GENOMIKA PROTEOMIKA ^^^^ ^.«.«c,„,^ jan havliš : masarykova univerzita :: středoevropský technologický institut ::: mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin :: přírodovědecká fakulta, národní centrum pro výzkum biomolekul ::: oddělení funkční genomiky a proteomiky (S)©©@ Creative Commons: Uveďte autora-Neužívejte dílo komerčně-Zachovejte licenci 3.0 Česko License I. úvod do proteomiky : definice proteomu a proteomiky ■ ■ : postgenomová éra, genotyp vs. fenotyp SyiaDUS : přístupy současné proteomiky : expresní a diferenční proteomika : strukturní proteomika : funkční proteomika II- proteiny : vznik proteinů a jejich složení : vlastnosti proteinů :: tvar, polarita, náboj, reaktivita :: základní hierarchie struktury proteinu : transport a lokalizace : zánik proteinů III. expresní a diferenční proteomika : jak studovat proteom? : z čeho se proteom skládá? : kolik tam toho je? : a co na to má vliv? 2 další přednášky kurzu 14. a 21.10. 2013 : proteinové komplexy - doc. Paleček 11. a 18.11. 2013 : strukturní proteomika - doc. Marek 25. 11. a 2. 12. 2013 : bioinformatika - Mgr. Potěšil 9.12. 2013 : proteomické aplikace - doc. Zdráhal 3 : podzimní semestr BÍ5000 Bioinformatika I - nukleové kyseliny BÍ9060 Bioinformatika II - proteiny BÍ9061 Bioinformatika - cvičení C7250 Charakterizace proteinů hmotn. spektrometrií C7350 Charakterizace proteinů hmotn. spektrometrií - cvičení BÍ7528 Analýza genomických a proteomických dat CB070 Proteinová krystalografie C7895 Hmotnostní spektrometrie biomolekul : jarní semestr CG030 Struktura a funkce proteinových komplexů 4 úvod do proteomiky proč právě proteomika? : postgenomová éra :: jak se dostat k informacím, které neumíme genomicky číst : genotyp vs. fenotyp :: co vede od jednoho k druhému : proteomika :: aneb cesta od genu k proteinu a zpět : přístupy současné proteomiky :: exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů :: analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů :: diferenční proteomika :: analýza posttranslačních modifikací 5 genomika : studium funkce a struktury genomu Hans Winkler (1920): gen+(chromos)om : xpukia barva + acopci těleso (1888 H. W. Waldeyer) : yzvzá generace, potomek (1903 W. L. Johannsen) genom = kompletní dědičná informace organizmu (veškerá DNA, resp. RNA) : jaký je mezi nimi vztah na molekulární úrovni? genotyp <-> fenotyp :: štaci pouze genomika? 6 postgenomová éra : jak se dostat k informacím, které neumíme genomicky číst v databázích desítky milionů záznamů : unikátní záznamy (non-redundant databases) 19470700 cacacctatatgtatagctcaattctagataaaatatatagaaatggatcttgagaatcattttttttgtattcttttgttat gctccgaggaagaagataatatgaaaagagctttttagggtttatcattctccttgactttgcaaaacgtgaaatgtaaggca 19470500 tgttgctttttatacgtatcgcttcctacaataagttaacaatgcttcctcgtagaattgcaaaacatttgtggaccgtgatt ttcagtggcttctttgcagcagcttcttccttggaggactaatcaagacagaaatctgttcctctaaaaacgatcgccgttct 19470300 ttgacgagtcttgatctttagaatcaaatttataagggatcacgagatacacgtattaattattattttttttttttttgctt tcactcaaatgatggtgaaagttacaaagcttgtggcttcacgtccaattgtggtcttttgcgtcctggtaattctgctttct 19470100 atgattctacatttctactcatctcgttcttgtttttcaaatgatataattattgtgtgtatatcacccattcatgtatattt ttcctggtggttgttttcgagtgcatttggatctcaaattggcgaacaacaacggagaacctagtcaaagaggtcgcttcatt 19469900 caagtctagtttcggagattgaaaacatcggaaaatttacatatgccaagacaaacttatctacgatcggtttagcgagagtt caacaacgacactggttttacagagattcaaacacaggttgttaaaactaattacataaattcaattattcttagttattatc 19469700 tatataacattaactataattttatgttgttgttgttgttgttattattgttcttcagatcgcaccattgttgtttgtagctt gtctcacaagtttcgtacatcagtagggacggtctcatgttttcttacattgcagaatcaaacacaagtgtcgctgtttttgc 19469500 caagtcgtggagactacacttggtacactcaaaccgtggatcagttaactggtcgtcttaacgggaactcaacgaaatctcac tacagattggttccaagcagcacagagtaataactacactacagcctttgtaggaacgagcttgggaggagaagataacgags 19469300 gttagcttgtacagcaagaaaggtcttgtttctttagggtttccggttaagactttaaccgaagttttgaacagtttgaatct acatgtggacaaaggacgggacggtgcttgttcgtgaaggttcactgaatgattctttcttcatctccaatggctcgatttgc 19469100 ctccctctggtctcaatgcatccctgaaaattgcagttccagtggctacgaggtggagatcaaaagattaagataccaagctt gtttcgggcgttcctctggtaaatactgaaacatatttcactttgatgcagtaaaaatgcatcgacttgttgtttctcagctt 19468900 tttgccagagatacacactcatgtttcccaacaaaggaggagcaacacgcatcaagcaccaagcggaaaaggcaaaatatcas atttcttggcttcggttggcctgtatggtttgtgtggtttatgatgcaagcaacaaggagagagatgcatatgcgtgcaacgc 19468700 gcgacacaacaagctgagagaaagagcatgaacaagagtcaagcatttgcaaatgctagccacgatattagaggtgcccttgc ttgatatatgtcgtgatggagttaaacctggctccgacgtagacaccactctcaaccaagtgaatgtttgcgccaaggatttc 19468500 tctttagctttctcttatgcgttttcttcactttctctctaacagaaaattcttcctcatgttgttaaaattacagctctgct tgagcaaaatcgaaagcgggaagatgcagttagtggaagaagatttcaacttgtcgaaacttcttgaagacgtcatcgatttt 19468300 gaagaaaggggttgatgtagttttggatccgcacgatggctcggttttcaaattctcgaatgtacgaggggatagtggcagac aatcttgttagcaatgctgtcaagttcaccgtcgacgggcacattgcggtaagagcttgggctcagaggccaggttccaatac 194 68100 catatcctaaaggtgtgtccaagtttgtaaagagtatgttctgcaagaataaagaagagtcatcaacctacgagacagaaata caatgcaaacacgatggagtttgtgtttgaagtggatgatactggtaaagggatacctatggagatgcgtaagtcggtatttc 19467 900 agagaaacagctcaaggacaccaaggaactggtttagggctcgggattgtgcagtctttggtaagctactaaaacagaacacc taaatctagatggttttcatttgtggtctattattataggtaagattaatgggaggggagataagaatcaccgacaaggccat 19467700 gtttccaattcaatgttttattgacaacattagagtctcctccagtgagtgacatgaaagtgagacaggagatcgaagcaggí gccaaacctcgggctgactataaacacttcacttggaggtagcatgaatatacgtaacctgagtcctagattcaacaactgtc 7 genotyp vs. fenotyp : co vede od prvního k druhému genotyp tři fenotypy gen organizmus > transkript > protein > meta bol it 8 DNA TOARMAUEAULMEADATDIKAMENT v_) 1: nahraď mezerou všechny třípísmenné skupiny končící na L 2a: vystřihni všechny skupiny o počtu znaků < 4, začínají-li na A a končí R nebo T DNA TOARMAUEAULMEADATDIKAMENT 4 mRNA TOARJE MEADATDIKAMENT protein TOARJE MEADATDIKAMENT i TO JE MEDIKAMENT 9 2b: vystřihni všechny skupiny o počtu znaků < 7, začínají-li na A a končí R nebo T TOAR JE MEADATDIKAMENT i TOAR JE MEADATDIKAMENT 4 TO JE MEDIK 2c: vystřihni všechny skupiny o počtu znaků < 7, začínají-li na A nebo I a končí R nebo T TOAR JE MEADATDIKAMENT 4 TOAR JE MEADATDIKAMENT i TO JE MED 10 struktura genu promotor počátek transkripce 5X-UTR počátek translace místa sestřihu stop kodón T-UTR polyadenylační signál (3'-konec) čepička (5'-konec) proteomika aneb cesta od genu k proteinu a zpět regulace genové exprese regulace transkripce sestřih mRNA translační represe posttranslační umlčení směřování proteinů posttranslační modifikace předřazený zesilovač 5*-UTR, kódující oblast 3'-UTR 1 promotor exon 1 exon 2 exon 3 1 51 31 intron 1 intron 2 11 proteomika : studium funkce a struktury proteomu Marc Wilkins (1994) - prote(ins by gen)ome proteom = souhrn všech proteinů a jejich forem v buňce/tkáni : -om = velký/úplný soubor jednotek :: lipidom, glykom, metabolom, sekrétom... proteiny v buňce : enzymy, strukturní prvky, informační signály, zásoby, přenašeče proteinové komplexy : biologické stroje proteomika identifikace - PTM; aktivace, sestřih lokalizace - buněčná proteinová mapa interakce - přenos signálu, p. komplexy, p. soustrojí funkce aberace - mutace, alternativní skládání kvantita 13 základní charakteristiky proteinů z hlediska jejich studia : velmi široká škála fyzikálně-chemických vlastností : jsou jich řádově desítky tisíc druhů v jednom organizmu : mají velmi dynamické chování : metody jsou stále ve vývoji a metodika není triviální proč nestudovat proteiny genomicky? : post-translační modifikace - nejdou odhalit ze sekvence DNA : analýza lokalizace, funkce a interakcí též nejde ze sekvence DNA 14 proteiny 15 % nízkomolekulární látky 4% RNA 6% lipidy*^^ o° 2 % DNA polysacharidy 1 % 2 % význam proteomu : molekulárni odpoveď na vztah genotyp-fenotyp : určuje ostatní bio-omy 15 přístupy současné proteomiky získání proteinového materiálu : exprese in vivo : rekombinantní proteiny :: modifikace proteinu - značka separace proteinových směsí : izolace, purifikace : zjednodušení směsí identifikace proteinu : sekvenace : určení PTM 16 stanovení proteinu : relativní :: v porovnání k jinému stavu : absolutní :: počet kopií v daném stavu stanovení struktury proteinu určení interakčních partnerů : jiné proteiny : nízkomolekulární látky :: substrát, koenzym, moderátor u enzymů :: přenášené či skladované molekuly 17 expresní proteomika rozdíly ve fungování (za různých podmínek) :: různé sady proteinů :: regulace tvorby proteinů 18 funkční proteomika : organizace proteinů :: interakce proteinů :: funkce proteinů protein : proteinový komplex :: proteinové soustrojí 19 strukturní proteomika : struktura proteinů :: vztah mezi strukturou a funkcí proteomická bioinformatika : analýza proteomických informací :: získaných bioanalytickými metodami identifikované peptidy M»Tlijlialii^l £j. z nich odvozené proteiny analýza na úrovni peptidů proteolytické peptidy analýza na úrovni proteinů 1 neproteolytické peptidy identifikace analýza homologů kvantifikace analýza motivů 1Q% 36% PHD-prst rodina ATPáz bromodoména doména SAP PWWP doména Pí fyzikálně-chemické vlastnosti 19% genová ontológie Zn-prst typ C2H2 box KRAB doména Homebox proteinové domény 21 genomika a proteomika systémová biologie 22 proč proteiny? : stojí mezi genotypem a fenotypem : oddřou většinu práce v živém organizmu! :: metabolizmus, regulace, obrana, transport, struktura a pohyb genom : v zásadě statická entita :: změny spise nežádoucí : relativně jednoduchý proteom : dynamický systém :: radikální změny se změnou času a podmínek : složitý systém F-aktin nukleozom DNA oooo aktivátor hemoglobin buňka § (erytrocyt) 24 protein/peptid ~ bio(hetero)polymer : monomer - aminokyselina :: biogenní aminokyseliny (L-formy) a-amino-skupina a-kar boxy- H skupina bocni řetězec H,N obojetný ion {zwitter-iorí) 25 vztah mezi pKa a pH u aminokyselin (a peptidů/proteinů) pí, izoelektrický bod celkový náboj aminokyseliny (AK) : bežne :: Ala/A, Arg/R, Asp/D, Asn/N, Cys/C, Glu/E, Gln/Q, Gly/G, His/H, Ile/I, Leu/L, Lys/K, Met/M, Phe/F, Pro/P, Ser/S, Thr/T, Trp/W, Ty r/Y, Val/V : zvláštni značky Asx/B asparagin nebo asparagová kyselina Glx/Z glutamin nebo glutamová kyselina Xle/J leucin nebo izoleucin C( M) . T h3n-c-h r>_ H coo coo .1 .1 H,N-C-H H,N-C-H A ČH* v /°" V CHS CH, COO . T H»N-C-H CH, CH, COO COO H*N-C-H H3Ň—C—H MH—Č—CH, L. I K o • I HaN-C-H CH, Ô 27 klasifikace AK :: kyseliny a jejich amidy ::: Asp/D (pK = 3.7), Asn/N, Glu/E (pK = 4.3), Gln/Q :: alifatické :::Gly/G, Ala/A, Leu/L, Ile/I, Val/V :: aromatické ::: Tyr/Y, Trp/W, Phe/F :: báze ::: His/H (pK = 6.0), Lys/K (pK = 10.5), Arg/R (pK = 12. :: cyklické ::: Pro/P (pK = 11.0) :: hydroxyderiváty ::: Ser/S, Thr/T + Tyr/Y (pK = 10.0) :: sirné ::: Cys/C (pK = 8.2), Met/M vzácné :: Sec/U selenocystein, Pyl/O pyrrolyzin (prokaryota) :: AK vzniklé posttranslační modifikací (PTM) ::: hydroxyprolin a selenomethionin abiogenní aminokyseliny :: genetický kód 2.0 ::: syntetické aminokyseliny do syntetických proteinů ::: bioinženýrství alifatické multifunkční struktura aminokyselin : C-konec; kyselý :: =^> záporný náboj/polární : N-konec; zásaditý :: =^> kladný náboj/polární : boční řetězec :: široký rozsah vlastností ovlivnění fyz.-chem. vlastností a struktury proteinů a peptidů vysoká variabilita : složité chování : širší spektrum metod studia absorbance (UV), fluorescence náboj, polarita, Mr 3D struktura reaktivita, interakce velmi malé malé nepolární aromatické polární nabité kladně nabité 30 vznik peptidů/proteinů : proteiny :: biosyntéza ::: transkripce (DNA > mRNA) ::: translace (mRNA > protoprotein) ::: posttranslační změny (protoprotein > funkční protein) 5'-UTR | začátek transkripce DNA ukončení | T-UTR 31 exon 1 intron 1 exon 2 intron 1 exon 3 transkripce I pre-RNA 1 GU AG GU AG sestřih RNA mRNA 5^-čepička (^J) 1 2 poly(A) konec a biosyntéza ::: in vitro syntéza (NCL - native chemical ligation) 31 schéma transkripce negativníř. HTTTTT I I I I I I I I > ^^^^^^^^^^ 7 transkripce-► 3* RNA polymeráza dvoušroubovice DNA splétání pozitívníř. rozpletaní 32 vznik peptidové vazby peptidová vazba H I 0 H I +H3N-C-C I \ +H3N-C-[CJ- 0 O N aminokyselina 1 R2 O" aminokyselina 2 dipeptid H I // c-C I \ y ŕ_ PCP C A PCP doména C (Cy) NRPS PCP C A PCP peptidyl-S-PCP 44 posttranslační modifikace (PTM) proteinů : chemická modifikace aminokyseliny :: změna bočního řetězce nebo jeho derivatizace ::: deaminace Gin, racemizace Pro, hydroxylace Phe : modifikace primární struktura protoproteinu ::: aktivace {trimming) ::: sestřih {splicing) : význam PTM :: zacílení (lipoproteiny) :: stabilita (glykoproteiny) :: funkce (fosfoproteiny) :: řízení aktivity (kaspázy) 45 chemická modifikace aminokyseliny : velké množství (> 200) : nese funkci, ale nemusí (oxidace Met, Trp) (CH2) 3 zesíťo vá n í (cross-linking) : vznik můstků (S-S) : stabilitní funkce N (CH.) 4x Lys elastin 4xTyr pulcherosin 3x Lys kolagen 46 pyroglutamyl-acetyl-formyl-myristoyl- V H3N ® eooc oligosacharid (O-glykosylace) V OH i Ser, Thr oligosacharid (N-glykosylace) CONH2 Asn, Gin A 4-hydroxy-(> Tyr) fosforyl- metyl- y-karboxy- Y COO0 Asp, Cl li \=/ acetyl-metyl-y-hydroxy- v pyridoxal liponat biotin retinal ubiquitin ®NH3 Lys Cys SH Pro 3- hydroxy- 4- hydroxy- aktivace protoproteinu : odstranění signálních pep. : odstranění nefunkčních č. preproenzym > proenzym > enzym 48 proteinový sestřih : podobné jako u RNA (pre-RNA > mRNA) i-1 N-extein N > O/S přesun acyl inteirTp^ ■lí HX = HS-, HO- hx I^nii.. C-extein iix trans-thioesterifikace 1 tvorba sukcinimidu 0/S>N přesun acyl o HX transport a lokalizace proteinů cytoplazmatická dráha sekreční dráha standardní dráha bez signálu ©signální peptid (sekreční dráha) /j\ signální sekvence ^ (ER proteiny) signální skupina (lysozimální proteiny) fflSL^a-šroubovice sooc- - -LEDK ^\ signální peptid y) : krátké peptidy manoza-6-fosfát \ |\|-, GkOneC : intrastrukturní (sign. sekvence) nepolární region sekvence (4) ukončující transport (membránové proteiny) -H ©signální peptid ŕ mifnrhnnrlriální (mitochondrialni proteiny) ©signální sekvence (jaderné proteiny) q signální sekvence y. KKRK (peroxizomy) ©signální region (sekreční váčky) F KS - 3 signální region : souhra různých strukt. motivů : jsou rozpoznávány receptory : využití transferových proteinů 51 zánik proteinů zánik peptidové vazby : proteázy (proteolytické enzymy) :: vznikají proteolytické peptidy : peptidázy (karboxy-, amino-, dipeptidázy ) :: di- a tripeptidy a dále AK : přenos energie in vitro :: srážka (N2, He, Ar), záření (foton, e~) © 52 metabolizmus proteinů funkční protein proteazom peptidy •##)\(-~^ lysozom degradace aminokyseliny : dusíková bilance :: rovnováha :: 300-400 g denně : lysozom :: cca 40 hydroláz :: proteázy 53 funkce proteazomu 54 expresní a diferenční proteomika praktické základy exprese proteinů a rozdíly v n í : aktuální podmnožina proteomu definuje děje v živém systému :: jaké proteiny se aktuálně v systému vyskytují? :: kolik jich tam je? :: kde jsou? :: v jaké formě tam jsou? ::: volné, vázané v proteinových komplexech ::: strukturní, signální, zásobní, enzymy... :: a proč? : rozdíly v dějích v různých stavech živého systému :: podmnožiny proteomu různých stavů a jejich průnik 55 metabolom A regulace metabolizmu proteom aktuální podmnožina proteom u - sada proteinů posttranslační modifikace regulace translace transkriptom : čím je to dáno? : jak to zjistíme : co na to má vliv? posttranskripcni modifikace regulace transkripce genom 56 hypotéza (biologický problém) opakovatelný jev vs. šum předpoklad testování předpokladu (odpovídající empirická studie) instrumentální data model reformulovani modelu (nové poznatky) analýza interpretace syntéza a možná objev © testovaní modelu (odpovídající empirická studie) instrumentální data falzifikace justifikace (model biologického systému) 57 základní charakteristika bioanalytů : geny (génom) : mRNA (transkriptom) : proteiny (proteom) : nízkomolekulární látky (metabolom) : velmi široká škála fyzikálně-chemických vlastností : jsou jich řádově desítky tisíc druhů v jednom organizmu : jsou velmi dynamické : metody jsou stále ve vývoji a metodika není triviální 58 identita proteinu : čím je dána identita proteinu? primární struktura proteinu : alternativní sbalení (priony) : posttranslační modifikace terciární struktura proteinu : kvartérní struktura unikátní funkce proteinu : enzymová reakce : interakce s jinou molekulou 59 jak můžeme zjistit identitu proteinu? specificita : buď vydělíme protein ze směsi jiných proteinů : nebo to jde i ve směsi (specifická interakce) :: kontaminace separace : už ta závisí na individuálních vlastnostech proteinu :: není ale často dostatečně specifická : náboj, polarita, molekulová hmotnost/velikost : specifické interakce primární struktura : určení pořadí aminokyselin :: postupné odbourávání ::: enzymaticky (exoproteolýza) ::: chemicky (terminálni degradace) ::: fyzikálně-chemicky (štěpení peptidové vazby) :: hmotnostně-kombinatoricky ::: peptidové mapová n í/peptidová signatura :: fyzikálně ::: změna odporu při průchodu řetězce nanopórem terciární struktura : určení 3D struktury :: lokalizace jader/atomů ::: jaderný spin ::: distribuce elektronové hustoty ::: kryo-elektronová mikroskopie :: topologická analýza ::: vzdálenosti aminokyselin unikátní funkce proteinu : detekce unikátního produktu enzymové reakce : detekce vzniku unikátního komplexu : co má vliv na identitu/přítomnost proteinu? genomické vlivy pre- c : zapiš genu donor větvení akceptor exon :: mutace : převedení genetické informace :: chyba v transkripci :: chyba v translaci proteomické vlivy : úpravy proteinu :: náhodné či nežádoucí modifikace AK :: náhodná či nežádoucí proteolýza smyčka intronu metod icko-a na lytické vlivy : chyby v přípravě či analýze vzorku 63 forma proteinu : čím je dána forma proteinu? struktura : definuje funkci a interakce :: volný :: vázaný - kvartérní struktura, proteinový komplex lokalizace : definuje funkci 64 : jak můžeme zjistit formu proteinu? složení : separace a eventuální denaturace :: molekulová hmotnost, tvar... interakční partneři : stabilní ko-lokalizace separace na úrovní b. kompartmentů : co má vliv na formu proteinu? struktura obsah proteinu : čím je dáno množství proteinu? fyzický počet kopií proteinu : intracelulární :: různé formy ::: volný ::: proteinové komplexy ::: jiné supramolekulární struktury :::: jádro, b. membrány, b. organely : extracelulární :: ve mnohobuněčných organizmech v mezibuněčném prostoru :: exoproteo m/sekreto m 66 jak můžeme zjistit obsah proteinu? specificita separace primární struktura + další informace : množství AK :: absorbance, fluorescence : množství specifických peptidů :: iontočet terciární struktura + další informace : specifická interakce :: interaktant s vhodnými analytickými vlastnostmi ::: absorbance, fluorescence, scintilace, enzymová aktivita : nespecifická interakce 67 : co má vliv na obsah proteinu? genomické vlivy : transkripční aktivace :: promotor či zesilovač (enhancer), transkripční aktivátor : transkripční umlčování :: epigenetika (vtištění, metylace DNA, histonový kód...) :: dsRNA/střihač (tf/C£y>siRNA-komplex RISC, miRNA... proteomické vlivy : metabolizmus (katabolizmus) :: předčasné odstranění :: dislokalizace metodicko-analytické vlivy : chyby v přípravě či analýze vzorku 68 ... a jejich rozdíly : jak můžeme zjistit rozdíl obsah proteinu? :: relativní rozdíl :: absolutní rozdíl relativní vs. absolutní rozdíl : jen poměr signálů odpovídajících obsahu :: dva srovnávané stavy vs. třetí stav - standard 69 praktický příklad studie expresní proteomiky stanovení obsahu stafylokokového enterotoxinu H v potravinách Staphylococcus aureus : enterotoxiny A - V (SE, staphylococcal enterotoxirí) : exoproteom/sekretom S. aurea : spolu s proteázami a dalšími proteiny {cca 150; 58 stálých) : obsah SEH cca 0.4 - 12.0 nM, Mr = 25 210, pí = 5.65 Stafylokoková enterOtOXikÓza (SFP - staphylococcal foodpoisoning) : enterotoxiny - superantigeny :: aktivace imunitního systému > jeho selhání :: jen malé množství stačí na vyvolání reakce (~ |jg) 70 výskyt SEH v potravinách : masné výrobky : mléčné výrobky : cukrářské výrobky Ä : původně pouze v surovinách :: termostabilní, odolný vůči proteázám i změnám pH :: původce odstraněn, toxin zůstává 10 20 30 40 50 srovnání s jinými SE : menší obsah : srovnatelná toxicita P0A0LS/1-241 P0A0V2/1-2S7 P0Í552/1-266 P0A0L9/U241 P0A0L2I1-2S7 P01552/1-266 POAOLSfi-241 P0A0L2/1-257 P01S52/1-26Ô P0A0L&1-241 P0A0Ľ2/1-257 P015&2/1-26Ó P0A0L9/1-241 P0A0L2/1-257 PO f552/1-266 i IinkikI- -BfsIlBlísftsyak.........aeMBoMbBolMaI- - aygqB i |k|ta|t- • II d i HtIt tIpl vmgsIkse e t n e kdIp kkSehqItHJgIl. ko i y yyn - i |y|rlMshvi |i fHi|vi|tpnvla|sqpdpkpdeBBsIkfB. T^enmkvlIdo 70 BO 90 100 110 I lil e|i k|de i sgekdliIr- ■ ■ nqgdsg^—kMataMq!f|n|nM iM^f e|i eIhDQFL'jh r i. Fi • f to m SvVYNOL lIoIo -kI i . dÍy|':-|. Hl yB , y l|vfl i DQFL v fdl iíys i Kd|kLGn|ĎnvHe|kNk|l AD1y|d|yBvfBn| 130 140 ISO 160 170 103 H*le k i s eI..........i seIlHJtIln s e kIaqer v i :■ anvwv ■ i|ke t -. | i ii7 gBBaggtp|..........k r cmyggv|lhdn|r|te|kkvp i nlwlBkqn t v'FlE 1 117 hhjvfskktnd I nsmotdkp; CMYGGVT: HNG|q|dkySs|tvr|feHoNLLS - - f 1 60 47 hpf i k| 58 ekakt s8 nhvsa 120 I0ľ 11b 116 180 149 166 tb 174 D S1 TNKKI.VT 24 i Ll |ľ lolo- - ysntl|r| |p|dkfdqsky|mi 190 200 210 ■■ i k i |k JsdHB Jyk- - -Be i s elo qaIrBqeHŇBnsdvfIgkvor! oelD' lt|hHvknkB1efn- -n|pyet 220 230 ElDMKÍPRD YSFj 1 Y D 204 htsbpívnblfg224 1n|fvi«mmp i en - tf 129 240 250 i 205 lkée ■ • KO YE i DkBe| 225Iq1q- -YSNTL 230 IpIdKFDQSKY; 260 270 li;|dd i s h lov nIyIkkk . i n|enm-hjfbm^~-vd|i FASP :: specifické interakce ostatní metody ::: imunoanalýza : žádná separace :: artefakty (IEF) : nízká výtěžnost :: nespecifické ztráty 75 detekce SEH : primární a sekundární struktura :: UV-Vis detekce (IP-RPLC) :: tandemová hmotnostní spektrometrie (IEF, IP-RPLC, SDS-PAGE, 2D-PAGE) : terciární struktura :: imunoanalýza (SDS-PAGE) stanovení SEH : primární struktura :: SIL + hmotnostní spektrometrie (180, GIST, ICPL) ::: nereprodukovatelné < nespecifické procesy ve FASP : terciární struktura :: imunoanalýza (imunoblot) > konečná? 76 výsledky stud detekce SEH v modelovém vzorku : ano stanovení SEH v modelovém vzorku : ne > žádná aplikace v reálném vzorku : žádný model sekrece SEH v potravinách : žádná metoda stanovení SEH v potravinách metodické překážky : nereprodukovatelné stanovení SEH :: velmi nízký obsah > zásadní vliv nespecifických ztrát reseni? : jiná metoda separace (mod. FASP + RPLC-OT MS) : jiná metoda stanovení (GIST reduktivní metylace) existují sice obecné (expresně) proteomické postupy : ale nejsou univerzální :: nutnost hledat vždy přípatřičný postup