Pavel Babica
 Metody cílené na konkrétní proteiny
 „hypothesis-driven approach“,
 Identifikace a kvantifikace specifických
změn napříč proteomem
targeted analysis
• Stanovení aktivity specifických
enzymů
I k li d
 „exploratory /discovery approach,
„omikový“ přístup
• Zpravidla separace zájmové frakce
proteomu > snížení komplexity• Interakce ligand-receptor
• Interakce antigen-protilátka
• EIA / RIA / ELISA
h h
proteomu => snížení komplexity
vzorku
• Membránová, jaderná …
• Molekulová hmotnost pI• Imunohistochemie /
Imunocytochemie (IHC/ICC)
• Průtoková cytometrie (FCM)
D t bl t W t bl t
• Molekulová hmotnost, pI
• Fosfoproteiny, glykoproteiny …
• Identifikace proteinů pomocí LC-MS
metodou
• Dot-blot, Western blot
etodou
Peptidové mapování nebo
sekvenování
K bi Kombinace:
 Imunokoprecipitace následovaná LC-MS identifikací
 Vizualizace bandů nebo spotů v 1D/2D-gelu pomocí protilátek a následná
identifikace pomocí LC MS/MSidentifikace pomocí LC-MS/MS
 Proteinové microarrays
Metody studia proteinů
Změny proteinů:Změny proteinů:
(Ne)přítomnost
(Relativní) abundance
AktivitaTOXIKANT
Modifikace
Lokalizace
TOXIKANT
M kMakro-
molekulární
interakce
Buněčná
odpověď
Účinky na
orgány
Účinky na
jedince
Změny v
populacích
Účinky na
tkáně
 Specifické interakce mezi enzymem a jeho substrátem
 Řada toxikantů působí přímo nebo nepřímo na aktivitu enzymů Řada toxikantů působí přímo nebo nepřímo na aktivitu enzymů
 Typické uspořádání:
◦ Tkáňová kultura in vitro nebo extrakt vzorku (tkáň, tkáňová kultura) obsahující
funkční enzym ve vhodném reakčním pufrufunkční enzym ve vhodném reakčním pufru
◦ Přídavek modelového „značeného“ substrátu
◦ Enzymatickou konverzí substrátu činností zájmového enzymu (někdy
několikastupňovou) dochází ke vzniku:
 Barevného produktu => spektrofotometr
 Fluorescenčního produktu (fluorogenní reakce) => fluorimetr (fl. mikroskop)
 Chemi- nebo bio-luminiscenční reakce => luminometr
 Radioaktivně značeného produktu => scintilační počítač
(B-zářiče 3H, 14C, 32P, 33P , G-zářiče 125I)
◦ Měření – spektrofotometrické, fluorescence, luminiscence, radioaktivitaě e spe t o oto et c é, uo esce ce, u sce ce, ad oa t ta
Studium účinku chemických látek na aktivitu :
Metabolických enzymů (GAPDH, oxidázy)
Signálních enzymů (fosfolipázy, kinázy, fosfatázy…)
Bi f č í h ů (CYP450 UGT)Biotransformačních enzymů (CYP450, UGT)
Antioxidačních enzymů (SOD, CAT, GR, GPx …)
Kaspázy
O-linked β-N-acetylglucosaminyltransferase
http://jcggdb.jp/GlycoPOD/protocolShow.action?nodeId=t79
Proteinkinase AProteinphosphatase
Glucose oxidase
Caspase 3/7
Příklad: FRET mezi Cyan Fluorescent Protein
(CFP) a Yellow Fluorescent Protein (YFP)
Foersterův přenos energie mezi dvěma
AkceptorDonor
436 nm 480 nm
Foersterův přenos energie mezi dvěma
fluorofory
CFP YFP
436 nm 535 nm
CFP YFP
http://en.wikipedia.org/wiki/F%C3%B6rster_resonance_energy_transfer
Proteinkinázy a fosfatázy
– využití měření polarizace fluorescence (FP, fluorescence polarization) nebo Fluorescenční
(F t ů ) č íh ř i (FRET Fl R E T f )(Foersterův) rezonančního přenosu energie (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)
- Příklad: IMAP (Immobilizied Metal Ion Affinity-Based, Molecular Devices):
=> mikrodestičky se 107 substráty pro Ser/Thr kinázy a 57 substrátů pro Tyr-kinázy
IMAP Fluorescence Polarization Excitace polarizovaným
světlem vede k emisi
depolarizovaného světla v
důsledku rychlé rotace
l ý h l k l b ávolných molekul substrátu
Excitace polarizovaným
světlem vede k emisi
polarizovaného světla v
IMAP Fluorescence Resonance Energy Transfer
p
důsledku zpomalení pohybu
molekul substrátu vazbou na
IMAP
gy
http://www.moleculardevices.com/reagents-supplies/assay-kits/enzymes/imap-assays
LANCE®Ultra ULight™-labeled
Kinázy
- Příklad: LANCE Ultra Ulight (PerkinElmer) –g ( )
sada substrátů specifických pro Ser/Thr kinázy a
Tyr-kinázy
Fosfodiesterázy
IMAP Fluorescence Polarization
IMAP Fluorescence Resonance Energy Transfer
http://www.perkinelmer.com/catalog/category/id/LANCE+Ultra
http://www.moleculardevices.com/reagents-supplies/assay-kits/enzymes/imap-assays
Příklad: Vznik FRET po fosforylaci Příklad: Potlačení FRET po fosfroylaciPříklad: Vznik FRET po fosforylaci Příklad: Potlačení FRET po fosfroylaci
Příkl d Vli TCDD k i i SPříklad: Vliv TCDD na aktivitu c-Src
(potlačení FRET modelového substrátu)
Dong et al. 2011, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21145940
Seong et al. 2011, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3157646/
http://www.intechopen.com/books/state-of-the-art-in-biosensors-general-aspects/gfp-based-biosensors
 Ligand-binding assay (LBA) - interakce mezi receptorem a ligandem
 Řada toxikantů působí jako agonisté nebo antagonisté receptorů
(AhR ER AR GR PPAR RXR/RAR )(AhR, ER, AR, GR, PPAR, RXR/RAR…)
Separace
 Radioaktivně značené ligandy:
Analyt
nenavázaných
ligandů
Inkubace
(Centrifugace,
dialýza,
Receptor
Značený
ligand
Analyt
Filtrace)
 Nejčastěji B-zářiče – detekováno v přítomnosti
scintilačního koktejlu
 Nutná separace navázaných / volných ligandů Nutná separace navázaných / volných ligandů
(nejčastěji filtrace)
 Nebo receptor imobilizovaný na koloně (oncolumn),
zrníčkách (on-beads), či přímo na filtru
(Perkin Elmer)
deJong et al. (2005): Receptor–ligand binding assays
http://www.perkinelmer.com
 Scintillation proximity assay
 Stimulace scintilantu po navázání radioaktivního ligandu Stimulace scintilantu po navázání radioaktivního ligandu
 Zvýšení citlivosti, odpadá nutnost separace nenavázných ligandů
FlashPlate (PerkinElmer)Standard Assay
Scintillant embedded surfaceScintillant-embedded surface
deJong et al. (2005): Receptor–ligand binding assays
http://www.perkinelmer.com
 Fluorescenčně značené ligandy
N t á á ý h / l ý h li dů Nutná separace navázaných / volných ligandů
 Polarizace fluorescence (FP, fluorescence polarization)
 Odbourání tohoto kroku: využití FP nebo FRET
http://www.thesgc.org/screening-platforms
 Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET, Fluorescence Resonance
Energy Transfer)
deJong et al. (2005): Receptor–ligand binding assays
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/spectralimaging/spectralfret.html
 Protilátky – imunoglobuliny Protilátky imunoglobuliny
 Produkovány B-lymfocyty
 Třídy: IgA, IgD, IgG, IgE, IgM
 Lehký a těžký řetězec – Lc, Hcý ý ,
 Variabilní doména = vazebné místo pro
antigen
 Antigen = látka rozpoznávaná
protilátkou (antibody generator)protilátkou (antibody generator)
 Epitop = specifický povrchový rys
antigenu rozpoznávaný protilátkou
 Hapten = malá molekula, která vyvoláp , y
antigenní odpověď jen po navázání na
makromolekulární (neimunogenní)
nosič
 SPECIFICITA & AFINITA SPECIFICITA & AFINITA
 Produkci specifických protilátek lze
vyvolat imunizací laboratorních zvířat
příslušným antigenem (haptenem) –
jč ěji ží á k álík š k
http://cs.wikipedia.org/wiki/Protil%C3%A1tka
nejčastěji se používá králík, myš, koza,
ovce, osel…
http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n12/box/nrm972_BX1.html
http://www.kau.edu.sa/Files/0030203/Files/19622_Lec%2010%20Immunoassays_Instrumentation.pdf
 Proteiny jsou imunogeny => Lze vytvořit protilátky
rozpoznávající specifické proteiny nebo specifickérozpoznávající specifické proteiny nebo specifické
modifikace proteinů
 Lze vytvořit protilátky rozpoznávající malé
sekundární metabolity
ří é d h d í ké=> nepřímé studium/hodnocení enzymatické
aktivity (např. kvantifikace cAMP pro hodnocení
aktivity proteinkinasy A)aktivity proteinkinasy A)
 Polyklonální protilátky
Produkty různých klonů B lymfocytů
Monoklonální vs. Polyklonální
– Produkty různých klonů B-lymfocytů
- Směs protilátek rozpoznávajících stejný
antigen, ale různé strukturní varianty (epitopy)
- Izolovány a purifkovány ze séra imunizovaných
zvířat, levnější a rychlejší výroba, méně
á č á h lnáročná technologie
- Tolerantnější k variabilitě antigenu, větší
pravděpodobnost mezidruhové křížové
reaktivity
- Vhodnější pro imunoprecipitace
Produkce monoklonálních protilátek
j p p p
- Robustnější odpověď
- Větší variabilita šarží
 Monoklonální protilátky
myeloma
 Monoklonální protilátky
– Produkty stejného klonu B-lymfocytu
– Zcela identické vazebné místo, na antigenu
rozpoznávají tentýž epitop
– Lze je produkovat in vitro hybridomovouLze je produkovat in vitro hybridomovou
metodou (->nejčastěji myší), nákladné a
náročné
- Menší pozadí a menší míra nespecifických
reakcí a křížových reakcí
Lepší reprodukovatelnost menší variabilita- Lepší reprodukovatelnost, menší variabilita
- Náchylné na nepatrné změny epitopu, mohou
být druhově velmi specifické
http://www.nature.com/nchembio/journal/v4/n6/fig_tab/nchembio0608-326_F1.html
 Značení pro detekci / vizualizaci protilátek
 Radioaktivní
 Enzymatické
 Křenová peroxidáza
 Alkalická fosfatáza
 Fluorescenční
 AlexaFluor, CFTM, Fykoerythrin, Allo-phycocyanin,
FITC, Cy3, Cy5 …
 Biotinylace
 Tvorba komplexů Strept-/Neutr-/Avidin & biotinu
http://www.ebioscience.com
www.sigmaaldrich.com
http://www.applichem.com/en/products/biochemica/western-blot-elisa/
 Přímá detekce – značená primární protilátka
 Nepřímá detekce pomocí sekundární protilátky
 Primární neznačená protilátka rozpoznává požadovaný antigen
 Např. monoklonální myší IgG protilátka proti tubulinu Např. monoklonální myší IgG protilátka proti tubulinu
 Sekundární značená protilátka rozpoznává primární protilátku (zpravidla Fc
fragment IgG daného druhu)
 Např HRP konjugovaná polyklonální kozí IgG protilátka rozpoznávající myší Např. HRP konjugovaná polyklonální kozí IgG protilátka rozpoznávající myší
Fc-IgG
 Amplifikace signálu, odpadá nutnost značit každou primární protilátku
 Další amplifikace možné např použitím komplexů avidin-biotin Další amplifikace možné např. použitím komplexů avidin-biotin
http://piercenet.com
http://flowbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter_5%3A_Immunofluorescence_and_Colour_Compensation
 Křenová peroxidáza (horse-radish peroxidase, HRP)
Chromogenní substráty rozpustné:Chromogenní substráty – rozpustné:
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine
<1
HRP
pH<
http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/detection-methods
 Křenová peroxidáza (horse-radish peroxidase, HRP)
Chromogenní substráty nerozpustné:Chromogenní substráty - nerozpustné:
3,3´-Diaminobeznidin 4-Chloro-1-naphthol
http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/detection-methods
 Křenová peroxidáza (horse-radish peroxidase, HRP)
Chemiluminiscenční reakce:
LuminolLuminol
HRP
Intenzita a doba trvání lumininiscence je znásobena v přítomnostiIntenzita a doba trvání lumininiscence je znásobena v přítomnosti
p-kumarátu => Enhanced ChemiLuminiscence, ECL
http://mclaughlin.bio.ed.ac.uk/MCB/PRAC2/ecl.html
 Alkalická fosfatáza (AP, alkaline phosphatase)
Chromogenní reakce:
•5 bromo 4 chloro 3•5-bromo-4-chloro-3indolyl
phosphate (BCIP)
a nitroblue tetrazolium
(NBT)(NBT)
http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/detection-methods
 Alkalická fosfatáza (AP, alkaline phosphatase)
Chemiluminiscenční reakce:
• CSPD®• CSPD®
http://www.dartmouth.edu/~staphy/protocol/southern_with_dig_probe.html
 Fluorescenční značení
http://docs.abcam.com/pdf/immunology/fluorochromes_table_updated.pdf
http://docs.abcam.com/pdf/immunology/fluorochromes_table_updated.pdf
http://docs.abcam.com/pdf/immunology/fluorochromes_table_updated.pdf
 Avidin
(ptáci obojživelníci a plazi) => Silná a vysoce specifická(ptáci, obojživelníci a plazi)
 NeutrAvidin
(deglykosylovaný avidin)
 Streptavidin
=> Silná a vysoce specifická
vazba na biotin
(Streptomyces)
 Biotinylovaná sekundární protilátka + konjugát avidin-HRP
 Biotinylovaná sekundární protlátka + biotinylovaná HRP + avidin Biotinylovaná sekundární protlátka + biotinylovaná HRP + avidin
http://www.ebioscience.com/knowledge-center/product-line/elisa/high-sensitivity-elisa-kits.htm
http://www.piercenet.com/method/avidin-biotin-interaction#biotin
Důležité charakteristiky http://www abcam com/
 Typ protilátky
 Značená / neznačená
 Zdrojový organismus
http://www.abcam.com/
http://www.abnova.com/
http://www.bdbiosciences.com
http://www.cellsignal.com/
http://www lifetechnologies com Zdrojový organismus
 Monoklonální vs. Polyklonální
 Typ (IgG, IgM…)
http://www.lifetechnologies.com
http://www.merckmillipore.com
http://www.sigmaaldrich.com
http://www.scbt.com/…
yp ( g , g )
 Rozpoznávaný antigen (protein)
a jeho MW
◦ Nativní / denaturovaný protein
http://biocompare.com
◦ Nativní / denaturovaný protein
◦ PTM? (detekce specifických fosfomíst)
 Aplikace
ELISA IP W bl ICC / IHC FCM◦ ELISA, IP, Western blot, ICC / IHC, FCM
 Mezidruhová křížová reaktivita
 Skladování! (4C nebo -20C)( )
 Množství & doporučená ředění
Různá uspořádání:
• Heterogenní vs. Homogenní - vyžadují vs. nevyžadují separaci
komplexu Protilátka-Antigen
• Kompetitivní vs. Nekompetitivní
• Soupeření značeného a neznačeného antigenu (protilátky) o
vazbu na protilátku (antigen) vs. Bez přídavku kompetujícího
i ( ilá k )antigenu (protilátky)
• Přímá vs. Nepřímá
Detekce značenou primární vs Detekce značenou sekundární• Detekce značenou primární vs. Detekce značenou sekundární
Immunostanovení (RIA FIA EIA ) tradičně prováděny v roztokuImmunostanovení (RIA, FIA, EIA …) tradičně prováděny v roztoku
ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Analysis
– Imobilizace protilátek nebo antigenu na pevný povrch
- Generalizace termínu - protilátka v ELISA nemusí být nutně značena
enzymeme y e
Kompetitivní
radioimunoanalýza
http://www.perkinelmer.com/resources/technicalresources/applicationsupportknowledgebase/radiometric/radioimmunoassay.xhtml
Formáty ELISA
Direct ELISA Indirect ELISA
http://abnova.com
http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction/ELISA-types/competitive-elisa
http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction/ELISA-types/indirect-elisa
Sandwich ELISA
Kompetitivní ELISA
https://nanohub.org/resources/16944/watch?resid=17060&time=00:02:03
http://salimetricseurope.blogspot.cz/2012/08/salimetrics-publish-introduction-to.html
Využití principu FRET při značení protilátek:y p p p p
PerkinElmer: AlphaLISA a AlphaScreen (liší se typem akceptorových zrníček)
AlphaLISA AlphaScreen
Komerčně dostupné pro detekci širokého spektra signálních
molekul (cytokiny, receptory, transkripční faktory, markery
karcinogeneze)
http://www.perkinelmer.com/catalog/category/id/alphalisa%20kits%20for%20biomarkers%20and%20cytokines
- Analytická technika umožňující detekci specifického proteinu ve směsi s dalšímiAnalytická technika umožňující detekci specifického proteinu ve směsi s dalšími
proteiny pomocí protilátek
- Velká flexibilita & snadná a rychlá optimalizace pro různé proteiny
1.krok – separace proteinů podle molekulové hmotnosti
- Typicky SDS-PAGE (Laemmliho metoda)
2.krok – přenesení proteinů na membránu (blot)
= Western transfer, elektroblotting, immunoblotting
- nutné pro zpřístupnění proteinů pro detekci protilátkami
- imobilizace proteinů
3. krok – imunodetekce
- detekce přímá (značená protilátka)
d k ří á č á i á í č á k dá í- detekce nepřímá – neznačená primární a značená sekundární
 viz. předchozí přednáška
N jč těji SDS PAGE dl L lih Nejčastěji SDS‐PAGE dle Laemmliho
 Denaturované / redukované proteiny (vzorek v nanášecím pufru s SDS, DTT nebo B‐
merkaptoethanolem, zahřátí před nanesením na gel)
i k i ál í l k l id ý l ( i HCl) Diskontinuální polyakrylamidový gel (Tris‐HCl)
 Porozita gelu (% akrylamidu) <‐> rozsah separovaných MW
 Pufr: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1%SDS, pH8.3‐8.8
 Migrace proteinů (záporný náboj) směrem k anodě
 Migraci lze sledovat podle postupu čela vzorku zvýrazněného bromfenolovou modří 
(součást nanášecího pufru), případně podle postupu markeru MW
 Minigely: zpravidla 100‐200V, 1‐2 hodiny
http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
 Přenos gelu na membránu - PVDF, nitrocelulóza
 Gel vyjmut z kazety a ekvilibrován v transferovém pufru (max 30 min): Gel vyjmut z kazety a ekvilibrován v transferovém pufru (max. 30 min):
25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.02% SDS, 20%MeOH
(obsah SDS a MeOH se může lišit podle cílového typu proteinu – nízkomolekulární / vysokomolekulární,
hydrofilní / hydrofóbní)
 PVDF membrána
◦ hydrofóbní, nutno aktivovat ponořením do MeOH (30 s) a opláchnout vodou
 Sestavení „sendviče“
(Poré ní podložka)◦ (Porézní podložka)
◦ filtrační (blotovací) papír
◦ Membrána
◦ Gel
Fil č í (bl í) í◦ Filtrační (blotovací) papír
◦ (Porézní podložka)
 „Sendvič“ umístěn do blotteru
◦ Membrána směrem k anodě
◦ Gel směrem ke katodě
 Aplikace elektrického napětí
-> migrace proteinů k anodě -> přenos z gelu na membránu
-> zachování jejich pozice a relativních rozdílů v abundanci
http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
 Wet (Tank) Transfer
Wet (Mokrý přenos) Semi-dry
 Gel i membrána uzavřeny v kazetě
a zcela ponořeny v přenosovém
pufru mezi elektrodami
 Pomalejší (1-18 h), ale účinnější Pomalejší (1 18 h), ale účinnější
 Nutnost chladit a míchat!
(uniformita teploty a vodivosti)
 Semi-Dry Transfer
 Sendvič“ (Gel membrána a „ Sendvič (Gel, membrána a
filtrační papíry) ovlhčen
přenosovým pufrem a stlačen
mezi plochými kovovými
elektrodami semi-dry blotteru
 Rychlejší (15 min – 1 hod)
 Menší účinnost
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Western_blot_wet_transfer_system_Criterion-06.jpg
http://www.sciencegateway.org/protocols/cellbio/protein/wt.htm http://www.bio-rad.com/en-us/product/trans-blot-sd-semi-dry-transfer-cell
Nutno optimalizovat (čas, mA / V, složení pufru – SDS, MeOH, typ membrány)
 Kontrola kvality transferu – barvení proteinů na Kontrola kvality transferu barvení proteinů na
membráně:
◦ Ponceau-S
 reverzibilní, snadné odmytí v alkalickém pH
◦ Transiluminace
 pro PVDF membrány
 rozdílná propustnost světla v místech s proteiny v 20% MeOH
◦ Swift Stain etcSwift Stain etc.
Bl k á í Blokování
◦ Obsazení volných míst na membráně blokujícím
proteinem => omezení nespecifické vazby / sorpceproteinem => omezení nespecifické vazby / sorpce
protilátek
◦ Inkubace membrány v blokačním roztoku
 3-5% (w/v) odtučněné práškové mléko
 nebo 1-5% (w/v) bovinní sérový albumin aj.
 Rozpuštěné v PBS nebo Tris-buffered-saline, pH 7.4 s
0 05 0 1% Tween20 => tzv PBST nebo TBST0.05-0.1% Tween20 => tzv. PBST nebo TBST
 Nutno optimalizovat (typ, koncentrace, doba
blokování, teplota)
http://www.bio-rad.com/en-uk/product/semi-dry-rapid-blotting-systems/trans-blot-turbo-transfer-system
 Inkubace s primární protilátkou
Specifická pro zájmový protein a organismus◦ Specifická pro zájmový protein a organismus
◦ Mono/polykolonální, hostitelský druh
◦ Značená/neznačená
◦ Obvykle rozpuštěná v blokačním roztoku, inkubace 2h (RT) – přes noc
(lednice)
 Oplach membrány (PBST nebo TBST)
 Inkubace se sekundární protilátkou
◦ Specifická pro hostitelský druh primární
◦ ZnačenáZnačená
 Enzymaticky (HRP, AP)
 Fluorescenčně
A idi bi ti k l Avidin-biotin komplexy
 Oplach membrány
 Detekce signálu
http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/detection-methods
 Enzymatické značení – HRP:
◦ Chromogenní reakce
 3,3´-Diaminobeznidin, 4-Chloro-1-naphthol
 Vznik barevných proužků
Fotodokumentace (skener CCD gel doc) Fotodokumentace (skener, CCD - gel-doc)
◦ Chemiluminiscenční reakce
 Luminol
 => světelný signál
 Dokumentace na fotografický film
(expozice v temné komoře, vývojka, ustalovač)
b d k č í é lnebo dokumentační systém pro gely
 Alternativně i alkalická fosfatáza
 Fluorescenční značení Fluorescenční značení
◦ Dokumentační systém pro gely
◦ Excitace a emise příslušné značené protilátky
◦ Umožňuje multiplexingj p g
http://advansta.com/Standartization-Blot/
 Re-probing Re probing
◦ Opakované použití blotu pro detekci různých proteinů
◦ Ideálně odlišná MW & primární protilátka z jiného
iorganismu
◦ Alternativně stříhání membrány a paralelní inkubace
různých částí (oblastí MW) s různými protilátkami
◦ S opakovanými detekcemi může klesat kvalita výsledku
(„přeblokování“, poškození membrány, ztráta
antigenních vlastností)g
 Stripping
◦ Odstranění navázaných protilátek před další
imunodetekcíimunodetekcí
◦ Působením pH, detergentu, teploty => odmytí
navázaných protilátek
M ž šk í i◦ Možnost poškození antigenu
 Umožňuje relativní srovnání s kontrolou (negativní, Umožňuje relativní srovnání s kontrolou (negativní,
pozitivní, rozpouštědlová)
 Nutná kontrola nanášení Nutná kontrola nanášení
◦ House-keeping protein – abundantní protein,
nepředpokládá se jeho ovlivnění v souvislosti s
experimentálním zásahem (expozice látkou)experimentálním zásahem (expozice látkou)
◦ B-actin, a-tubulin, GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase)
◦ Barvení celkových proteinů – Ponceau S, Coomassieý p ,
(ireverzibilní, až po ukončení imunodetekce)
◦ Fosforylace – množství fosforylovaného vs. celkového
množství daného proteinu
 Jednoduché vizuální porovnání
 Denzitometrie – analýza obrazu, kvantitativní údajý , j
pERK1/2
pERK1/2p /
http://ehp.niehs.nih.gov/11728/ http://ehp.niehs.nih.gov/1003391/
http://www.intechopen.com/books/carcinogenesis/oestrogens-xenoestrogens-and-
hormone-dependent-cancers
lý d ál íh b Analýza digitálního obrazu
 Velikost a intenzita proužků
převedena na číselné hodnoty
 Normalizace na signál bandů
nanášecí kontroly pro příslušný
vzorek
 Výsledky zpravidla vyjadřeny
relativně jako podíl relevantní
kontroly (negativní,kontroly (negativní,
rozpouštědlová)
 ImageJ, Image Studio Lite, SW
příslušného dokumentačníhopříslušného dokumentačního
systému
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18377422
 Jednoduchá a rychlá detekční technika Jednoduchá a rychlá detekční technika
 Nanesení proteinového vzorku přímo na PVDF nebo
nitrocelulózovou membránu
( í f )(není SDS-PAGE / transfer)
 Další postup stejný jako u imunodetekce při Western
blottingug
 Semikvantitativní
Interakce receptor-ligand nebo protilátka-antigen
Formát chipu – stovky až tisíce interakcí
ProtoArray®
Kinázy, fosfatázy, GPCR,
jaderné receptroyjaderné receptroy,
proteázy
(>9000 cílů)
http://www.nature.com/nature/journal/v422/n6928/fig_tab/nature01512_F1.html
 Detekce proteinů pomocí protilátek přímo ve vzorcích tkání nebo
tkáňových kultur při zachování buněčných struktur / architekturytkáňových kultur při zachování buněčných struktur / architektury
tkáně
 Informace o lokalizaci proteinů vzhledem k morfologii buněk
 Fixace – zachování struktury buněk / tkáně
 Permeabilizace – přístup protiltáky k antigenu
 (Antigen-Retrieval – „odblokování“ antigenu pro protiltáku)
 Imunodetekce – blokování, primární, sekundární protilátka
 Counterstaining – vizualizace známých struktur (jádro, cytoskelet)
 Mikroskopická dokumentace
 Tkáňové preparáty
 Zpravidla v parafinu -> parafinové bločky Zpravidla v parafinu -> parafinové bločky
 Příprava řezů -> mikrotom
 Detekce – protilátky zpravidla značené
ti k h í d t kenzymaticky, chromogenní detekce
(autofluorescence zbytků parafínu) =>
mikroskopie při viditelném světle
 Preparáty tkáňových kultur
 Detekce – zpravidla fluorescenčně
č é tilátk fl č íznačené protilátky a fluorescenční
mikroskopie
2D-PAGE
Izolace proteinů
rolní
nované
Vizualizace
proteinů a
Kontr
Expono
proteinů a
dokumentace gelu
1. dimenze: Izoelektrická fokusace 2. dimenze: SDS-PAGE
Coomassie, stříbro,
Krypton, SYPRO
Ruby...
Analýza spotů
- identfikace ovlivněných proteinů na základě analýzy obrazu
- specializovaný software (PDQuest, Progenesis, BioNumerics 2D …) pro virtuální
překládání digitalizovaných obrazů gelů
- srovnávání polohy (pI / MW), velikosti a intenzity spotů => změny v expresi proteinů,
jejich postranslačních modifikacích spojených se změnou pI / MW
KontrolníExponované
Excize spotu se zájmovými proteiny
Š ě í i l
Přeložený obraz –
zvýraznění rozdílných
spotů
Štěpení proteinu v gelu
LC-MS/MS analýza štěpů (peptidů)
Příklad analýzy spotů (SW Progenesis SameSpots)
Kontrola Látka A Látka B Látka C
Spot matchingp g
Denzitometrie &
l í á írelativní srovnání
oproti kontrole
http://www.totallab.com/products/samespots/analysis-workflow/video-demo/
Excize zájmového spotu
manuální robotická
Štěpení proteinu v gelu
db í l ( k d t ř C i Bl )-odbarvení gelu (pokud nutno – např. Coomassie Blue)
-redukce a alkylace proteinů (zablokování tvorby S-S můstků)
-štěpení proteinů proteázami – nejčastěji trypsin
- dehydratace gelu v organickém rozpouštědle
h d t řít ti ště í íh f b h jí íh t i ště í l- rehydratace v přítomnosti štěpícího pufru obsahujícího trypsin => štěpení v gelu
http://www.seoulin.co.kr/mfsc/product/product_01.php?category=24b400000000000
Štěpení v gelu – proteázy
Trypsin
(C konec -R, -K)
Ch t iChymotrypsin
(C-konec -W, -Y, -F)
Lys-C
Lys-N
Arg-C
Glu-C
Asp-N
CNBr
Volbou proteázy a jejich
kombinacemi lze dosáhnout
https://worldwide.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/
kombinacemi lze dosáhnout
menšího počtu delších
fragmentů nebo velkého počtu
krátkých fragmentů
 Hmotnostně spektroskopická (MS, mass spectroscopy) analýza
peptidů
P tid M Fi i ti P t i Fi i ti Peptide Mass Fingerprinting, Protein Fingerprinting
Princip peptidového mapování
- unikátní protein (sekvence aminokyselinových zbytků) => vznikne unikátní sada peptidů pounikátní protein (sekvence aminokyselinových zbytků) > vznikne unikátní sada peptidů po
naštěpení => ty budou mít unikátní molekulovou hmotnost
Srovnání přesně
změřené hmoty
peptidu s hodnotoupeptidu s hodnotou
predikovanou z
databáze známých
proteinů (nebo DNAp (
sekvencí) a in silico
štěpení
Vyhledávací programy:
MASCOT
P F dProFound
MS-Fit
MOWSE
PepIdent MultIdentPepIdent, MultIdent
…
http://proteomics.missouri.edu/tutorials/mooney%20presentation.pdf
 MS instrumentace MS instrumentace
◦ vysoká přesnost určení hmoty
(m/z)
 Analyzátory doby letu (TOF)Analyzátory doby letu (TOF)
 Lineární iontová past (LTQ)
 Iontová cyklotronová
rezonance s Fourierovourezonance s Fourierovou
transformací (FT-ICR)
◦ Měkká ionizace
 MALDI (matrix-assissted laser
desorption & ionization)
 Elektrosprej (ESI)
http://www.uhkt.cz/files/proteomika/Hmotnostni_spektrometrie_1.pdf
T d á h t t í kt t i (MS/MS)Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS)
- Peptid o určité m/z (prekurzorový iont) je v hmotnostním spektrometru podroben fragmentaci => m/z produktů
fragmentace (produktových iontů)
http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_mass_spectrometry#mediaviewer/File:Mass_spectrometry_protocol.png
 K fragmentaci dochází v místě peptidové vazby K fragmentaci dochází v místě peptidové vazby
 Při fragmentaci s nízkou kolizní energií:
=> fragmenty (a), b, y
http://www.uhkt.cz/files/proteomika/Hmotnostni_spektrometrie_1.pdf
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Peptide_fragmentation.gif
 Vyhledávací programy Databáze sekvencí Vyhledávací programy
◦ MS/MS MASCOT
◦ SeQuest
S/ S SO
Databáze sekvencí
http://www.uniprot.org/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein
◦ MS/MS SONAR
◦ PepFrag…
 Peptidové sekvenování
◦ Spolehlivější a specifičtější identifikace než PMF
S čí ší č idů / k í k l Stačí menší počet peptidů / pokrytí sekvence => lze
identifikovat i málo abundantní proteiny
 GAFD <> DFAG (x PMF)
 Funguje lépe pro méně charakterizované / sekvenované
genomy
◦ Nákladnější
◦ Nižší throughput
 Extrahované proteiny z kontrolního a
experimentálního vzorku jsou
označeny pomocí různých
fluorescenčních značek
(nejčastěji CyDye, např. Cy3 a Cy5)
 Interní standard – směs kontroly a
exp. vzorku 1:1 (obvykle označená
pomocí Cy2)pomocí Cy2)
 Smíchání Cy3, Cy5 a Cy2 značených
proteinů => jejich další úprava a
separace pomocí 2D-PAGE probíhá
t j é lna stejném gelu
 Fluorescenční značení umožňuje
nasnímat z téhož gelu odděleně
proteiny z kontrolní a experimentálníp y p
varianty (+ interní standard pro
normalizaci)
=> Odbourání rozdílů spojených s
variabilitou mezi gelyMS identifikace
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2001252/
variabilitou mezi gelyMS identifikace
Chromatografická separace naštěpených
peptidů v kombinaci s MS nebo MS/MS
Umožňuje analyzovat komplexnější
vzorky
 Až tisíce proteinů v jednom vzorku
Není nezbytné před MS-identifikací
rozdělit jednotlivé proteiny a určit ty,
které chceme analyzovat (jako v 2DPAGE)
– možno štěpit proteiny přímo v
roztoku
 Příklady postupů:
•1D-PAGE-LC: Extrakce & 1D-PAGE &
štěpení v gelu & LC-MS/MS
•2D-LC: Extrakce & štěpení v roztoku &
2D-LC-MS/MS (separace peptidů na
dvou typech stacionární fáze, např. silný
katex v kombinaci s reverzní fázi, SCXRP)
=> tzv. MudPIT (multidimensional
protein identification technology)
http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_mass_spectrometry#mediaviewer/File:Mass_spectrometry_protocol.png
• …
Overview of proteomic analysis by MS/MS. Sample proteins are extracted and digested into peptides (A). The
sample complexity may then be reduced prior to chemical separation by LC (B). Fractions (indicated by dotted
arrow) are then analyzed by MS (C), during which the peptides are ionized and their mass-to-charge ratio (m/z)
measured to yield a precursor ion spectrum Selected ions are then fragmented by collision-induced dissociationmeasured to yield a precursor ion spectrum. Selected ions are then fragmented by collision induced dissociation
(CID) and the individual fragment ions measured by MS (D). The fragment ion spectra are then assigned peptide
sequences based on database comparison and protein sequences are predicted (E).
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
Velké množství proteinů ve vzorku
=> jen část bude identifikována
=> jen část bude kvantifikována
V závislosti na typu aplikace je redukce komplexity vzorku nebo
obohacení zájmových proteinů žádoucí:
- organelové proteinyorganelové proteiny
- fosfoproteiny
- IEF frakce
- frakce dle MW (výseky z 1D-PAGE gelu)( ý y g )
- imunokoprecipitace
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
• Relativní – srovnání s kontrolou
• Label-free aplikace
• Individuální příprava a analýza kontrolních a experimentálních vzorků
• Vliv variability v úpravě a přípravě vzorků (izolace subcelulárních frakcí• Vliv variability v úpravě a přípravě vzorků (izolace subcelulárních frakcí
proteinů, při purifikaci, obohacování, elektroforéze, štěpení proteázami) a
především mezi jednotlivými LC-MS/MS analýzami => rozdíly mezi vzorky
=> snaha minimalizovat tyto vlivy pomocí izotopového značení=> snaha minimalizovat tyto vlivy pomocí izotopového značení
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
• Izotopové značení
bil í i i di k i í! 13C 15N 18O• stabilními izotopy - neradioaktivní!: 13C6
15N4,
18O
• rozdílně Kontrola vs. Experimentální vzorek
• smíchání kontrolních a experimentálních vzorků / proteinů /smíchání kontrolních a experimentálních vzorků / proteinů /
peptidů před MS analýzou
• rozdílně značené proteiny / peptidy ze srovnávaných vzorků mají
stejné chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti =>stejné chemické a fyzikálně chemické vlastnosti =>
procesní a analytické postupy ovlivňují stejně kontrolní i
experimentální proteiny / peptidy
díl k ě k l í h ál í h dů• rozdíly ve kvantitě kontrolních a experimentálních peptidů
budou detekovány až pomocí MS resp. MS/MS
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
•Esenciální aminokyselina (např. 13C-Arg)
dodávána v kultivačním médiu ve formě
„těžkého“ izotopu
• Postupně zabudována do všech
buněčných proteinů
• Všechny peptidy obsahující –R budou mít
m/z větší o 6Dam/z větší o 6Da
•Trypsin
•Inkroporuje H2O na C-konec peptidu
•Štěpení vzorku v přítomnosti značené H218O => označení peptidů
• GIST - Acylace aminoskupin naštěpených peptidů 2H-značeným N-acetoxysukcimidem
• Dimethylace formaldehydem v přítomnosti 2H2O => deuterované metylskupiny
• ICAT - isotope-coded affinity tag
• deuterovaný (d8) iodoacetyl
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
• na peptidy po štěpení je navázána značka o stejné hmotě => nedochází k ovlivnění LC
separace, ionizacep ,
•Tandem Mass Tags – TMT – systém kombinující tzv. Mass Tag a Mass Normalizer
• Mass Tag – unikátní kombinace 13C and 15N zaručuje unikátní hmotnost pro danýg j p ý
Tag
• Mass Normalizer – komplementární kombinace izotopů 13C and 15N vyvažuje
hmotnost Mass Normalizeru vůči Mass Tag tak, aby součet jejich hmotností byl
stejný napříč různými TMT => peptidy z různých vzorků lze označit různými TMT astejný napříč různými TMT => peptidy z různých vzorků lze označit různými TMT a
pak zkombinovat a analyzovat v jednom LC-MS/MS běhu
• k odštěpení Mass Normalizeru dochází až během CID (kolizí indukovaná disociace)
v MS/MS
• iTRAQ – obdobný princip, značení pomocí Reporter/Balance Peptide
http://bgiamericas.com/service-solutions/services/proteomics/quantitative-proteomics/itraq/
 Absolutní Absolutní
 Použití známých koncentrací syntetických
těžkých izotopologů cílových peptidů =>těžkých izotopologů cílových peptidů =>
přídavek do vzorku
 Po LC MS analýze umožní výpočet absolutní Po LC-MS analýze umožní výpočet absolutní
koncentrace cílového peptidu
http://www.piercenet.com/method/quantitative-proteomics#discover_vs_targeted_proteomics
Top-down: ionizace intaktních proteinů nebo velkých fragmentů (<50 kDa) a
í di i ál í k li é h fi (LC)separace pomocí n-dimenzionální kapalinové chromatografie (LC)
Bottom-up: štěpení proteinů na peptidy a jejich LC případně 2D-LC separace