivuje transkripce specifických genů) Morfologické změny (aktin) a-specifický receptor haploid-specifické • Ren et al., Science, 2000 transkripce závislá na STE12 Funkce proteinů v průběhu párování/matingu Ren et al., Science, 2000 haploid-specifické a1, a2 + a1, a2 kódují transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (a-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu) a-spec.= MFa1,2 (a-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy) haploid spec.= … RME1 (reprimuje … vstup do meiosy) aSG ON aSG OFF haploid SG ON MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem a haploid a1, a2 a haploid a1, a2 aSG OFF aSG ON haploid SG ON a2 a1 diploid a1, a2 a1, a2 aSG OFF aSG OFF haploid SG OFF a2 a1 a2 a1 Regulace (transkripce) párovacího typu - jeden z nejvíce regulovaných promotorů u S.c. (2kb) je IME1 (induktor meoisy 1) - v haploidních buňkách je inhibován represorem RME1 (haploid SG) – přímá vazba na promotor + lncRNA (pokrývá IME1 promotor a brání aktivátorům) - v diploidních buňkách je RME1 a IME4AS reprimován a1-a2 represorem - IME4AS je antisense RNA – brání indukci meiosy v haploidních buňkách (v diploidních je reprimována – IME4 gen indukuje meiosu) - diploidní buňky mohou sporulovat (za vzniku haploidních buněk) - - diploidní buňky indukují meiosu … (haploidní nesmí indukovat meiosu) - - sporulace závisí na C a N van Werven a Amon, Phil. Trans. Roy. Soc., 2011 van Werven et al, Cell, 2012 Regulace sporulace (RNAi v kvasinkách) ade2 (červená barva) ukazuje haploidizaci heterozygotního diploida šipky ukazují vřecka se čtyřmi sporami - při vyčerpání živin na misce mohou (krajní) buňky začít meiotické dělení (diploidní S. cerevisiae) - meiosa je indukovana IME1 transkripčním faktorem (v ime1D se meiosa neindukuje vs. v pIME1 overexprimovaných buňkách je indukována meiosa i bez vyčerpání živin tj. 2% glukosa) a haploid a1, a2 aSG OFF aSG ON haploid SG ON a2 a1 Struktura promotorů Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …) -Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu (specifické pro kvasinky) - TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu boxu u bakterii) - UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences) - DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu) Represor na URS Aktivátor na UAS konstitutivní GALpath - Pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy) - všechny ostatní jsou indukovány růstem na galaktóze a reprimovány glukozou - GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2 - GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů Regulace metabolické dráhy galaktózy gal mutanty Různé kvasinky využívají různe cukry (viz přednáška o určování kvasinek) - GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2 - GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů - Gal80p se váže na Gal4p a reprimuje/inhibuje transkripci - Gal3p přemění galaktozu na induktor (váže se na Gal80p a blokuje vazbu na Gal4p) - GAL1 promotor je rychle indukovaný a velmi silný – 1000x se zvýší mRNA (až 1%) - používá se pro overexprese/nadprodukce proteinů - nesmí být přítomna glukosa ! Uetz and Finley, 2005 Regulace transkripce GAL genů Ren et al., Science, 2000 microarray po galaktose Transkripční aktivátor Gal4p Transkripční komplex CO Biotech (1995) p. 59 > Vznik 1-hybridních systémů - Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast) pro testování mutantních p53 (transkripční faktor) Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat … Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny) Oncology Reports (2008) p. 773 mut p53 (duplikace 30bp) kvasinka opravila Ade2 reporter gen UAS transkripce p53 wt Ade2 reporter gen UAS p53 mut - stanovení aberací p53 v klinickém materiálu - imunoanalýza, FISH, sekvenace TP53 - určení funkčního statutu - stanovení transaktivačích schopností p53 metodou FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast) - stanovení transaktivačních vlastností p53 prostřednictvím speciálně upraveného kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae yIG397 Analýza funkčních vlastností p53 luciferáza D-luciferin + O2 oxyluciferin + světlo Toxikologické aplikace 2-hybridní systém His3 His3 His3 MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii + reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA) plasmid (TRP1) plasmid (LEU2) Nature (2000) p. 623 Y X DBD AD Mat a buňky 8x12 jamek (96 na misku) Všechny ORF Mat a buňky Y X Reporter gen GAL1 UAS transkripce DBD AD Kvasinkový „INTERACTOME“ Reversní systém (Y2H) - při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374 Split-hybrid systém page4-split-hybrid PNAS (1996) p. 13896 represor bez represoru Klasický dvojhybridní systém Trojhybridní systém – heterotrimerní proteinové komplexy - posttranslační modifikace Trojhybridní systém - proteinový inhibitor interakce Trojhybridní systém – RNA interakce - ligand/receptor Analýza vazby protein-RNA (Y3H) PNAS (1996) p. 8496 FEBS letters (2004) p. 7 Vazba ligand-receptor (Y3H) FK506 PNAS (1996) p. 12817 dexamethasone glucocorticoid receptor - FKBP12 Dihydrofolát reduktása/methotrexát Aktivní DHFR je vytvořena propojením dvou separovaných částí enzymu – odbourává pro kvasinky toxický methotrexát Science (2008) p. 1465 CytoTrap 2-hybridní systém Kvasinkový cdc25-2 ts mutant - hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti - jeden partner je myristylován a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k hSOS Cell growth Cur Biol (1998) p. 1121