Laboratoř molekulární
patologie
Ústav patologie FN Brno
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
19.11.2014
Složení laboratoře
stálí členové
• Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
• Mgr. Květa Lišková
• Mgr. Lenka Pitrová
• Bc. Miluška Svitáková
• lab. Renata Hrabálková
studenti
• Mgr. Lenka Pitrová (disertační práce, DSP, PřF – 5. ročník)
• Mgr. Eva Kabáthová (disertační práce, DSP, PřF – 2. ročník)
• Bc. Johana Plch (diplomová práce, MS PřF – 3. ročník)
Přehled činnosti
1. rutinní analýzy
2. výuka
3. výzkumná činnost
1. Rutinní analýzy
Místo molekulárně biologických metod v patologii:
Schéma diagnostického postupu
Základní vyšetřovací metody v patologii:
morfologické vyšetření
Základní vyšetřovací metody v patologii:
Imunohistochemická analýza
• přítomnost a hladina proteinu
• lokalizace proteinu v buňce (jádro, cytoplasma, vazba na
membránu, …)
• počet/podíl pozitivních buněk
• výchozí materiál: formol-parafinový bloček
nádorový supresor p53 svalový protein dystrophin
Přehled rutinních analýz
1. fluorescenční hybridizace in situ - FISH
2. určení klonality B- a T-receptorů lymfocytů
(PCR)
3. imunobloting
4. funkční analýza p53
Účel analýz
• diagnostický
• prognostický
• prediktivní
1. Fluorescenční in situ hybridizace
(FISH)
Hybridizace
• tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a
komplementárních molekul nukleových kyselin
• založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA
Fluorescenční hybridizace in situ
FISH
Detekce DNA nebo RNA v intaktních
buňkách radioaktivními nebo
fluorescenčními sondami.
FISH 1: Detekce amplifikace genů
• Sonda specifická pro sledovaný gen a centromeru daného
chromozomu.
• Určuje se počet / poměr signálů sledovaného genu a signálů
odpovídajících počtu centromer = chromozomů.
• Např. amplifikace genu N-myc u neuroblastomů nebo genu cerbB2
(HER2/neu) u nádorů prsu.
Analýza amplifikace genu HER2/neu
IHC
FISH
Analýza amplifikace genu HER2/neu
Analýza amplifikace (FISH) a
exprese genu HER2 (IHC)
FISH 2: Detekce translokace
chromozomů
• Pro detekci se použijí dvě sondy značené odlišnými fluorescenčními
barvami. Každá sonda se váže k sekvenci jednoho z genů.
• Pokud je přítomný fúzní gen, vznikne směsný signál v důsledku
fluorescence sond navázaných v těsném sousedství.
• Většinou je translokována pouze jedna alela, proto lze vedle
pozitivního signálu zachytit i samostatné signály obou sond.
Detekce translokace chromozomů
• translokace t(14;18) u folikulárního lymfomu (FL)
• translokace t(8;14) u Burkittova lymfomu (BL)
• přestavba genu c-myc u Burkittova lymfomu (BL)
• translokace t(11;14) u lymfomu z buněk plášťové zóny (MCL)
• přestavba genu MALT u MALT lymfomů
• přestavba genu ALK u karcinomů plic
• translokace ALK/EML4 u karcinomů plic
• … a další
Detekce translokace t(8;14)
negativní jádra
pozitivní jádra
c-myc/IGH
Detekce přestavby genu c-myc
 zlomová sonda
Detekce přestavby genu c-myc
negativní jádra
zlomová
sonda
Detekce přestavby genu c-myc
pozitivní jádra
zlomová
sonda
2. Určení klonality B- a T-receptorů
Organizace genových segmentů kódujících řetězce BcR (Krejsek a Kopecký, 2004)
VH DH JH
VH-FR1 VH-FR2 VH-FR3 JHprimery
Určení klonality B- a T-receptorů
PCR analýza přeskupování subgenů IGH
Schématický diagram přeskupování subgenů IgH se třemi sadami
VH primerů a jedním JH primerem tvořící 3 multiplex PCR reakce
(Převzato z van Dongen et al., 2003)
Velikost produktů PCR:
• Reakce A (VH-FR1 + JH): 310-360 nt
• Reakce B (VH-FR2 + JH): 250-295 nt
• Reakce C (VH-FR3 + JH): 100-170 nt
• Reakce CF (vnitřní kontrola, část genu pro cystickou fibrózu): 500 nt
Určení klonality B- a T-receptorů
Postup analýzy
• izolace DNA (gDNA) z tkáně ve formol-parafinovém bloku
• měření koncentrace DNA na spektrometru
• multiplex PCR
• analýza produktů PCR elektroforézou v 8%
polyakrylamidovém gelu
• detekce produktů PCR barvením gelu pomocí GelRed
Pozitivní Negativní
A B C CF A B C CF A B C CF A B C CF
Pacient 1 Pacient2 Pacient 3 Pacient 4
500
300
200
100
3. Imunobloting
Imunohistochemická analýza
• přítomnost a hladina proteinu
• lokalizace proteinu v buňce (jádro, cytoplasma, vazba na
membránu, …)
• počet/podíl pozitivních buněk
• výchozí materiál: formol-parafinový bloček
Imunobloting
• detekce aberantních (např. zkrácených) forem proteinů
/hladiny proteinů
• výchozí materiál: čerstvě odebraná/zamražená tkáň
Porovnání IHC a IB
#38: 85% pozitivních jader #42: 30% pozitivních jader
Imunobloting
Imunobloting
• detekce aberantních (např. zkrácených) forem proteinů
/hladiny proteinů
• výchozí materiál: čerstvě odebraná/zamražená tkáň
• dystrofin
• calpain
KO 1 2 3
94
60
30
4. Analýza nádorového supresoru
p53: metodou FASAY
• CLL
• dětská onkologie
• vyšetření mutace v zárodečné linii
Funkční analýza p53 metodou FASAY
zdroje pozadí do 10%
• degradace RNA ?
• nepřesnost DNA polymerázy 3%
• alternativní sestřih 5%
• linearizovaný vektor pSS16  0,5%
Galerie mutantů p53: ts a cs
E286KY126C
A138VR110L
Y234C E286K
G266E
R283C
L344R
Galerie mutantů p53: ts a cs
E286KY126C
A138VR110L
Y234C E286K
G266E
R283C
L344R
2. Zapojení do výuky - PřF
• kurs Molekulární biologie nádoru (2 hod/týdně; 1 semestr)
- určeno především studentům PGS oboru Buněčná a molekulární
biologie (PřF) a studentům 4. a 5. roč. magisterského studia
oboru Molekulární biologie a genetika (od 2001/2002)
- otevřeno pro studenty PGS oborů Onkologie (od 2002/2003) a
Lékařská biologie (LF) (od 2006/2007)
• Speciální seminář z biologie nádorů (1 hod/týdně; 1 semestr)
• kurs Biologie nádorů pro nebiology aneb buněčná filosofie (2
hod/týdně; 1 semestr)
- otevřeno pro všechny studenty MU
Zapojení do výuky: LF
• přednáška „Molekulární patologie – 1“ v rámci kursu Patologie
(Doc. Křen, Prof. Hermanová)
• účast při výuce bakalářského studia (MUDr. Kyclová; Mgr. K.
Lišková): Molekulárně biologické metody v patologii
(praktikum)
3. Výzkumný program
IGA MZ NT/13784-4/2012
Komplexní analýza mutantů p53 u lymfoproliferativních
onemocnění (2012-2015; hlavní řešitelé)
IGA MZ NT/13519-4/2012
Časná identifikace CLL pacientů s dosud nevyselektovanými
mutacemi v proteinu p53 (2012-2015; spoluřešitelé)
Práce studentů
• Mgr. Lenka Pitrová (disertační práce)
- komplexní analýza molekulárních markerů (p53, ATM, cyklin
D1) u lymfomů (MCL, DLBCL)
• Mgr. Eva Kabáthová (disertační práce)
- analýza mutantů p53 s předčasně zařazeným terminačním
kodónem v kvasinkových (a lidských) buňkách
• Bc. Johana Plch (diplomová práce)
- analýza mutantů (teplotně senzitivních a s předčasně
zařazeným terminačním kodonem) nádorového supresoru p53