Kvasinky a biotechnologie Jana Kopecká 223187@mail.muni.cz Biotechnologie „klasická“ x rekombinantní http://distillers.tastylime.net/library/Introductiontoyeast/Introduction_to_Yeast.htm Úvod Odhad: 670 000 druhů kvasinek cca 30 druhů kontaminace výroby nápojů 800 známých druhů cca 20 druhů je průmyslově využíváno Rekombinantní biotechnologie • sekvenace S. cerevisiae v roce 1996 S. pastorianus v roce 2009 • snadná manipulace – podobné s bakteriemi (izolace mutantů, rychlost růstu, přítomnost plazmidu, …)mutantů, rychlost růstu, přítomnost plazmidu, …) • kultivace ve fermentoru • S. cerevisiae, „P. pastoris“, Yarrowia Lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, … Kvasinkové expresní systémy • vhodná posttranslační modifikace proteinů eukaryotního původu, ale trochu jiné struktury N-glykanů → glykozylace • možné připojení sekretorních signálů • podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou S. cerevisiae (1%), „P. pastoris“ (až 10%) • S. cerevisiae – eutropin (Lg Chemical), Hepatitis B vakcína (Glaxosmithkline), hirudin (Aventis), insulin (Novo-Nordisk) Kultivace „P. pastoris“ Komagataella pastoris • silný promotor pro alkoholoxidázu AOX – snadná indukce a regulace • vnesení genu holomogní rekombinací (stabilnější než pomocí• vnesení genu holomogní rekombinací (stabilnější než pomocí plazmidu) • postranslační modifikace (odstranění signálních peptidů, glykozylace, tvorba disulfidových můstků) • pro expresi velkých proteinů (>50 kD) Kultivace „P. pastoris“ • 3-stupňový proces: produkce biomasy (represe genové exprese) - glycerol adaptační fáze - glycerol produkční fáze – glycerol+metanol • nutná optimalizace!!!• nutná optimalizace!!! • sekretované i intracelulární proteiny • velké denzity při kultivaci • komerčně dostupný kit „P. pastoris Expression Kit“ (Invitrogen) Klasické biotechnologie • výroba piva • výroba vína • výroba pečiva• výroba pečiva • výroba lihovin • SCP = single cell protein (krmná biomasa) • využití převážně S. cerevisiae Různé typy piv = různé podmínky • slad • kvasnice • kvašení • doba zrání• doba zrání • … http://www.pivovary-lobkowicz.cz/nase-nabidka/ Plzeňský typ - Budvar www.budejovickybudvar.cz Český ležák http://pivni.info/minipivovary/531- minipivovar-novosad-harrachov.html Fáze přípravy piva • příprava mladina •• hlavní kvašení • dokvášení http://www.pivovarcernahora.cz/pivovar-a-okoli/jak-varime-nase-pivo/ Pivovarské kvasinky • technologicky odlišné druhy S. cerevisiae a S. pastorianus • allopolyploidní, hybridní původ – průmyslový kmen S. pastorianus Weihenstephan 34/70: 25 Mb, 2 subgenomy typ SC a SB, mt-genom typ SB, 36 chromozomů – laboratorní kmen S. cervisiae S288c: 12 Mb, 16 chromozomů • čistá kultura – vyrovnaný tvar (kulatý, oválný), stabilní vlastnosti Hlavní kvašení • dle typu piva – spodní kvašení 6-12°C – svrchní kvašení 17-25°C • zhruba 7 dní• zhruba 7 dní – (bílé kroužky, hnědé kroužky, flokulace a sedimentace kvasnic) Hlavní kvašení – spilka http://www.protext.cz/english/zprava.php?id=11708 Hlavní kvašení – CK tanky http://www.brewia.cz/index_4CZ.html http://www.holidaycheck.cz/fullscreen- Pivovar+Velk%C3%A9+Popovice+CK+tanky-ch_ub-id_1159333861.html Hlavní kvašení - flokulace • reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky) • !!na konci hlavního kvašení!! • usnadňuje filtraci piva • vliv složení média, genetické výbavy kmene (asi 33 genů), teploty, stavby a morfologie buňky… (Verstrepen et al., 2003, upraveno) FLO geny • geny FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FLO11, Lg-FLO kódují zymolektin (Smukalla a kol., 2008, upraveno) • gen FLO8 je transkripční aktivátor • umístění blízko telomer • nestabilní geny Lektinová hypotéza - flokulace • interakce lektinového typu (polysacharid – protein) • specifická vazba zymolektinu na povrchu buňky na manózovéna povrchu buňky na manózové zbytky v buněčné stěně sousední buňky • Ca2+ udržují správnou konformaci zymolektinové vazebné sítě, • !novější práce ionty Ca2+ jsou přímo zapojeny v uhlovodíkových vazbách (Miki a kol., 1982, upraveno) Flokulační fenotyp • Flo1 – manóza senzitivní – laboratorní kmeny • NewFlo – manózo/glukózo senzitivní – pivovarské kmeny– pivovarské kmeny – širší specifita zymolektinu – stacionární fáze růstu (Brauer et al. 2006, DOI 10.1534) Dokvášení • dle stupňovitosti piva • 3 a více týdnů za nízkých teplot (0,5-4°C) • sycení piva, dotváření chuti • CK tanky nebo ležácké tanky • autolýza kvasinek je nežádoucí• autolýza kvasinek je nežádoucí pivni.info http://www.zamberk.cz/Svatkydreva/2009/ Propagace kvasnic www.jackzthebrewer.com Propagace kvasnic Kvasná mikrobiologie, Tvrdoň a Bálešová,1982 www.destila.cz Pivovar Ježek Kvasná mikrobiologie, Tvrdoň a Bálešová,1982 Kontrola kvasinek • vitální barvení •• acidifikační test Kontaminace v pivovaru • bakterie (aerobní i anaerobní) • kvasinky, které nejsou využívány úmyslně a nejsou plně pod kontrolou – non-Saccharomyces: Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Dekkera, Hanseniaspora, Pichia, Rhodotorula, … omezená schopnost růstu a množení za anaerobních podmínek aomezená schopnost růstu a množení za anaerobních podmínek a zkvašování cukrů – Saccharomyces (wild yeast) – těžké odlišení produkce nežádoucích aromatických látek (fenolické), amylolytické vlastnosti – „killer kmeny“ Saccharomyces – toxin; usmrcení původního kulturního kmene – RD mutanty Saccharomyces – změny, ztráty či delece mtDNA Mikrobiologická „čistota“ Hutzler et al. 2012, EBC Symposium Vinařské kvasinky • „čisté kvašení“ kulturními kvasinkami – S. cerevisiae, S. bayanus • „spontánní kvašení“ – kvasinky z povrchu bobulí: Kloeckera, Hanseniaspora,– kvasinky z povrchu bobulí: Kloeckera, Hanseniaspora, Saccharomyces, Metchnikowa, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Rhodotula, Cryptococcus, Brettanomyces, Debaryomyces, Pichia, Candida… – nízká fermentační aktivita, ale na začátku kvašení dominují – tolerance jiných mikroorganizmů – Saccharomyces – schopnost dominovat Vinařské kvasinky • tolerance k SO2 • kvašení do 25°C po dobu 7-14 dnů • autolýza kvasinek přispívá k buketu vína • tolerance k alkoholu (11-14%) • nízká koncentrace zbytkových cukrů (2-5 g/l) • produkce žádoucích esterů • nízká produkce těkavých kyselin Vinařské kvasinky • nejčastěji diploidní, homozygotní a homotalické • chromozomové polymorfizmy (rekombinace Ty retrotranspozonů či subtelomerických oblastí) • geny PAU: adaptace na stresové podmínky při výrobě vína, jsou regulovány anaerobními podmínkami • jiný počet kopií genu než u laboratorních kmenů (převážně geny důležité pro kvašení: membránové transportéry, metabolizmus etanolu, geny pro rezistence, atd.) Fermentace vína Pekařské kvasinky • stálost technologických vlastností • aerobní metabolizmus • aglutinace a autolýza je nežádoucí Lihovarské kvasinky • melasové zápary • vysoká tolerance k alkoholu a teplotě • vysoká rychlost kvašení SCP (Single Cell protein) • S. cerevisiae - pro potravinářské účely sušení biomasy při vyšších teplotách → přísada do polévek, omáček, masných výrobků,… • pro krmivářské účely se využívá Saccharomyces ojediněle (většinou ke zkrmení nekvalitního droždí) • využití i rodu Candida - produkce min. 50% bílkovin v sušině, menší nároky na výživu a tolerance medií s vyšším obsahem solí Candida utilis, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. robusta, C. scottii, C. ingens, C. crusei, C. mogii, C. boidinii atd. • Vyjímečně i ostatní kvasinkovité mikroorganizmy jako Yarrowia lipolytica, Hansenula anomala, Hansenula polymorfa, Hansenula capsulata, “Pichia pastoris“ SCP • melasa – v současné době jen ve výjimečných případech • lihovarské výpalky • sulfitové výluhy (po výrobě celulózy)nebo hydrolyzáty dřeva • „Citrolouhy“ (po výrobě kyseliny citrónové) • syrovátka a další “odpady“ z potravinářské výroby, případně zemědělstvízemědělství • n-alkany • etanol, metanol – mohou být připraveny velmi čisté a získané SCP je nejvyšší kvality • SCP (bakterie, kvasinky) obsahuje 70-80%hm. čistých bílkovin • mikrobní biomasa se vyznačuje vysokým obsahem nukleových kyselin (především RNA). Jejich obsah je v korelaci s obsahem bílkovin a pohybuje se v rozmezí 8-15% sušiny. Max. denní dávka pro člověka je 2 g nukleových kyselin, což odpovídá asi 20 g mikrobiální biomasy Výroba potravinářské biomasy – SCP S. cerevisiae melasa + kukuřičný extrakt (odpad při výrobě kukuřičného škrobu) + anorganické látky Saccharomyces cerevisiae O2 30 – 34oC Kvasničné mléko Kultivace bez tvorby etanolu, jen produkce biomasy Odstředění na kontinuálních deskových centrifugách kalolis droždí zahuštění na odparkách rozprašovací sušárna suché, neaktivní droždí (přídavek do omáček, polévek, masných výrobků) Kde získat informace? • Saccharomyces Genome Database – www.yeastgenome.org • Gene Ontology Consortium• Gene Ontology Consortium – www.geneontology.org – genomové sekvence, ale i funkční informace o genech ve spojení s jejich aminokyselinovou sekvencí • odborné knihy a články Kde získat kvasinky? • NCTC National Collection of Type Culures (UK) • NCIB National Collection of Industrial Bacteria (UK) • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Německo) • CBS Centraalbureau voor Schimmecultures (Holandsko) • CCM Česká sbírka mikroorganizmů (Brno) • RIBM Výzkumný ústav pivovarský a sladařský (Praha) • CCDM Sbírka mlékařských mikroorganizmů • NCYC National Collection of Yeast Cultures (UK) • Pivní obchod OGAR Brno Identifikace a rozlišení kvasinek • produkční kmen x kontaminace • tolerance k teplotám (30 x 37°C) • mikroskopie, charakter růstu kolonií (pigment, selekční média)• mikroskopie, charakter růstu kolonií (pigment, selekční média) • využití cukrů • produkce nejrůznějších látek (diacetyl, pentadion, atd.) Identifikace a rozlišení kvasinek • provozní laboratoř analýzu DNA a PCR nedělá → spolupráce s výzkumnými ústavy, univerzitami • PCR a RFLP metody• PCR a RFLP metody – ITS region, HIS4 gen, … • RFLP mtDNA • karyotypizace Štěpení ITS oblast M 1 2 3 4 5 M – marker 1 – S. pastorianus RIBM 95 2 - S. cerevisiae RIBM 139 3 - S. cerevisiae DSM 70449T3 - S. cerevisiae DSM 70449T 4 – S. pastorianus DSM 6580T 5 - S. bayanus DSM 70412T RRL2 HIS4 – HindIII 1 2 3 M 1 2 3 M M – marker 1 - S. cerevisiae DSM 70449T 2 – S. pastorianus DSM 6580T Region RRL2, gen HIS4 2 – S. pastorianus DSM 6580T 3 - S. bayanus DSM 70412T mtDNA - RsaI • svrchní kmeny a vinařské kvasinky RIBM 45 V7 A3 V16 RIBM 145 RIBM 146 RIBM 153 RIBM 148 RIBM 156 DSM 70449 T A26 RIBM 86 A1 A22 A5 A21 RIBM 139 W 68 RIBM 95 RIBM 96 RIBM 79 100806040 RIBM 79 RIBM 77 DSM 6580 T RIBM SPK 9 RIBM 10 RIBM 75 DSM 70412 RIBM SPK 21 RIBM 4 RIBM 98 RIBM 3 RIBM 5 RIBM 111 RIBM 2 RIBM 140 RIBM 1 RIBM 22 RIBM 68 RIBM 9 RIBM 8 RIBM 12 RIBM 7 Ježek PP T S. cerevisiae - wine S. bayanus S. cerevisiae - top fermenting S. pastorianus - bottom fermenting RAPD • svrchní a vinařské kmeny kvasinek • Lachancea kluyveri „S. kluyveri“ RIBM 3 RIBM 4 DSM 6580T RIBM 5 RIBM 8 RIBM 7 RIBM 1 RIBM 10 RIBM 140 Ježek RIBM 77 RIBM 79 RIBM 68 W 68 RIBM 75 RIBM 22 RIBM 96 RIBM 45 PP RIBM 95 RIBM 111 RIBM 6 RIBM 98 RIBM SPK 9 RIBM 12 40 50 6020 70 80 90 10030 • Lachancea kluyveri „S. kluyveri“ • S. bayanus RIBM 12 RIBM 9 RIBM 2 RIBM 44 RIBM 139 RIBM 145 A2 V7 V16 DSM 70449T A5 A22 A21 RIBM SPK 10 RIBM SPK 11 A3 RIBM 146 RIBM 153 RIBM 156 RIBM 86 RIBM 147 PN A23 A26 RIBM 148 RIBM SPK 15 DSM 70412T RIBM SPK 21 S. cerevisiae - wine S. bayanus S. cerevisiae - top fermenting S. pastorianus - bottom fermenting