Pavel Babica
 Finální produkt genové exprese Finální produkt genové exprese
Proces přenosu genetické informaceProces přenosu genetické informace
(www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf)
80 Voda
60
70
DNA
40
50
bsah
RNA
20
30
40
%ob
Proteiny
Polysacharidy
0
10
20 Polysacharidy
Fosfolipidy0
Celkem Suchá
Hmotnost
Ionty, malé
molekulyHmotnost molekuly
Alberts et al. (1998): Základy buněčné biologie
 Katalýza – enzymy
◦ Metabolismus – energetický (RuBisCo, pepsin), detoxikace (cyt P450)
◦ Syntéza makromolekul – DNA polymeráza, reverzní transkriptáza
◦ Signálování a regulace – acetylcholinesteráza, proteinkináza C, HAT/HDAC …
 Strukturní funkce – mechanická opora
◦ Extracelulární - kolagen, elastin; Intracelulární – tubulin, aktin; Mezibuněčné spoje – occludin …
 Transport molekul
◦ Hemoglobin, lipoproteiny, iontové kanály a pumpy …
 Pohyby
◦ Myosin (svaly), kinesin & mikrotubuly (pohyb organel v buňkách), dynein (bičíky, brvy)…
 Zásobní funkce
◦ Feritin (játra), kasein, ovalbumin …j
 Signální a regulační funkce
◦ Růstové faktory a hormony – endokrinní (insulin), parakrinní (EGF, cytokiny) …
◦ Transkripční faktory – obecné (TATA-binding proteins), „speciální“ – HSF, myc, CREB …
◦ Receptory – membránové (GPCR, RTK, AChR, rhodopsin), vnitrobuněčné (ER, AhR, PPAR, RXR/RAR) …
 Imunita
◦ Likvidace patogenu: Komplement, Protilátky, Host-defense peptidy (defensiny, magainin)
◦ Rozpoznávání: MHC glykoproteiny
 Další (hemokoagulace, luminiscence, toxiny …)
 Proteiny = polypeptidy
 Řetězce aminokyselin
AminoskupinaKarboxylováskupina
hlík Řetězce aminokyselin
◦ α-aminokyseliny
◦ L stereoisomery
α-uhlík
◦ L-stereoisomery
◦ Amfionty
◦ 20 proteinogenních aminokyselin
Postranní řetězec
◦ 20 proteinogenních aminokyselin
 Peptidová vazba
Karbon lo á + aminosk pina
N-konec C-konec
◦ Karbonylová + aminoskupina
◦ N-konec / C-konec
P t té Proteosyntéza
◦ Translace
Rib ó dl RNA lá
Peptidová vazba
◦ Ribozómy – dle RNA templátu
http://en.wikipedia.org/wiki/File:AminoAcidball.svg
N-konec C-konec
Iniciace – iniciační kodon (AUG), N-koncová aminokyselina
Elongace – prodlužování řetězce amino->karboxy směrem
Terminace – terminační / stop kodon
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/organic/translation.html
 soubor pravidel pro převod genetické informace v DNA (respektive RNA) na primární
strukturu bílkovin - tj. pořadí aminokyselin v řetězci
 64 -> 20(21) aminokyselin, 1x start kodon, 3x stop kodon 64 > 20(21) aminokyselin, 1x start kodon, 3x stop kodon
Standardní genetický kód
1. báze
2. báze
3. báze
U C A G
UUU UCU UAU UGU U
U
UUU
Phenylalanine
(Phe/F)
UCU
Serine
(Ser/S)
UAU
Tyrosine
(Tyr/Y)
UGU
Cysteine
(Cys/C)
U
UUC UCC UAC UGC C
UUA UCA UAA
STOP
(Ochre)
UGA
STOP
(Opal)
A
STOP T t h
Neutral
Nonpolar
Leucine
(Leu/L)
UUG UCG UAG
STOP
(Amber)
UGG
Tryptophan
(Trp/W)
G
C
CUU CCU
Proline
(Pro/P)
CAU Histidine
(His/H)
CGU
Arginine
(Arg/R)
U
CUC CCC CAC CGC C
CUA CCA CAA Glutamine CGA A
r
Neutral
Polar
( ) ( g )G uta e
(Gln/Q)CUG CCG CAG CGG G
A
AUU
Isoleucine
(Ile/I)
ACU
Threonine
(Thr/T)
AAU
Asparagine
(Asn/N)
AGU
Serine
(Ser/S)
U
AUC ACC AAC AGC C
AUA ACA AAA
L i
AGA
A i i
A
l
Basic
(Thr/T)
Lysine
(Lys/K)
Arginine
(Arg/R)AUG[A] Methionine
(Met/M)
ACG AAG AGG G
GUU
Valine
GCU
Alanine
GAU
Aspartic acid
(Asp/D)
GGU
Glycine
U
GUC GCC GAC GGC C
Acidic
http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_code
G
Valine
(Val/V)
Alanine
(Ala/A)
Glycine
(Gly/G)GUA GCA GAA
Glutamic acid
(Glu/E)
GGA A
GUG GCG GAG GGG G
c
i k li
Neutral, nonpolar Neutral, polar
•α-aminokyseliny
•L-stereoisomery
•20 proteinogenních
aminokyselin (+ Selenocystein)aminokyselin (+ Selenocystein)
•Neutrální nepolární WFGAVILMP
•Neutrální polárníYSTNQC
•Kyselé DE•Kyselé DE
•Zásadité KRH
•Esenciální
•Člověk: FVTWMLIKH (RCGQPY)•Člověk: FVTWMLIKH (RCGQPY)
•Postranslační modifikace
Basic
A idi
Basic
Acidic
http://www.mun.ca/biology/scarr/iGen3_06-02.html
• Amfionty• Amfionty
• NH3+ / COO•
Isoelektrický bod: pH(I), pI, IEP
h d H ři k é á l k l k l ý l ý áb j• hodnota pH při které má molekula v roztoku nulový volný náboj
pH < pI … kladný náboj
pH = pI … nulový náboj
pH > pI záporný nábojpH > pI … záporný náboj
Glycine
Lysin l á k lLysin Glutamová kyselina
pI=9.74
pI=3.22
 Skládání proteinů (folding)
 Štěpení (proteolýza)
 Modifikace aminokyselinových zbytků Modifikace aminokyselinových zbytků
 Glykosylace => glykoproteiny
 Fosforylace => fosfoproteiny
 Serin, Threonin, Tyrosin (O-, fosfoestery)
Hi tidi (N f f idát) Histidin (N-, fosforamidát)
 Lipidylace
 N-Myristoylace, S-palmitoylace, S-prenylace
(farnesyl, geranylgeranyl), GPI-kotva
A l Acylace
 Acetylace/Deacetylace (např. histony), formyl,
propionyl-, malonyl-, sukcinyl-, butyryl-…
 Alkylace – nejč. methylace
 Oxidace, hydroxylace, sulfatace, Ƴ-karboxylace
 S-nitrosylace
 Adenylylace (Adenosinmonofosfát), Ubikvitinylace
(Ubikvitin), Sumoylace (SUMO1), ADP-ribosylace, Sl
hi lglutathionylace
 Arginylace, polyglutamylace, polyglycinilace
 Vazba prostetických skupin (lipoát, flavinová
skupina, hem C…)
ů Disulfidické můstky – Cystein => „Cystin“
PROTEOM – soubor proteinů exprimovaných
genomem, organismem, tkání, buňkou v určitém okamžikug , g , ,
http://www.piercenet.com/method/overview-post-translational-modification#ptms
Primární, sekundární, terciární, kvartérní
http://sites.sinauer.com/animalphys3e/boxex02.01.html
 Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci
• Dána pořadím nukleotidů v DNA/RNA
• Unikátní pro daný protein
• Definuje strukturu a funkci• Definuje strukturu a funkci
• Kovalentní peptidová vazba
• 20 proteinogenních aminokyselin (+ seCys)
• Postranslační modifikace
http://challieze.wordpress.com/tag/proteins-primary-sturcture-secondary-structure-tertiary-structure/
 Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci
•Velikost proteinů
•Od 10 až >10000 zbytků
aminokyselin, typicky 50-2000 (<10 …
peptidy)
( h l )•(Brocchieri & Karlin, 2005):
•cca 34 000 lidských proteinů
•medián 375 zbytků aminokyselin
• Molekulová hmotnost 1-1000
kDa, typicky 10-200kDa, medián cca 50
kDa
ekvencíPočets
Počet aminokyselinových zbytků
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:AminoAcid_length_distribution_2010.svg
http://www.mad-cow.org/00/annotation_frames/tools/genbrow/hgwdev.html
•Isoelektrický bod
 Primární struktura= pořadí aminokyselin v řetězci
•Isoelektrický bod
• Počet a podíl zbytků kyselých a
bazických aminokyselin
Kyselé: Asp (D) Glu (E)• Kyselé: Asp (D), Glu (E)
• Zásadité: Lys (K), Arg (R), His
(H)
Vý PTM (f f l• Význam PTM (fosforylace ->
pokles pI)
• Kyselé proteiny – nízká hodnota
pI negativní náboj při fyziologickémpI, negativní náboj při fyziologickém
pH
• Bazické proteiny – vysoká hodnota
pI kladný náboj při fyziologickém • Online pI / MW kalkulátorypI, kladný náboj při fyziologickém
pH
p y
•http://web.expasy.org/compute_pi/
•http://isoelectric.ovh.org/
•Zohlednění postranslačních modifikací:
•http://proteomics.mcw.edu/promost.html
http://www.mad-cow.org/00/annotation_frames/tools/genbrow/hgwdev.html
• Primární struktura
• Predikce ze sekvence DNA nebo mRNA
• Edmanova degradace (automatizované sekvenátory)
• Hmotnostní spektroskopie
S k dá í iá í k• Sekundární, terciární struktura
• Rentgenová strukturní analýza (X-ray crystallography)
• Protein NMR• Protein NMR
• Elektronová kryomikroskopie
http://www.sbmp-itn.eu/sbmps/research_method/
http://www.masontechnology.ie
 Sekundární struktura – lokální prostorové uspořádání
• Vodíkové můstky• Vodíkové můstky
• Základní modely skládání :
α šroubovice
ß skládaný list
(3.613 helix )
• 310 helix, Π helix, random coil…
Supersekundární struktury / motivy:
Beta vlásenka, Řecký klíč, Omega
smyčka, Helix-smyčka-helix, Zn
http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha_helix
http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_sheet
smyčka, Helix smyčka helix, Zn
prsty, Helix-obrátka-helix…
 Terciární struktura – celkové prostorové uspořádání řetězce
• Vodíkové můstky , Hydrofobní interakce (van der Waals), Iontové
íl Di lfid é ů ksíly, Disulfidové můstky
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Proteins9.html
http://challieze.wordpress.com/tag/proteins-primary-sturcture-secondary-structure-tertiary-structure/
 Kvartérní struktura – podjednotkové uspořádání
• Seskupení tvořené několika polypeptidovými řetězci / proteiny
l b l
http://bio1151b.nicerweb.com/Locked/media/ch05/hemoglobin.html
http://homepage.eircom.net/~philipoconnell/Thesis%20PhD%20intro.htm
Imunoglobuliny
• (Eko)toxikologie: studium a predikce škodlivých účinků chemických látek na organismy
• Účinky na vyšších úrovních biologické organizace (jedinec populace společenstvo) jsou
Macro
• Účinky na vyšších úrovních biologické organizace (jedinec, populace, společenstvo) jsou
zprostředkovány změnami na nižších úrovních (orgány, tkáně, buňky, makromolekuly)
Chemical
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Organ
Response
Organism
Response
Population
Response
Tissue
Effect
• „Moderní metody (studia proteinů) v ekotoxikologii
• Moderní - ve smyslu „používané v současnosti“
• Moderní - ve smyslu snahy studovat a charakterizovat mechanismy vedoucí key y y
škodlivým účinkům chemických látek
=> porozumění mechanismům => lepší předpověď účinků na vyšších úrovních
biologické organizace
=> rychlejší, efektivnější, levnější a eticky méně kontroverzní metody pro
hodnocení (eko)toxicity chemických látek
=> identifikace nových biomarkerů a klíčových událostí vedoucích k toxicitě
> cílený vývoj optimalizace a validace alternativních testů toxicity=> cílený vývoj, optimalizace a validace alternativních testů toxicity
• Organismy = jsou z významné části tvořeny proteiny• Organismy = jsou z významné části tvořeny proteiny
• Téměř jakýkoli škodlivý účinek nějakým způsobem ovlivní proteiny/proteom
• Příklady možných změn proteomu působením toxických látek:• Příklady možných změn proteomu působením toxických látek:
• Přímé poškození (např. oxidační)
• „Globální“ inhibice proteosyntézy
• Ovlivnění enzymatické aktivity
• Aktivace receptorů a signálních drah
• Změny v postranslačních modifikací proteinůy p p
• Ovlivnění lokalizace proteinů
• Změny v genové exprese
• Aktivace/inaktivace proteinu v důsledku mutací• Aktivace/inaktivace proteinu v důsledku mutací
Metody studia proteinů v ekotoxikologii
- velká rozmanitost přístupů, technik, metod a jejich kombinací
- existence alternativních / paralelních řešení
 Extrakce a izolace proteinů
- Homogenizace vzorku a lyze buněk
- Rozpuštění a extrakce proteinů
 Frakcionace subcelulárních složek
◦ rozpustnost, velikost, vznášivost
 Denaturace
 Stanovení výtěžku / koncentrace proteinů Stanovení výtěžku / koncentrace proteinů
◦ Biuret, Lowry, BCA, Bradford, UV spektroskopie
 Přečištění a obohacení zájmové skupiny proteinů
◦ precipitace, ultrafiltrace, dialýza, chromatografie (gelová, afinitní)
Fosforproteiny glykoproteiny ubikvitinylované proteiny imunoprecipitace◦ Fosforproteiny, glykoproteiny, ubikvitinylované proteiny, imunoprecipitace
 Separace proteinů podle náboje, MW, pI
◦ Elektroforéza, Isoelektrická fokusace
 Detekce / kvantifikace
◦ Hodnocení enzymatické aktivity proteinu
◦ Detekce pomocí specifických protilátek
 V roztoku (EIA, RIA, ELISA)
 Na membráně (dot-blot)
b á ě S S G ( bl ) Na membráně po SDS-PAGE (Western blot)
 „In situ“ -> imunocytochemie / imunohistochemie
◦ MS-identifikace
 štěpení proteázami na peptidy
 Obohacení zájmové frakce peptidů (např fosfopeptidy) Obohacení zájmové frakce peptidů (např fosfopeptidy)
 Přečištění (odsolení)
 LC-MS/MS
http://piercenet.com
Mechanická homogenizace
 mletí drcení krájení mletí, drcení, krájení
 třepání v přítomnosti
abrazivních materiálů
(sklěnené, ZrO2, ZrSiO4, o
l é k l čk )celové kuličky)
Ultrazvukové homogenizátory
 Enzymaticky – lyzozym
 Chemicky – použití detergentů
 Probíhá zpravidla v přítomnosti extrakčního činidla
(lyzačního pufru)
 Musí být kompatibilní s navazujícím krokem
 Často chlazení
 Ledová tříšť (0-4C), Chladící/mrazící stojánky (4 … -80C)
 Rychlé zmrazení: Chladící lázně o definované teplotě (např. suchý led &
aceton 78C) kapalný dusík ( 196C)aceton –78C), kapalný dusík (-196C)
 Skladování: lednice, -20C, -80C, -196C
 Minimalizace rozmražování/zamražování (alikvoty!)
 Lyzační/extrakční pufr Lyzační/extrakční pufr
◦ Lyze buněk
◦ Rozpuštění proteinůRozpuštění proteinů
 Celý proteom nebo jen vybrané kompartmenty
(membrána, jádro, cytoskelet…) či frakce (např. fosfoproteiny)?
ů• Zachování nativní konformace / aktivity proteinů nebo
denaturace?
◦ Omezení nežádoucích změn vzorku
 Stabilizace molekul, prevence oxidativního poškození
 Inhibice proteolýzy, defosforylace
Inhibice růstu bakterií Inhibice růstu bakterií
•Aminokyselinové složení
•Nepolární vs. Polární aminokyseliny
•pH
•Amfolyty
•nízká rozpustnost v oblasti pH=pI
•minimalizace celkového náboje a
odpudivých elektrostatických sil bránících
agregaci a precipitaci proteinů
Salinita
•Malé množství neutrálních solí => nárůst
ionizace funkčních skupin
(tzv. vsolení, salting-in) vede k vytvoření
ochranného pláště iontů soli kolem proteinu
a jeho stabilizaci v roztoku
• Zvyšování koncentrace anorganických solí
=> ionty solí odebírají proteinům jejich
hydratační obal, což vede k
http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_methods.htm
http://cacingkecil.wordpress.com/sitemap.xml
hydratační obal, což vede k
postupnému vysolení (vysrážení, salting-out)
proteinu z roztoku.
Buffer pH range
Citric acid - NaOH 2.2 - 6.5Citric acid NaOH 2.2 6.5
Sodium citrate - citric acid 3.0 - 6.2
Sodium acetate - acetic acid 3.6 - 5.6
Cacodylic acid sodium salt - HCl 5.0 - 7.4
MES - NaOH 5.6 - 6.8
Sodium dihydrogen phosphate - disodium hydrogen
phosphate
5.8 - 8.0
I id l HCl 6 2 7 8Imidazole - HCl 6.2 - 7.8
MOPS - KOH 6.6 - 7.8
Triethanolamine hydrochloride - NaOH 6.8 - 8.8
Tris HCl 7 0 9 0Tris - HCl 7.0 - 9.0
HEPES - NaOH 7.2 - 8.2
Tricine - NaOH 7.6 - 8.6
Sodium tetraborate - boric acid 7 6 - 9 2Sodium tetraborate boric acid 7.6 9.2
Bicine - NaOH 7.7 - 8.9
Glycine - NaOH 8.6 - 10.6
(zpravidla v koncentraci 20-50 mM)
 NaCl, KCl, (NH4)2SO4
 50-150 mM 50 150 mM
 zachování iontové síly
http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica
tion/lysis_buffer_additives/
 Surfaktanty nebo jejich směsi
L b ěk l bili (hůř ý h) i ů Lyze buněk, solubilizace (hůře rozpustných) proteinů
Neiontové:
Tween20
Triton X-100
Nonidet P40
Aniontové:Aniontové:
Sodium dodecylsulfát (SDS)
Sodium deoxycholát
CTAB
Zwitteriontové:
CHAPS
CHAPSOCHAPSO
C7BzO
ASB-14
Silné detergenty mohou způsobovat denaturaci proteinů!
 Glycerol
 5-10%
bili i ů ( i í k f ) iž j b d stabilizace proteinů (nativní konformace), snižuje bod mrazu
 Glukóza / Sukróza
 25 mM
 stabilizace lysozomálních membrán, potlačení uvolňování proteáz stabilizace lysozomálních membrán, potlačení uvolňování proteáz
 Chelatační činidla – EDTA, EGTA
 1-5 mM
 Potlačení oxidačního poškození, metaloproteáz
é k ( ) Dvojmocné kationty (Mg2+)
 1-10 mM
 Ligandy (ATP, GTP)
 Redukční činidla Redukční činidla
 Dithiothreitol (1-100 mM), 2-merkaptoethanol (0,05%)
 Prevence oxidativního poškození, redukce disulfidických můstků
 Chaotropní reagenty
 Močovina (6-8M), thiomočovina (2M), guanidinium hydrochlorid (6M)
 Denaturace proteinů, vhodné pro aplikace nekompatibilní s detergenty
 Antibakteriální látky
 Azid sodný (0 02-0 05%) Azid sodný (0,02 0,05%)
 Roztoky nativních proteinů dlouhodobě uchovávané v chladu
http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica
tion/lysis_buffer_additives/
Protease inhibitor Concentration Solvent Inhibice
 Inhibitory proteáz
Protease inhibitor Concentration Solvent Inhibice
Aprotinin 1-2 µg/ml water serine proteases
Benzamidine 15 µg/ml water serine proteases
EDTA EGTA 1 10 mM water metallo proteasesEDTA, EGTA 1-10 mM water metallo proteases
Leupeptin 1-2 µg/ml water cysteine and serine
proteases
PMSF 0 1 1 0 mM isopropanol serine proteasesPMSF
(phenylmethylsulfonyl
fluoride)
0.1-1.0 mM isopropanol serine proteases
Pepstatin A 1µg/ml methanol aspartic proteases
Ph h t C t ti S l t I hibit
Antipain, bestatin, AEBSF, E-64…
 Inhibitory fosfatáz
Phosphatase
Inhibitor
Concentration Solvent Inhibiton
Na3VO4 1 mM water Tyr phosphatases
NaF 5 10 mM water Ser/ThrNaF 5-10 mM water Ser/Thr
phosphatases
http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_purification/extraction_clarifica
tion/lysis_buffer_additives/
 Zachování nativní struktury a aktivity proteinu
 Optimální pH, iontová síla, teplota
 Nízké koncentrace detergentů:g
 Neiontové 0,1-2%, iontové 0,01-0,5%
 Nízké koncentrace redukčních činidel
 1-10 mM DTT nebo 0,05% 2-merkaptoethanol 1 10 mM DTT nebo 0,05% 2 merkaptoethanol
 Stabilizující látky (glycerol, dvojmocné kationty, chelatační činidla)
 !!! Inhibitory proteáz, případně fosfatáz
Nonidet-P40 (NP40) buffer
50 mM Tris, pH 8.0
 Příklady lyzačních pufrů (Abcam.com)
Tris-HCl buffer
(Cytosolové proteiny)
RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay
150 mM sodium chloride
1.0% NP-40 (nebo Triton X-100)
Tris-Triton buffer
(Cytoskeletární proteiny)
•20 mM Tris-HCl, pH 7.5
RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay
buffer)
50 mM Tris, pH 8.0
150 mM sodium chloride
1.0% NP-40
10 mM Tris, pH 7.4
100 mM NaCl
1 mM EDTA, 1 mM EGTA
1% Triton X-100 1.0% NP 40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
0.1% SDS
0.5% sodium deoxycholate
10% glycerol
 Narušení nekovalentních vazeb a interakcí udržujících přirozenou (nativní) konformaci
proteinu
 Narušení S-S vazeb
=> Ztráta kvartérní / terciární / sekundární struktury
=> Zachována pouze primární struktura (rozvinutý, volně ohebný polypeptidový řetězec)
 Vysoká teplota – H-můstky, hydrofóbní interakce
 Organická rozpouštědla (methanol, ethanol) -H-můstky
á íl ( l á í) Iontová síla (vysolování)
 pH (TCA, HAC) – iontové interakce
 Iontové detergenty (2-4% v/v)
ů Redukční činidla (dithiothreitol DTT, dithioerythritol DTE, 2-merkaptoethanol) – S-S můstky
 Chaotropní reagenty (močovina, thiomočovina, guanidinium hydrochlorid)
-H-můstky
 Cross-linkery (paraformaldehyd, glutaraldehyd)
Vyžaduje-li navazující metoda studia proteinů denaturaci, je možné ji provést již v extrakčním
kroku
Příklady denaturujících redukujících lyzačních pufrůPříklady denaturujících redukujících lyzačních pufrů
 4% SDS, 100 mM Tris pH 7.6, 100 mM DTT (Wisniewski et al 2009, Nat Met)
 8M močovina, 50 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA
 8M močovina, 40 mM Tris, pH 8, 4%CHAPS, 65 mM DTT …
 Kompatibilita jednotlivých metod:
 SDS+DTT+vysoká teplota: OK x Močovina+vysoká teplota: => karbamylace proteinů
 Kompatibilita s navazujícími kroky Kompatibilita s navazujícími kroky
 Aniotové detergenty interferují při isoelektrické fokusaci (zwitteriontové jsou OK)
 Vysoké koncentrace silných detergentů interferují s trypsinovým štěpením
Volbou lyzačního pufru lze přednostně izolovat frakce proteinů s
rozdílnou rozpustností
Lokalizace Doporučený pufr
Celá buňka NP-40, RIPA
Cytosol (rozpustné) Tris-HClCytosol (rozpustné) Tris HCl
Cytoskelet Tris-Triton
Membránové NP-40, RIPA
Jaderné RIPAJaderné RIPA
Mitochondriální RIPA
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11379
Sekvenční extrakcí řadou lyzačních pufrů lze izolovat i několik různých
proteinových frakcí
=> komerčně dostupné kity různých výrobců
=> různé subcelulární frakce a jejich kombinace
 Příklad – izolace frakce rozpustných cytosolových a frakce membránových proteinů (Sigma
PROTTWO):
Rozpustné proteiny solubilizovány v 5mM Tris pufru
Nerozpustné proteiny (membrána, cytoskelet) odděleny centrifugací (14000xG) a
následně solubilizovány pufrem chaotropních reagentů a detergentu
(močovina, thiomočovina, C7BzO)
 Příklad – Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells (Pierce 78840)
CEB Cytoplazmový extrakční pufr => cytosolové proteiny
MEB Membránový extrační pufr => membránové proteinyMEB Membránový extrační pufr => membránové proteiny
NEB Jaderný extrakční pufr => jaderné proteiny
MNase Mikrokokální nukleáza => chromatin-vázané proteiny
PEB P ellet extrakční pufr => cytoskeletPEB P ellet extrakční pufr > cytoskelet
http://www.piercenet.com/product/subcellular-protein-fractionation-kit-cells
 Příklad – Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells (Pierce 78840)
Snížení komplexity vzorku
Obohacení zájmové frakce proteinů
Lokalizace proteinů
Translokace proteinů
•Differential centrifugation
•Dělení buněčných složek podle hustoty a velikosti
P é š á í áč k / RCF j d li é k k•Postupné zvyšování otáček / RCF pro jednotlivé kroky
Homogenát
( š é
Mitochondrie
Ribosomy(neporušené
organely) Celé buňky,
jádra,
Lyzosomy
Peroxisomy
Mikrosomy
Ribosomy,
Viry
Velké
makromolekuly
cytoskelet
ymakromolekuly
http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_centrifugation
http://upendrats.blogspot.cz/2012/12/the-basic-separation-technique.html
•Rate Zonal Density Gradient
CentrifugationCentrifugation
•Dělení buněčných složek podle
jejich rychlosti sedimentace (jejich
velikosti) v mírném gradientuvelikosti) v mírném gradientu
sacharózy (5-20%)
•(Equilibrium) Density Gradient
Centrifugation
•Dělení buněčných složek podle
vznášivosti (hustoty) ve strmém
gradientu sacharózy (20-70%)
nebo CsCl
http://www.expertsmind.com/topic/cellular-fractionation/equilibrium-density-gradient-centrifugation-92091.aspx
http://upendrats.blogspot.cz/2012/12/the-basic-separation-technique.html
 Posouzení výtěžnosti extrakce, frakcionace, purifikace
 Standardizace navazujících kroků – použití definovaného a pro
různé vzorky ekvivalentního množství proteinů (např. pro gelovou
elektroforézu, štěpení trypsinem…)
 Enzymatické aktivity koncentrace metabolitů ve tkáních => Enzymatické aktivity, koncentrace metabolitů ve tkáních >
zpravidla se vztahují na množství proteinů
 Kvantifikace a charakterizace mikroorganismů a jejich společenstev
UV spektrofotometrie
◦ Absorbance zbytků aromatických
aminokyselin tyrosinu, tryptofanu a
f l l ř 280fenylalaninu při 280 nm
◦ Jednoduchá, rychlá metoda, malé objemy
vzorku (Nanodrop etc.)
◦ Závislá na aminokyselinovém složení◦ Závislá na aminokyselinovém složení
proteinu
◦ Lze měřit i při kratších vlnových délkách –
vyšší citlivost, ale vyšší pravděpodobnost
f í ( f )interferencí (pufr)
http://www.biotek.com/resources/articles/peptides-amino-acids-fluorescence.html
 Biuretová reakce
◦ Činidlo obsahující CuSO4, vínan sodno-draselný a
N OHNaOH
◦ v alkalickém prostředí dochází k reakci peptidových
vazeb s Cu(II) za vzniku modrofialového zbarvení
◦ Měří se absorbance při 540 nm
 Lowryho reakce
◦ Měří se absorbance při 540 nm
◦ Nezávisí na aminokyselinovém složení, ale málo
citlivá
 Lowryho reakce
◦ Lowry et al. (1951) PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. JOURNAL
OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 193(1):265-275 =>14.10.2014: 305202 citací (1. na WOS)
◦ Dvoustupňová: Kombinuje biuretovou reakci s následným použitím Folinova činidla, kterép j ý p ,
se redukuje v přítomnosti komplexů Cu1+ a zbytků aromatických aminokyselin (W, Y)
◦ 10-1000 ug/mL, měření absorbance při 750 nm
◦ Existují modifikace (např. DC Bio-rad)
http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
 BCA reakce
◦ Peptidová vazba reaguje s ionty Cu2+ (CuSO4), které redukuje; následně sodná sůl kyseliny
bicinchoninové (BCA) reaguje s ionty Cu(1+) za vzniku barevného komplexubicinchoninové (BCA) reaguje s ionty Cu(1+) za vzniku barevného komplexu
◦ 10-1000 ug/mL, absorbance se při 562 nm
 Reakce Bradfordové Reakce Bradfordové
◦ barvení rozpuštěných proteinů roztokem
Coomassie Brilliant Blue G-250
◦ Nárůst absorbance při 595 nm◦ Nárůst absorbance při 595 nm
◦ Lineární pro koncentrace proteinů 20-
2000 ug/mL
http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
http://piercenet.com
 Některé běžné složky lyzačních / extrakčních pufrů nejsou kompatibilní s
kolorimetrickými metodami stanovení proteinů => vždy ověřit v tabulce
komptibility pro příslušnou metodu, pufr a ředění vzorkup y p p , p
 V ideálním případě mít stejné složení a ředění pufru jak pro vzorek, tak pro
externí standard
 Nutná externí kalibrace
◦ Bovinní sérový albumin (BSA)
◦ Ovalbumin (OVA)
 V závislosti na složení aminokyselin
h í ěk é šší dmohou mít některé proteiny vyšší odezvu
než jiné
DC Bio-Rad (Lowry Based)
Assay absorption mechanism detection limit advantages disadvantages
incompatible
UV absorption 280 nm
tyrosine and
tryptophan
absorption
0.1-100 ug/ml
small sample
volume, rapid,
low cost
with detergents
and
denaturating
agents, high
variabilityvariability
Bicinchoninic
acid
562 nm
copper
reduction (Cu2+
to Cu1+), BCA
reaction with
C 1+
20-2000 ug/ml
compatible with
detergents and
denaturating
agents, low
i bilit
low or no
compatibility
with reducing
agents
Cu1+ variability
age ts
Bradford or
Coomassie
brilliant blue
470 nm
complex
formation
between
Coomassie
20-2000 ug/ml
compatible with
reducing agents,
urea rapid
incompatible
with detergents
brilliant blue
brilliant blue
dye and proteins
urea, rapid
g
copper
reduction by
proteins Folin
incompatible
with detergents
Lowry 750 nm
proteins, Folin-
Ciocalteu
reduction by the
copper-protein
complex
10-1000 ug/ml
high sensitivity
and precision
with detergents
and reducing
agents, long
procedure
Modified Lowry
(DC Biorad)
750 nm
copper
reduction by
proteins, Folin-
Ciocalteu
reduction by the
10-1500 ug/ml
high sensitivity
and precision,
compatible with
some
d
Limited
compatiibility
with reducing
reduction by the
copper-protein
complex
detergents,
rapid
agents
http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
 Zakoncentrování proteinů
 Odstranění nežádoucích složek lyzačního pufruy p
(detergenty, soli…) anebo odstranění proteinů
 Organická rozpouštědla, kyseliny, soli
 Příklad: Chloroform/Methanol precipitace:
 Do Epp. Zkumavky napipetovat 100 uLroztoku
proteinů
 Přidat 400 uL methanolu, vortex, krátce stočit
 Přidat 100 uL chloroformu, vortex, krátce stočit
 Přidat 300 uL vody, vortex, stočit min. 13000 rpm
(5 min) => proteiny budou na rozhraní dvou vrstev
kapalin.kapalin.
 Opatrně odebrat horní kapalnou vrstvu
 Přidat 300 uL methanolu, vortex, stočit min 13000
rpm (5 min) => proteiny peletují na dno zkumavky
 Odebrat supernatant, proteiny nechat uschnout na
vzduchu
 Rozpustit v požadovaném objemu a typu pufru
 Další metody:
 Trichlorooctová kyselina (TCA), TCA-aceton, TCADOC,
sulfát amonný
http://www.intechopen.com: Applications-of-calorimetry-in-
a-wide-context-differential-scanning-calorimetry-
isothermal-titration-calorimetry-and-microcalorimetry/
 Filtry z membrán s malou velikostí pórů
 Průchod vzorku docílen centrifugací
Možný opakovaný proplach vzorku
g
 Komerčně dostupné patrony různých
objemů a s různou propustností filtrů
>3, >10, >30, >50, >100 kDa
Tzv. MWCO = molecular weight cut-off
 Semipermeabilní membrána umožňující průchod malýchp j p ý
molekul -> osmóza
 Klasicky „dialyzační střívko“, inzerty pro centrifugační
zkumavky a mikrozkumavky, dialyzační rámečky, láhve, 96
mikrodeskymikrodesky
 Objemy od 20 uL az po 250 mL, MWCO 2, 3.5, 7, 10, 20K
https://www.emdmillipore.com
http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/lecture/proteincharacterizationoutline.html
http://piercenet.com
 Gelová filtrace, size-exclusion chromatography
 Vzorek je unášen mobilní fází procházející kolonou naplněnou porézní
stacionární fází (pohyb mobilní fáze: gravitace nebo centrifugace)stacionární fází (pohyb mobilní fáze: gravitace nebo centrifugace)
 Stacionární fáze umožňuje vstup malých molekul do pórů => zvyšuje jejich
retenci
 Velké molekuly nevstupují do pórů > migrují rychleji kratší retenční čas Velké molekuly nevstupují do pórů => migrují rychleji, kratší retenční čas
 Komerčně dostupné kolony různých velikostí (uL až mL vzorku), různých
formátů (kolonky, 96j destičky) s různými typy stacionární fáze s různým
MWCO:
◦ Zeba Resin (MWCO 7K, 40K)
◦ Polyakrylamid Resin (MWCO 1.8K, 6K)
◦ Dextran Resin (MWCO 5K)Dextran Resin (MWCO 5K)
◦ Sephadex (dextran, MWCO 0,7-600 kDa)
http://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography
 Zrnka stacionární fáze mají navázanou molekulu / jsou tvořena
molekulami interagujícími s cílovými proteiny
=> specifická vazebná aktivita
 Protilátka rozpoznávající daný protein nebo antigen
(Immunoafinitní chromatografie)
k é í ( ) Konkrétní protein(y)
 Soubor proteinů – protilátky proti ubikvitinu
 Antigen rozpoznávaný protilátkou – purifikace protilátek
 Substrát enzymu
 IMAC (Immobilized Metal Ion chromatography), TiO2, Pro-Q
Diamond – izolace fosfoproteinů
Concavalin A / Wheat Germ Agglutinin (WGA) izolace Concavalin A / Wheat Germ Agglutinin (WGA) – izolace
glykoproteinů
 Purifikace značených rekombinantních/fúzních proteinů
(GST, 6xHis, MBP, FLAG, )(GST, 6xHis, MBP, FLAG, …)
 Komerčně dostupné kity
 Možnost zakoncentrovat i proteinové komplexy -> studium interakcí proteinů
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/AffinityChrom.html
o ost a o ce t o at p ote o é o p e y stud u te a c p ote ů
 Lze realizovat v kolonkové podobě nebo v suspenzi („batch techniques“)
 Zrnka sefarózy v roztoku/suspenzi s
protilátkou a cílovým proteinem
 Navázání protilátky na sefarózua á á p ot át y a se a ó u
pomocí Protein A nebo Protein G
 Imunoprecipitát oddělen centrifugací
 Analýza imuno(ko)precipitátu Analýza imuno(ko)precipitátu
http://piercenet.com
 Pohyb nabitých molekul
v elektrickém poli
 Typicky v polyakrylamidovém gelu
 Polyacrylamide Gel Electrophoresisv elektrickém poli  Polyacrylamide Gel Electrophoresis
= PAGE
ODA
ODA
Akrylamid (monomer)
N,N'-Methylenebisacrylamide
(cross linking monomer)
+ANO
-KATO
Peroxodisíran amonný
(Ammonium persulfate) –
zdroj radikálů
Tetramethylethylenediamine
(TEMED) - katalyzátor
y ( )(cross-linking monomer)
 Různá uspořádání a varianty
 Elektroforéza gelová, free-flow, kapilární
I l k i ká f k
http://www.bio-rad.com/en-ch/applications-technologies/polyacrylamide-gels
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Electrophoresis.gif
 Isoelektrická fokusace
 Isotachoforéza…
% bis/akrylamidu – ovlivňuje velikost pórů a
rigiditu gelurigiditu gelu
 Velikost separovaných proteinů
 Jednoduché gely - konstantní
 Gradientové gely – nárůst koncetrace
akrylamidu směrem k anoděakrylamidu směrem k anodě
•Vertikální uspořádání PAGEVertikální uspořádání PAGE
•Gel
•v kazetě (mezi skly / plastovými
destičkami)
•Různé rozměry (mini cca 8 x 6
cm, standard cca 13 x 8
cm, velké >20 x 20 cm)
lé é l b t ři b•nalévané v laboratoři nebo
komerčně dostupné pre-cast gely
• Vzorek do jamek (10-50 ug proteinů)
•Umístění v tanku•Umístění v tanku
•Rezervoár katodového a
anodového pufru
(upper / lower chamber)
http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html
http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_methods.htm
( pp / )
• Zdroj napětí
•Nativní PAGE
•Nedenaturované neredukované proteiny
•Rychlost migrace závisí na
•Nábojij
•Velikosti a tvaru molekuly
/Hustota náboje/
Malé s vysokým neg. nábojem >
>Malé s nízkým neg. nábojem ~
~ velké s neg. vysokým nábojem >
> Velké s neg. nízkým nábojem
Typicky Tris-Glycinový elektrodový pufr & Tris-HCl PAGE
gel
 Separace proteinů v nativním stavu
Odlišení proteinů se stejnou molekulovou hmotností X
neumožňuje určit molekulovou hmotnostneumožňuje určit molekulovou hmotnost
SDS-PAGE
• Laemmli (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
b t i h T4 N t 227(5259) 680 5bacteriophage T4. Nature 227(5259):680-5
• 14.10.2014: přes 200 000 citací, 2. nejcitovanější článek na WOS
 Denaturované a redukované proteiny
Denaturace proteinů ve vzorku:
SDS & mercaptoethanol (nebo DTT)
& zahřátí
p y
 Uniformní náboj (SDS), rychlost migrace závisí na
molekulové hmotnosti
 Umožňuje určit molekulovou hmotnost:
• Nanášecí pufr (2X):
Molecular weight marker = žebříček standardů proteinů o
známé MW
p ( )
4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.004%
bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH 6.8 => smíchání
se vzorkem v poměru 1:1 a zahřátí (55-100C)
El k f i ký f 25 M T i 192 M• Elektroforetický pufr: 25 mM Tris-192 mM
Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8
• Diskontinuální Tris-HCl PAGE gel:
•Zakoncentrování vzorku do úzké zóny na vstupu do•Zakoncentrování vzorku do úzké zóny na vstupu do
separačního gelu
•4% zaostřovací gel, 125 mM Tris-HCl-0.1%SDS, pH 6.8
•separační gel, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8 (4 …20%)p g , , p ( )
• tloušťka 0,5-1,5 mm
• 100-200V
=> všechny proteiny budou mít
záporný náboj
Odhad molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE
•Komerčně dostupné směsi standardů od různých výrobců
•Nebarvené markery – nejpřesnější nutno ale vizualizovat barvením (PonceauNebarvené markery nejpřesnější, nutno ale vizualizovat barvením (Ponceau
S, Cooomassie etc.)
•„Prestained“ – s navázaným barvivem, lze sledovat průběh migrace gelem během
elektroforézy, ale odhad MW není tak přesný (barvivo ovlivňuje migraci)y, p ý ( j g )
Vliv koncentrace akrylamidu v
gelu na rozlišení molekulovýchgelu na rozlišení molekulových
hmotností
šší k k l d l šíVyšší koncentrace akrylamidu – lepší
rozlišení menších molekul a opačně
http://piercenet.com http://abcam.com
Efekt zaostřovacího gelu v diskontinuálním systému
L li SDS PAGELaemmli SDS-PAGE
GlyKatodový
pufr: 25 mM Tris-192 mM Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8
4%S ki l
Cl-
4%Stacking gel:
125 mM Tris-HCl,
0.1%SDS pH 6.8
>4% Running gel:
375 mM Tris-HCl,
0.1%SDS pH 8.8
Anodový pufr: 25 mM Tris-192 mM Glycine, 0.1%SDS pH 8.3-8.8ý p y p
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/multiphasic-buffer-systems
Vizualizace proteinů v gelu
•Coomassie Blue
•R250, G250 … – různá
citlivost, rychlost, rozlišení
•Fixace gelu: 40%MeOH-20%HAc
•Inkubace s Coomassie Blue
•Odbarvení pozadí :10%MeOH-10%HacOdbarvení pozadí :10%MeOH 10%Hac
•Detekce 3-50 ng proteinu
•Jednoduchá, kompatibilní s MS detekcí
B í říb•Barvení stříbrem
•Dusičnan stříbrný AgNO3
•Ag+ ionty interagují nejvíce s nabitými
skupinami Asp, Glu, Cys, His, Lys
•Vymytí slabě navázaných iontů a konverze
Ag+ na kovové stříbro (formaldehydová nebo
l t ld h d á ý jk t bili át )glutaraldehydová vývojka, stabilizátor)
•Nejcitlivěší technika – 0,5 ng proteinu
•Cross-linky, ireverzibilní, špatná kompatibilita
MS d k í i lis MS detekcí, nutno optimalizovat
http://www.biomedcentral.com/1741-7007/5/56/figure/F2?highres=y
http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3197653_pone.0026495.g002&req=4
Vizualizace proteinů v gelu
•Barvení zinkem nebo mědí
•Negativní metoda pro SDS-PAGE
•Nerozpustné komplexy Zn nebo Cu s•Nerozpustné komplexy Zn nebo Cu s
polyakrylamidem vytvářejí mléčné zbarvení
okolo míst obsahujících proteiny-SDS, které
odpuzuje Zn/Cu
•Citlivé – 1 (5-10) ng proteinu
•Bez fixace, snadné odmytí
barvení, kompatibilní s MS aplikacemi, p p
•Fluorescenční barvy
•Krypton Stain, SYPRO-Ruby, Flamingo, Orioleyp , y, g ,
•Interagují a barví místa s proteiny-SDS
• Rychlé, jednoduché
• Vysoce citlivé 0 25 1 ng proteinu• Vysoce citlivé 0,25-1 ng proteinu
• Nutný nákladný dokumentační systém
schopný detekovat fluorescenci (Ex/Em)
S d é db í k tibilit• Snadné odbarvení, kompatibilita s
navazujícími aplikacemi
http://www.lonza.com/
http://www.gbiosciences.com/ResearchProducts/ReversibleZincStain-desc.aspx
Vizualizace proteinů v gelu
• Specifické fluorescenční barvy
•Glykoproteiny (Pro-Q Emerald), fosfoproteiny (Pro-Q Diamond)
•Stain-free technologie TGX Stain-Free™ Gels (Bio-Rad)
• gel obsahuje speciální trihalo sloučeninu, která se po aktivaci UV zářením váže na rezidua
tryptofanu a dochází k vizualizaci barvy
• Citlivost podobná Coomassie, kompatibilní nejen s MS, ale i imunodetekcí
Dokumentační systémy
• Gel Doc
• UV-VIS Transiluminátor (event. i epiiluminace) & CCD kamera
Klasické výbojky nebo LED excitace• Klasické výbojky nebo LED-excitace
•Ex/Em filtry pro fluorescenci
• Některé systémy umožňují také snímaní chemiluminiscence
ft d it t i ká h d í k tifik i• software pro denzitometrická vyhodnocení a kvantifikaci
Vizualizace proteinů v gelu – Bio-Rad
Total Protein Stain
Sensitivity
(Lower Limit) Time Comments Imaging
Stain-Free
Similar to Coomassie
and dependent upon
tryptophan
No staining or N/A Fast and reproducible; visualize proteins in
5 minutes or less with a stain-free enabled
imager; no staining required
Coomassie Stains Densitometer
Bio-Safe Coomassie G- 8–28 ng 1–2.5 hr Nonhazardous staining in aqueous solution;
250
g g q ;
premixed, mass spectrometry compatible
Coomassie Brilliant Blue
R-250
36–47 ng 2.5 hr Simple and consistent; mass spectrometry
compatible; requires destaining with
methanol
Colloidal endpoint stain; premixed
QC Colloidal Coomassie 3 ng 1–20 hr
Colloidal endpoint stain; premixed,
nonhazardous formulation — no methanol
required
Silver Stains Densitometer
Silver Stain Plus™ Kit 0.6–1.2 ng 1.5 hr Simple, robust; mass spectrometry
compatible (Gottlieb and Chavko 1987)
Fluorescent Stains
CCD and Laser-Based
Scanners
Oriole Fluorescent Gel
Stain*
0.5–1 ng 1.5 hr Rapid protocol, requires no destaining,
mass spectrometry compatible; compatible
only with UV excitation
Flamingo Fluorescent 0 25 0 5 ng 5 hr High sensitivity; broad dynamic range;Flamingo Fluorescent
Gel Stain
0.25–0.5 ng 5 hr High sensitivity; broad dynamic range;
simple protocol requires no destaining;
mass spectrometry compatible; excellent
for laser-based scanners
SYPRO Ruby Protein Gel
Stain
1–10 ng 3 hr Fluorescent protein stain; simple, robust
protocol; broad dynamic range; massStain protocol; broad dynamic range; mass
spectrometry compatible
 Separace proteinů (peptidů) podle jejich izoelektrického bodu (pI)
 V pH gradientu proteiny v elektrickém poli migrují do oblasti pH kde V pH gradientu proteiny v elektrickém poli migrují do oblasti pH, kde
budou mít celkový nulový náboj (pH=pI)
pH gradient vytvořen pomocí amfolytů:
 Preparativní IEF – rozdělení proteinů v kapalné fázi
do frakcí proteinů v rozmezí určitých hodnot pI
 Rotofor (Bio-Rad)
 ZOOM (Life Tech) ZOOM (Life Tech)
 Agilent OFFGEL
 „Analytická“ IEF - v kombinaci s SDS-PAGE„ y
=> tzv. 2D-ELFO
 Metoda „carrier ampholyte IEF“ – amfolyty
aplikovány na polyakrylamidový gel vaplikovány na polyakrylamidový gel v
trubičce, zafokusovány, následně aplikace vzorku
 Immobilizovaný pH gradient IPG – IPG stripy s
kovalentně vázanými amfolyty v tenké vrstvě gelu
(komerčně dostupné, ready-to-use)
http://www.channelwolf.com/lvv/sem6/index_files/Page1942.htm
ZOOM IEF Fractionator (LifeTechnologies)
MicroRotofor (BioRad)
OFFGEL 3100 (Agilent)
1.dimenze - Isoelektrická fokusace – pI
2.Dimenze – SDS-PAGE - MW
IPG Stripy (pro různé oblasti pH) Isoelektrický fokusátor pro IPG stripy
Možné rozlišení až na
úroveň jednotlivých
Vizualizace proteinů ve 2D gelu
úroveň jednotlivých
proteinů
d ůIdentita proteinů?
Zpravidla LC-MS