1
Bi5596
Moderní metody v ekotoxikologii
STUDIUM RNASTUDIUM RNA && DNADNA I.I.
Jak je izolovat a jak s nimi naklJak je izolovat a jak s nimi nakláádatdat
RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D.
sovadinova@recetox.muni.cz
podzim 2014
2
CÍLE PŘEDNÁŠKY
Co to je DNA a RNA
Jak je získáme
Jak je poznáme
Jak je rozeznáme
Jak modifikujeme
Jak je zkoumáme
3
Proces pProces přřenosu genetickenosu genetickéé informaceinformace
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
4
Centrální dogma molekulární biologie
http://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology#cite_note-crick1970-2
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY A JEJICHKYSELINY A JEJICH
STRUKTURA A FUNKCESTRUKTURA A FUNKCE
6
NK:NK: STRUKTURASTRUKTURA
nukleotidové
polymery
⇒⇒⇒⇒ nnukleotidukleotid:
1. dusíkatá báze
2. pentózový cukr
3. fosfátová skupina
Báze
(1.)
Nukleosid
(2.)
Nukleotid
(3.)
Adenin Adenosin AMP
Guanin Guanosin GMP
Cytosin Cytidin CMP
Thymin Thymidin dTMP
Uracil Uridin UMP
CH
O
HC
CH
OH
CH
CH2
O
OH
P OOH
OH
Báze
1
23
4
5
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
7
DNA:DNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
8
DNA:DNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
9
DNA:DNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
DNA:DNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
záporně nabitá ⇒ rozpustná ve vodě, naopak v ethanolu
se sráží (bílá barva)
denaturace ⇒ vysoká teplota, nízká iontová síla, silně
zásadité prostředí (obsah CG)
kyselé prostředí ⇒ hydrolýza glykosidových vazeb
stabilní ⇒ poločas rozpadu DNA asi 521 let (kosterní nález)
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/32799/title/Half-Life-of-DNA-
Revealed/
http://www.astronauti.cz/news/novy-objev-dna-prepisuje-historii-evoluce/
http://news.discovery.com/earth/weather-extreme-events/oldest-dna-bacteria-
discovered.htm
roztok v pufru při −20° nebo −70 °C ⇒ několik let, při 4 °C
⇒ několik týdnů
11
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
©© 20092009 Nature EducationNature Education All rights reserved.All rights reserved.
12
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
©© 20092009 Nature EducationNature Education All rights reserved.All rights reserved.
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
cukr: ribóza, báze: A, U, C, G
záporně nabitá ⇒rozpustná ve vodě,
naopak v ethanolu se sráží (bílá barva)
sekundární a terciární struktury
reaktivnější a flexibilnější, ale také
nestabilnější než DNA ⇒ roztok v pufru
při −20° stabilní pouze několik týdnů
citlivější k degradaci enzymů
14
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
K0041998-DNA_transcription_mechanism.mp4
15
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
(https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg)
TRANSLACE
K0026724-Translation.mp4
16
RNA:RNA: SStrukturatruktura && funkcefunkce
(https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg)
TRANSLACE
K0026724-Translation.mp4
17
GenBankGenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
- název místa, délka sekvence, typ molekuly (DNA/RNA),
nukleotidová sekvence
EntrezEntrez:
- prohledává všechny databáze asociované s NCBI
EMBLEMBL: http://www.embl.de/
- databáze Evropského bioinformačního institutu
http://molbiol-tools.ca/
- sekvence a jejich analýza
NK:NK: KdeKde najnajíítt sekvencesekvence??
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY A JEJICH IZOLACEKYSELINY A JEJICH IZOLACE
19
volba techniky záleží na:
1. typu izolované NK
• genomová DNA (chromozomální)
• satelitní DNA
• plasmidová DNA (extrachromozomální)
• fragment DNA v agarózovém gelu
• fagová (virová)
• RNA
2. typu a množství materiálu
3. požadované čistotě
4. požadovaném množství
5. následné aplikaci
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
20
HHüüttenhoferttenhofer et al. Nature Reviews Geneticset al. Nature Reviews Genetics advance online publication;advance online publication;
published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855
21
HHüüttenhoferttenhofer et al. Nature Reviews Geneticset al. Nature Reviews Genetics advance online publication;advance online publication;
published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855
22
RNA Purifi cation and Analysis: Sample Preparation, Extraction, Chromatography
Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornby
Copyright © 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
ISBN: 978-3-527-32116-2
23
Využívá se:
• odlišná rozpustnost
• adsorpční metody
• gradientová centrifugace (hustota)
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
Metody lze rozdělit na:
• Klasické v roztoku „organické“
• Klasické v roztoku „anorganické“
• Adsorpční na pevnou matrici
24
Organické látky
Základní kroky:
1. lýze buněk
2. přídavek enzymů
3. extrakce NK
4. precipitace
5. přídavek enzymů
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
KlasickKlasickéé vv roztokuroztoku „„organickorganické“é“
25
1. Lýze buněk
ALBERTS, B, D BRAY a A JOHNSON. Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-
902906-2-0.
26
1. Lýze buněk
ALBERTS, B, D BRAY a A JOHNSON. Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-
902906-2-0.
• detergenty (SDS, Triton X-100)
• organická rozpouštědla
• zásadité látky (NaOH)
• osmotický šok
• povaření
• chaotropní činidla
27
2. Přídavek enzymů
štěpení nechtěných složek v lyzátu:
• proteázy (např. proteináza K) proteiny
• nukleázy nechtěné NK
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-
center/nucleases.html
http://www.sigmaaldrich.com/life-
science/metabolomics/enzyme-
explorer/learning-center/protease-finder.html
28
fenol ⇒ organické rozpouštědlo
• vysoce čistý pro molekulární techniky, skladuje se
při -20°C
• sytí se Tris pufrem (pH 4: separuje se RNA; pH 7-8:
separuje se DNA) s EDTA a NaCl, skladuje se při 4°C
• oxidace snižuje účinnost izolace
• vysoce nebezpečná látka (hořlavá, korozivní a toxická)
výhody:
• jednoduché provedení
• lehce modifikovatelné
• rozmezí objemů: 40 µl až několik ml
aplikace: genomová DNA s vysokou molekulovou hmotností
2. Extrakce NK
Fenol-chloroformová extrakce
29
postup:
• 1 objem vzorku : 1 objem fenolu
• důkladně obě fáze smíchat
• centrifugace ⇒ NK v ve vodné fázi a
proteiny v organické („fenolové“)
modifikace:
• směs fenol:chloroform:isoamyl
alkohol (25:24:1)
• Trizol® ⇒ monofázický roztok fenolu a
guanidin thiokyanátu izoluje NK v
přítomnosti chloroformu
nevýhody:
• časově náročné
• nebezpečí kontaminace
• nebezpečné chemikálie ⇒ digestoř
VODNÁ
FÁZE
RNARNA
ORG.
FÁZE
ProteinyProteiny
DNADNA
ProteinyProteiny
pHpH
44--6 76 7--88
VODNÁ
FÁZE
DDNANA, RNA, RNA
ORG.
FÁZE
INTERFINTERFÁÁZEZE INTERFINTERFÁÁZEZE
30
2. Extrakce NK
Alkalická extrakce
selektivní alkalická denaturace (NaOH) vysokomolekulové
chromozomální DNA oproti plazmidové DNA v přítomnosti
SDS
aplikace: plazmidová DNA
31
ethanol, isopropanol, PEG, soli ⇒ vysráží NK z roztoku
postup:
• 2 objemy vzorku : 2-2,5 objemu ethanolu
nebo
• 1 objem vzorku : 1 objem isopropanolu
• inkubace při -20°C (min. 2 h)
• centrifugace
• oplach 70% etanolem (odstranění solí)
• rozpuštění ve vodě nebo pufru (TE pufr o pH 7,5)
vysrážené NK
4. Precipitace NK
štěpení nechtěných složek v lyzátu:
• nukleázy nechtěné NK
5. Přídavek enzymů
32
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
KlasickKlasickéé vv roztokuroztoku „„anorganickanorganické“é“
1. Lýze buněk ⇒ SDS
2. RNA odstraněna
RNázami
3. Proteiny precipitovány
v koncentrovaném
roztoku solí
4. DNA precipitována
ethanolem a
rehydratována
33
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
AdsorpAdsorpččnníí na pevnou matricina pevnou matrici
adsorpce NK na pevnou fázi záleží na pH a
obsahu soli v roztoku
pevná fáze: silikát, silikagel, skleněné kuličky,
křemelina a nosiče aniontů
Kroky:
1. Lýze buněk
2. Adsorpce NK na pevnou fázi
3. Oplach
4. Vymytí
1. Lýze
2. Přidání chaotropních solí a protřepání se silikátovými
částicemi
3. Centrifugace a oplach navázané NK roztokem
chaotropních solí
4. Přidání vody či pufru ⇒ eluce
5. Centrifugace ⇒ NK v roztoku
34
NK v přítomnosti chaotropních solí (jodid sodný, guanidinové
soli) adherují na silikátový povrch (na sklo)
1. Adsorpce na silikát
35
lyzát buněk se přidá na kolonky se speciálními membránami
(silikát) vázajícími NK v přitomnosti chaotropních solí,
následuje vymytí NK pufrem s nízkým obsahem soli
rozpuštěná NK se vysráží ethanolem a naváže se v pufru s
vysokým obsahem soli (pH < 7) a eluuje v pufru s nízkým
obsahem soli (pH > 7)
2. Kolonky založené na adsorpční chromatografii
1. Lýze
2. Navázání
3. Oplach
4. Vymytí
36
3. Magnetické částice
magnetické silikátové částice ⇒ NK se váží při vysoké
koncentraci chaotropních solí
magnetické silikátové částice váží při vysoké koncentraci
solí i kratší NK a eluují při nízké
37
4. Iontoměniče
resin ⇒
interakce mezi negativně nabitými fosfátovými skupinami
NK a pozitivně nabitými molekulami zvoleného povrchu
(např. DEAE, diethylaminoethyl)
vazba i eluce při různých koncentrací solí a pH dle
izolované NK
5. FTA® Technology
„fast technology for analysis of nucleic acids“
39
opakované použití enzymů a opakovaná extrakce
fenolem
zákaz natahování a napínání v opačném směru a
vortexování
několika hodinová fenolová extrakce za pomalého
míchání
po vysrážení DNA ethanolem dojde k namotání
DNA
NK:NK: IZOLACEIZOLACE
SpecifickSpecifickéé aplikaceaplikace && modifikacemodifikace
1. Izolace vysokomolekulární chromozomální DNA
(www.tulane.edu
/~wiser/methods/
notes.pdf)
40
inaktivace stabilních Rnáz ⇒ inhibitory (RNasin, RNaseOUT),
detergenty, DTT, merkaptoethanol
DNáza bez přítomnosti RNáz
selektivní precipitace: LiCl, acetát amonný
nestabilní ⇒ dlouhodobě uchovávat vysráženou v 70% etanolu při
-20°C nebo při -80°C
selektivní precipitace: LiCl, acetát amonný
Organická extrakce v roztoku:
lýze buněk a solubilizace RNA v guanidinových solích (guanidin
thiokyanát-fenol-chloroform)
fenol saturovaný pufrem o pH 4
Trizol®, Tri reagent ⇒ monofázický roztok fenolu a guanidin
thiokyanátu izoluje RNA v přítomnosti chloroformu
2. Izolace RNA
Selektivní precipitace LiCl:
- vysráží selektivně delší RNA (rRNA, mRNA)
- postup: 8M LiCl (1:1), promíchání, inkubace při 20°C a
centrifugace
Afinitní chromatografie:
- kolonky s oligodT pro mRNA
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
42
Magnetické částice nesoucí oligodT:
http://www.lifetechnologies.com/cz/en/home/life-science/dna-rna-
purification-analysis/napamisc/mrna-isolation-dynabeads.html
43
3. Gradientová centrifugace (hustota)
hustota v CsCl: DNA ~ 1,7 g/cm3
proteiny ~ 1,3 g/cm3
RNA > DNA
ssDNA > dsDNA
http://biochem1362blog.wordpress.com/
44
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY A JAK S NIMIKYSELINY A JAK S NIMI
PRACOVATPRACOVAT
46
dekontaminace a sterilizace pracovních ploch UV zářením,
čerstvým 10% roztokem bělidla (SAVO) a komerčním roztokem
pro inkativaci RNáz (např. RNaseZapTM), DNáz a NK (např.
DNAZapTM)
používat pouze vodu pro molekulární biologii („molecular grade
water“)
sklo – omýt detergentem a vodou a sušit při vysoké teplotě
(350°C/2 h)
plast – garantované bez RNáz/DNáz a DNA/RNA nebo
autoklávovat
nosit rukavice a často je měnit
používat špičky s filtry
NK:NK: PRACOVNPRACOVNÍÍ PODMPODMÍÍNKYNKY
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY AKYSELINY A
JAK JE STANOVITJAK JE STANOVIT
50
SPEKTROFOTOMETRICKYSPEKTROFOTOMETRICKY
DNA A260 1,0 ~ 50 µg/ml (dsDNA)
1,0 ~ 33 µg/ml (ssDNA)
A260/A280
A260/A230
1,6 – 1,8
2,0 – 2,2
RNA A260 1,0 ~ 40 µg/ml
A260/A280
A260/A230
~2,0
2,0 – 2,2
VLNOVÁ DÉLKA ODEZVA KOMENTÁŘ
215-230 nm
*NK absorbují minimálně
*Peptidová vazba v proteinech absorbuje
Měření nejsou při této délce prováděny, protože obecně
používané pufry a solventy (např. Tris) také absorbují při
těchto vlnových délkách.
260 nm *NK absorbují maximálně
Puriny absorbují maximálně při vlnové délce mírně pod
260 nm; pyrimidiny kolem 260 (mírně nad). Puriny mají
vyšší molární absorptivitu než pyrimidiny. Maximum
absorbance a absorptivity záření úseku RNA/DNA proto
závisí na přítomných bází. Proteiny absorbují pouze slabě
při této vlnové délce.
270 nm * Fenol absorbuje silně
Fenol může být kontaminant ve vzorku izolovaných NK.
280 nm *Aromatické aminokyseliny absorbují NK také absorbují při této vlnocé délce.
320 nm *Ani proteiny ani NK neabsorbují
Používá se jako pozadí, když ani NK, ani proteiny
neabsorbují.
NK:NK: KVANTITAKVANTITA && KVALITAKVALITA
51
-NanoDrop® ⇒ UV/Vis spektrum vlnových délek (220-750
nm), 1 µl vzorku bez ředění (3700 ng/µl dsDNA)
52
FLUORESCENFLUORESCENČČNNĚĚ
- vzorky s nízkou koncentrací
nebo kontaminované
- fluorescentní barvy: ethidium
bromid, Ribogreen, QuantiFluor®
RNA Systém, PicoGreen
Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013
53
Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013
5454
HORIZONTHORIZONTÁÁLNLNÍÍ ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZOU V AGARZOU V AGARÓÓZOVZOVÉÉMM
GELUGELU
- kvalita a integrita
- barvení ethidium bromidem nebo dalšími fluorescenčními
barvami pro NK ⇒ vizualizace UV světlem
http://worldwide.promega.com/resources/pubhub/methods
-of-rna-quality-assessment
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-
_Kitner_-
_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf
http://worldwide.promega.com/products/pm/genomics/rnasin
55
1.1. TrizolTrizol (12(12 µµµµµµµµg)g)
2.2. TrizolTrizol (24(24 µµµµµµµµg)g)
3.3. RNeasyRNeasy (12(12 µµµµµµµµg)g)
4.4. InvisorbInvisorb II (12II (12 µµµµµµµµg)g)
5.5. InvisorbInvisorb II (24II (24 µµµµµµµµg)g)
6.6. InvisorbInvisorb Spin (12Spin (12 µµµµµµµµg)g)
7.7. InvisorbInvisorb Spin (24Spin (24 µµµµµµµµg)g)
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY AKYSELINY A
JAK JE ZJAK JE ZÍÍSKAT DOMASKAT DOMA
57
• Homogenizace kousku jater (5-10g) v 10% roztoku kuchyňské soli
a vysrážení DNA alkoholem
• Pomůcky: talířek, vidlička, nůž, solnička, slivovice (55-65%),
kuchyňské cedítko (hrubé plátno)
• Postup:
- kousek jater zhomogenizovat pomocí vidličky
- zalít přiměřeným objemem 10% NaCl – popraskání stěn
buněk, uvolnění DNA do roztoku
- filtrace přes plátno
- přídavek etanolu = vysrážení DNA v podobě bílé hmoty
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_-_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf
NK:NK: ReceptRecept dodo domdomááccíí kuchakuchařřkyky
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/
http://www.youtube.com/watch?v=DBb1utQBlY4
58
NK:NK: ReceptRecept dodo domdomááccíí kuchakuchařřkyky
• Homogenizace jahod v roztoku detergentu a NaCl
• Pomůcky: igelitový sáček, vidlička, JAR,
solnička, slivovice (55-65%), hrubé plátno nebo
kuchyňské cedítko
• Postup:
- jahody zhomogenizovat pomocí vidličky
s přídavkem pár kapek soli a detergentu
(JAR, PUR… = popraskání stěn buněk,
uvolnění DNA do roztoku)
- Filtrace přes plátno
- Přídavek etanolu = vysrážení DNA v
podobě bílé hmoty
http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_-
_Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf
http://www.youtube.com/watch?v=UDKm9rZbhyI
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY AKYSELINY A
JAK JE SEPAROVATJAK JE SEPAROVAT
60
NK:NK: ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZAZA
HORIZONTHORIZONTÁÁLNLNÍÍ AGARAGARÓÓZOVZOVÁÁ (polymer z agarosa = agarobiosa)
VERTIKVERTIKÁÁLNLNÍÍ POLYAKRYLAMIDOVPOLYAKRYLAMIDOVÁÁ (PAGE,(PAGE, polymer z
akrylaminu zesíťovaný N,N‘-methylenbisakrylamidem)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
61
NK:NK: ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZAZA
HORIZONTHORIZONTÁÁLNLNÍÍ AGARAGARÓÓZOVZOVÁÁ (polymer z agarosa = agarobiosa)
VERTIKVERTIKÁÁLNLNÍÍ POLYAKRYLAMIDOVPOLYAKRYLAMIDOVÁÁ (PAGE,(PAGE, polymer z
akrylaminu zesíťovaný N,N‘-methylenbisakrylamidem)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
62
NK:NK: ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZAZA
HORIZONTHORIZONTÁÁLNLNÍÍ AGARAGARÓÓZOVZOVÁÁ (polymer z agarosa = agarobiosa)
VERTIKVERTIKÁÁLNLNÍÍ POLYAKRYLAMIDOVPOLYAKRYLAMIDOVÁÁ (PAGE,(PAGE, polymer z
akrylaminu zesíťovaný N,N‘-methylenbisakrylamidem)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
63
NK:NK: ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZAZA
HORIZONTHORIZONTÁÁLNLNÍÍ AGARAGARÓÓZOVZOVÁÁ (polymer z agarosa = agarobiosa)
VERTIKVERTIKÁÁLNLNÍÍ POLYAKRYLAMIDOVPOLYAKRYLAMIDOVÁÁ (PAGE,(PAGE, polymer z
akrylaminu zesíťovaný N,N‘-methylenbisakrylamidem)
⇒ hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než
delší fragmenty – „molekulové síto“
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
64
5-10 ng DNA
agarózová elektroforéza ⇒
100 bp až 20 kb
polyakrylamidová
elektroforéza ⇒ malé NK a
oligonukleotidy
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
ALBERTS, B, D BRAY a A JOHNSON. Základy buněčné biologie. 2.
vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-902906-2-0.
VIZUALIZACE SEPAROVANVIZUALIZACE SEPAROVANÝCH NK V GELUÝCH NK V GELU
•••••••• agarózový gel ⇒ ethidium bromid, SYBR Green I
•••••••• polyakrylamidový gel ⇒ ethidium bromid, stříbro,
radioaktivita, kovalentně navázané fluorescenční sloučeniny
http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular-
weight_size_marker#mediaviewer/File:DNAgel4wiki.png
co ovlivco ovlivňňuje migraci NKuje migraci NK::
- velikost pór, napětí, iontová síla roztoku a koncentrace
fluorescenční barvy, pokud použita v gelu
- velikost NK ⇒ menší rychleji
- konformace DNA
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
KAPILKAPILÁÁRNRNÍÍ GELOVGELOVÁÁ ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZA (CGE)ZA (CGE)
PULZNPULZNÍÍ GELOVGELOVÁÁ ELEKTROFORELEKTROFORÉÉZA (PFGE)ZA (PFGE)
„Contoured-Clamped
Homogeneous Electric Field“
• separace velkých molekul
DNA (až 10 Mb)
• i celé buňky
• genotypování, genetický
otisk („fingerprint“),
epidemiologie pathogenních
organismů
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
DGGEDGGE & TGGE& TGGE ((““DenaturingDenaturing/Temperature/Temperature Gradient GelGradient Gel
ElectrophoresisElectrophoresis””))
⇒⇒⇒⇒ Separace na základě odlišnosti tání DNA fragmentů
• posloupnost nukleotidů
• obsah GC párů
• ovlivňují průběh tání fragmentu DNA a následně rychlost
migrace v denaturačním gradientu (zvyšující se teplota,
nebo koncentrace denaturantů)
www.wikiskripta.eu/index.php/DGGE
http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_11.htm
SSCPSSCP ((““SingleSingle--strandstrand conformationconformation polymorphismpolymorphism””))
⇒⇒⇒⇒ Separace na základě odlišnosti tání DNA fragmentů
• bodová mutace
http://www.lf2.cuni.cz/projekty/prusa-
DNA/newlook/defa7.htm
http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecu
lar/index_11.htm
NK:NK: IZOLACE Z GELUIZOLACE Z GELU
http://webcast.skola-profession.cz/Pages/Player.aspx?id=41
AGARÓZOVÝ GEL
• elektroeluce
• vazba a eluze ze skleněných nebo silikátových kuliček
• elektroforéza na DEAE-celulózovou membránu
• agaróza s nízkou teplotou tání
POLYAKRYLAMIDOVÝ GEL
• metoda “crush and soak”
http://www.peqlab.co.uk/wcms/uk/products/index.php?do=getArticlesByGroup&which=Gelex
NUKLEOVNUKLEOVÉÉ KYSELINY AKYSELINY A
JAK JE MODIFIKUJEMEJAK JE MODIFIKUJEME
73
Enzymy modifikujEnzymy modifikujííccíí NKNK
- polymerázy ⇒ syntetizují NK dle
templátu
- ligázy ⇒ spojují fragmenty DNA
- fosfatázy a kinázy ⇒ defosforylace
a fosforylace
- nukleázy ⇒ štěpí fosfodiesterovou
vazbu; exonukleázy a endonukleázy
PPřřííklady nukleklady nukleáázz::
Bal31 3’-exonukleáza pro ds nebo ss DNA
S1 5’-exonukleáza pro ssDNA nebo ssRNA
DNáza I ss nebo dsDNA (5’, pyr)
ExoIII 3’-exonukleáza pro dsDNA
RNáza A endonukleáza pro ssRNA (3’, pyr)
RNáza T1 Endonukleáza pro ssRNA (3’, G)
NK:NK: MODIFIKACEMODIFIKACE
75
RestrikRestrikččnníí endonukleendonukleáázyzy::
⇒ štěpí DNA na specifických místech
⇒ Třída II: štěpí DNA v rozpoznávacím místě
(4-8 nukleotidů), palindrom
GENETICKÝ OTISKGENETICKÝ OTISK
Biopedia.org
(PCR/)RFLP (Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) ⇒
restrikční analýza DNA
• gDNA naštěpíme restriktázou
• Fragmenty rozdělíme elektroforeticky
• Z gelu je přesajeme na membránu
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
• Navázanou sondu detekujeme
NK:NK: MAPOVMAPOVÁÁNNÍÍ
Biopedia.org
(PCR/)RFLP (Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů) ⇒
restrikční analýza DNA
• gDNA naštěpíme restriktázou
• Fragmenty rozdělíme elektroforeticky
• Z gelu je přesajeme na membránu
• Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot
• Navázanou sondu detekujeme
NK:NK: MAPOVMAPOVÁÁNNÍÍ
o genetické mapování
o dědičné onemocnění
o kriminalistika
o určení otcovství
(PCR/)T-RFLP (Terminální polymorfismus v délce restrikčních
fragmentů) ⇒ restrikční analýza DNA
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Step-by-step_procedure_of_using_T-
RFLP_analysis_in_microbiology.pdf
• Autozomální mikrosatelity („Short Tandem Repeats“, STRs)
⇒ nekódující čtyřnukleotidové tandemově se opakující repetice
• VNTR (variabilní počet tandemových opakování) ⇒ polymorfismu
repetitivních úseků DNA
• Variabilita v populaci je délková, daná počtem repetic
AFLP („Amplified fragment length polymorphism“)
http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047
https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&id=47:aflp-
princip&catid=35:aflp&Itemid=55
OTISK MIKROBIOTISK MIKROBIÁÁLNLNÍÍHO SPOLEHO SPOLEČČENSTVAENSTVA
Stanovení profilu diverzity mikrobiálního
společenstva pomocí technik mol. biologie
Odhad množství variant genu ve společenstvu
Celkový pohled na společenstvo, neřekne nic o
přímé identifikaci nebo počtech individuálních
buněk
Studium mikrobiálních systémů (vodní
ekosystémy, půdy, lidská mikroflóra) - měření
biodiverzity, změny ve společenstvu v čase, vliv
faktorů..... sukcese společenstva, environmentální
narušení habitatu, odpověď na znečištění
polutanty
www.moloch.upol.cz/uploads/vyukovy-portal/eko-mem-rulik.pdf
• DGGE, TGGE, SSCP, RFLP,T-RFLP, ARDRA, ARISA
• Izolace DNA z environmentálního vzorku
• Cílem analýzy je gen nebo specifický úsek DNA
• Častým cílem geny kódující 16S rRNA nebo geny, které
mají klíčovou roli v metabolických procesech
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-
27912008000200004&script=sci_arttext
ARDRA („Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis“)
• restrikční štěpení amplifikovaného fragmentu DNA pro
konzervativní úseky rRNA bakterií
http://entamoeba.lshtm.ac.uk/riboprnt.htm
RISA/ARISA („(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis“)
• prokaryocká DNA kodující vysoce konzervativní 16SrRNA a
23SrRNA geny
• mezi těmito dvěma geny se nachází tzv. „internal transcribed
spacer (ITS)“ region
• ITS - nekoduje proteiny, vysoce variabilní v sekvenci a délce
nukleotidů
http://en.wikipedia.org/wiki/Community_Fingerprinting