Genotoxicita
Testy na detekci mutací
Genotoxicita
• ...term that in a broad sense may refer to the property of a
substance as being harmful to the genetic material
(COM, 1898)
• …any deleterious change in the genetic material
regardless of mechanism by which the change is induced
(D´Arcy and Harron, 1993)
• …any agent which, by virtue of its physical or chemical
properties, can induce or produce heritable changes in
those parts of genetic apparatus that exercise homeostatic
control over somatic cells, thereby determining their
malignant transformation (Druckley, 1973)
Genetická toxikologie
• Toxikologie - zkoumání negativního vlivu
chemických sloučenin na živé organizmy
• Gen. toxikol. - 70. léta minulého století
• sleduje poškození DNA a jeho důsledky
chemickými látkami přítomnými v životním
prostředí
• jsou používány metody genetické analýzy a
tradiční toxikologické přístupy
• sledují se zejména pozdní účinky chemických
látek genetickými metodami
Cíle genetické toxikologie
• studium mechanismu genotoxickych učinků
různých faktorů
• vývoj detekčních systémů s požadovanými vlastnostmi
• hodnoceni genotoxického potenciálu látek
• analýza environmentálních směsí
• hodnoceni expozice vybraných populací
• studium vlivu genotoxických vlivů na výskyt vybraných
onemocnění
• studium geneticky determinované citlivosti ke
genotoxickým faktorům
Genotoxické látky a karcinogeny
• Většina nádorů vzniká vlivem expozice člověkem připravených a
přírodních karcinogenních látek v potravě, vodě, lécích,
tabákovém kouři, ovzduší a působením radonu a infekčních
agens. tj. vlivem řady prokarcinogenních a karcinogenních
faktorů.
• Bylo odhadnuto, že bez působení těchto vnějších faktorů, by byla
incidence nádorů významně snížena a to až o 80-90 %.
• Genotoxické karcinogeny
(působí ve fázi iniciace) Poškozují DNA a jejich účinek je zpravidla
ireverzibilní. Mají primárně bezprahový účinek. Pro chemické
kancerogeny je typický elektrofilní charakter a schopnost vytvářet
kovalentní vazby s DNA.
Primární (přímé) karcinogeny mají tyto vlastnosti bez nutnosti
biotransformace (např. alkylační látky),
Sekundární (nepřímé) karcinogeny až po biotransformaci (např.
aflatoxiny, polycyklické aromatické uhlovodíky, nitrosaminy aj.)
• Epigenetické karcinogeny
Nereagují přímo s DNA. Působí jinými mechanismy (imunosuprese –
purinové deriváty, hormonální mechanismy – estrogeny, cytotoxické
účinky atd.). Tyto látky se někdy nazývají promotory a navazují na
předchozí poškození DNA buňky.
Mutace vs. epimutace
(epigenetické změny)
• Epimutace – jakékoliv změny ve fenotypu, které
nejsou důsledkem změny sekvencí DNA. Tyto změny
mohou být stabilní a dědičné a zahrnují změny v metylaci
DNA, kontrole transkripce a translace a postranslačních
modifikace.
• Epigenetické procesy lze definovat jako modulace
genové exprese prostřednictvím mechanismů, které jsou
nadřazeny dané primární sekvenci –
např. odlišná exprese různých kopií stejného genu
(alel) – dvě alely někdy i se shodnou primární genetickou
informací se dědí do potomstva v odlišných stavech.
Postup při stanovení rizika konkrétní
chemické látky
1. hazard identification – identifikace rizika (např.
identifikace látky s mutagenní aktivitou)
2. dose-response assessment – stanovení vztahu dávka-
odpověď
3. exposure assessment – stanovení expozice – jak mnoho
chemikálií je absorbováno ze všech zdrojů
4. risk characterization – charakterizace rizika – stanovení
rizika určitého nepříznivého efektu (např. choroby)
vyplývající z předchozích výsledků ve vztahu k jednotlivci
či populaci
Bezpečná prahová dávka
Prospektivní přístup
Retrospektivní přístup
Identifikace mutagenní aktivity
sloučeniny
• informační zdroje
• metoda SAR (structure-activity
relationship) – počítačové modelování a
simulace (např. reakce s DNA)
• biologické testy mutagenity
(asi 200 testů)
Příklady databází obsahujících
informace o genotoxických sloučeninách
Legislativa
• V současné době je velmi významnou legislativou v
zemích Evropské unie nařízení č. 1907/2006 o zřízení
programů Registration, Evaluation, Authorisation and
Restriction of Chemicals (REACH) a European
Chemicals Agency (ECHA).
• Nařízení se vztahuje na chemické látky, vyráběné a
dovážené do Evropské unie v množství větším než
je 1 tuna za rok.
• Výrobci, dovozci a uživatelé těchto chemických látek
musí po zpracování předepsané zprávy o chemické
bezpečnosti a vyhodnocení míry rizika požádat o
jejich registraci u ECHA.
Testy mutagenity
Přehled testů mutagenity
Testy na detekci mutací - rozdělení
• krátkodobé (screeningové) x dlouhodobé
testy na savcích
• testy na gametické x somatické mutace
• testy prováděné in vitro x in vivo
• testy na detekci genových,
chromozomových, genomových mutací
• testy na reparaci DNA
Výpovědní hodnoty testů mutagenity
Přehled v současnosti doporučovaných testů pro
stanovení genotoxicity pro komerční chemikálie
Hodnocení mutagenity jednotlivých
chemických látek – systém „baterií testů“
Krátkodobé testy (např. Amesův test + cytogenetická analýza periferních
lymfocytů in vitro)
Dlouhodobé testy na savcích (DLM hlodavci)
Příklad testovací baterie (Kanada) pro
látky s omezeným použitím
Biomarkery:
1. expozice – např.
stanovení DNA aduktů
2. vnímavosti – vypovídají
o genetické predispozici
- analýza genetických
polymorfizmů, geny pro
epoxidhydrolázu,
glutathion- Stransferázu
aj.
3. účinku – např. mutace v
genech p53, HPRT
lokus, získané
chromozomové aberace
Monitorování prostředí - detekce
environmentálních genotoxických látek
A) laboratorní testy – odběr vzorku, testování
(např. Amesův test …)
B) monitorování (testy) in situ (sledování
genetického poškození u populace vyskytující se
v dané lokalitě – např. hlodavci, škeble, ryby,
rostliny…)
- chromozomové aberace
- mutace
Příklady využití in situ
Tradescantia testu
Příklady prokaryotických detekčních systémů
Plotnový test mutagenity podle Amese
• bakteriální detekční systém indikátorových kmenů Salmonella
typhimurium představuje nejvíce rozšířený přístup pro screeningové
hodnocení mutagenního potenciálu jednotlivých genotoxických
chemických látek a jejich komplexních směsí
• je používán i pro hodnocení biotransformačních produktů chemických látek
v tělních tekutinách (moč, krev) experimentálních zvířat a člověka
• indikátorové bakteriální kmeny S. typhimurium His- auxotrofie ve
vztahu k histidinu
• existuje celá sada indikátorových bakteriálních kmenů umožňující
detegovat specifický mechanismus působení testovaného mutagenního
agens (substituce, posunové mutace a interkalační změny)
• kromě mutace v histidinovém operonu mají kmeny mají další přidatné
markery zvyšující citlivost k chemickým látkám:
• mutace uvrB – vyřazení a blokáda syntézy enzymů excizní reparace
• mutace rfa – zasahuje lipopolysacharidovou membránu bakteriálních
buněk – zvyšuje se permeabilita povrchu bakteriálních buněk
• přítomnost plazmidu kódujícího rezistenci k ampicilinu či
tetracyklinu – zvyšuje citlivost k mutagenům
Plotnový test mutagenity podle Amese
Nejpoužívanější kmeny:
• TA 98 – posunové mutace
• TA100 - substituce
Provedení:
a) bez metabolické aktivace -S9
b) s metabolickou aktivací +S9 (homogenát z jater)
Nutno provést vždy i negativní kontrolu (kontrolní
rozmezí spontánních revertant) a pozitivní kontrolu
(použití známých mutagenů)
Amesův test
(Salmonella typhimurium) – princip zpětné mutace
vzorek
kontrola
Příklady mutagenů používaných jako
pozitivní kontrola u A. testu
Za mutagenní je považován vzorek s nejméně
dvojnásobným nárůstem revertant oproti kontrole !!!
Příklad použití Am. testu při testování mutagenity
černouhelného dehtu (obsahuje hlavně PAU)
promutagen !!!
SOS chromotest
• univerzální bakteriální detekční systém umožňující hodnotit
mutagenitu chemických látek vyvolávající taková
poškození DNA nebo inhibici replikace, která v buňkách
indukují SOS reparace
• test využívá specifického bakteriálního kmene Escherichia
coli K12 PQ37, indukce SOS funkcí je hodnocena pomocí
sfiA genu (patří do skupiny SOS genů)
• exprese sfiA genu je monitorována prostřednictvím
b-galaktozidázy (fúze sfiA genu s lacZ genem)
• metoda je založena na biochemické anlýze indukovatelné
b-galaktozidázy hodnocené kolorimetricky
SOS reparace
(koordinovaná syntéza enzymů a činnost reparačních
mechanismů indukovaná poškozením DNA)
Geny lexA
recA
SOS reparace
LexA protein se
in vitro
in vivo
= biomarker účinků na člověka
(predikce rizika vzniku nádorů)
Použití jako skupinový expoziční test i k posouzení
expozice jednotlivce
CHA = detekce časného genotoxického efektu
Pozdní genotoxický efekt = nádory
Cytogenetická metoda = biomarker
expozice genoxickým látkám
Cytogenetická Analýza Periferních
Lymfocytů = CAPL
Materiál: lymphocyty periferní krve, G0 fáze, přetrvání 1000-1500
dní
Kultivace: 48 hod, zpracování jako při karyotypování
Barvení - konvenční metoda !!!! – ne G-pruhování !
Hodnocení: počet aberantních bb. / 100/200 hodnocených mitóz
Typy aberací: zlomy chromatidové a chromozomové
acentrické fragmenty
di- a tricentrické chromozomy
kruhové chromozomy, výměny
Hodnocení nálezů:  5% bez závěru (u jednotlivce),
opakování=riziko
rozdíly v hodnocení jednotlivců a skupin (2 % hranice u skupin)
Příklady aberací - párový fragment,
kruhový chromozom
CAPL - samoplátci
Chromosomal aberrations in peripheral lymphocytes of children as biomarkers
of environmental exposure and life style.
Rossner P, Bavorova H, Ocadlikova D, Svandova E, Sram RJ.
Laboratory of Genetic Toxicology, National Institute of Public Health, Prague, Czech Republic.
pavel.rossner@szu.cz
The original purpose of our study was to determine if the detection of chromosomal aberrations in peripheral
lymphocytes of children might be used as a biomarker of environmental pollution and life style. We
compared the results of cytogenetic analyses performed in children and adolescents in
the periods 1984-1993 and 1994-1999, in a total of 3402 subjects. The frequency of
aberrant cells (AB.C.) markedly decreased in the period 1994-1999 compared with the period 1984-
1993. The decreases in AB.C. were significant in the age groups 7-15 and 16-19 years: 1.63% AB.C. versus
1.14% AB.C. and 2.02% AB.C. versus 1.08% AB.C., respectively (P<0.01). No difference in the frequency of
AB.C. was observed in newborns. Based on our experience, we believe that monitoring the spontaneous level
of chromosomal aberrations in children over 5 year periods may be used to examine the general changes in
environmental pollution in larger geographic areas.
Toxicol Lett. 2002 Aug 5;134(1-3):79-85.
Materiál: lymfocyty, b. bukální sliznice, spermie…
• detekce dizomií ve spermiích po působení mutagenů
nebo u infertilních mužů
• detekce původu mikrojader - centromerické sondy
detegují přítomnost či nepřítomnost centromery v mikrojádře
• detekce stabilních chromozomových aberací -
translokace
Použití FISH v genetické toxikologii
Sesterské chromatidové výměny
Sesterské chromatidové výměny - SCE
= zlomy DNA a reciproké výměny DNA duplexů mezi
sesterskými chromatidami, vznik v S fázi
Detekce BrdU metodou (harlekýnská metoda) = kultivace
buněk v mediu s BrdU po 2 cykly replikace, opracování
horkými roztoky, barvení Giemsou
BrdU analog T, inkorporuje se
do DNA, A-BrdU
buňky v 1. mitoze – chromatidy
homogenně zbarvené (rovnoměrně
substituované BrdU)
buňky v 2. mitoze – 1 chromatida
tmavá, druhá světlá (rozdílná
substituce BrdU - SCE
Templátová
molekula DNA
(chromatida) – není
inkorporován
BrdU, nově
syntetizovaná
molekula
DNA(chromatida)
– je inkorporován
BrdU
SCE
Mutageny a karcinogeny zvyšují frekvenci SCE/buňku
- látky, které tvoří kovalentní addukty nebo ovlivňují
replikaci (inhibice replikačních enzymů)
pravděp. vznik v místě replikační vidlice
Detekce počtu SCE v 30 - 50 buňkách – vyjádření
průměr. počtu na buňku (5 - 10 SCE na buňku u
kontrol)
Interfázní analýza získaných chromozomových
aberací
Mikronukleus test (mikrojaderný test) (MN)
Mikronukleus chromozomální fragment
celý chromozom
Analyzovaná buňka musí projít dělením !
Metoda blokování cytokineze cytochalazinem (CB) 
dvoujaderné buňky – mikronukleus = malý útvar barvící se
jako jádro
Nebo detekce v kostní dřeni exper. zvířat
Nezačlení se do dceřinného jádra !
Mikrojaderný test v dvoubarevných
buňkách
Testy mutagenity na Drosophila
melanogaster
• test na detekci somatických mutací a
rekombinací (SMART)
• detekce recesivně letálních na pohlaví
vázaných mutací (ClB, Basc, attached X)
Test na detekci somatických mutací a rekombinací
(SMART)u Drosophila melanogaster
SMART -wing spot test
AaBbCc
SMART test
Fenotypové projevy mutace mwh a flr
SMART test – princip – mutace
standardní alely
ClB test u Drosophila melanogaster
mutagen
V případě vzniku letální mutace – nebudou v generaci F2 samečci
l ?
XX x XY P
XX x XY F1
XY F2
V F2 vznikne jen
jedna kategorie
samečků !!!
Můžeme
detegovat
letální mutace
v
chromozomu
X jak u
samiček, tak u
samečků !
Attached X test – Drosophila
melanogaster
XyXyY x XY Výsledky – už v
generaci F1 !!!
Spot test u myší (somatické mutace)
Působení mutagenu na
embrya heterozygotní pro
geny barvy srsti !
Spot test u myší (somatické mutace)
Test na stanovení dominantních
letálních mutací
zánik zygot u
samiček
Genetické
změny ve
spermiích -
aberace,
genové
mutace
Testy na mutagenitu u rostlin
Rostlinné testy na detekci mutagenů
Mullerův embryonálně
letální test na detekci
gametických mutací u
Arabidopsis thaliana
- mutagenem působíme na semena
- test na detekci recesivních
embryonálně letálních a
chlorofylově defektních mutací
- sledování embryí budoucí
generace M2 v nezralých
semenech v šešulích
rodičovských rostlin
Recesívní mutaci detekujeme
už v generaci M1
(normálně až v M2)
Tradescantia test – test na detekci
somatických mutací
• test je založený na výskytu somatických mutací v trichomech
tyčinek květů klonu Tradescantia occidentalis, tento hybridní klon
vznikl mezidruhovou hybridizací T. hirsutifloria (modrá barva
květů) s a T. subacaulis (růžové květy)
• po mutaci nebo deleci dominantní alely se fenotypově projeví
recesivní alela pro růžové zbarvení
• klon 4430 – citlivý k chem. mutagenům,
• klon 02 – citlivý k účinku ionizujícího záření
• Působení mutagenu na: řízky, poupata
• každé květenství: 20 poupat, každý květ – 6 tyčinek, každá
tyčinka – 50 trichomů
• hodnotí se asi 10 květů
• Vhodné pro testování herbicidů, fungicidů, insekticidů,
exhaláty ovzduší, znečištění vody, půdy
heterozygot !
Tradescantia test
Tradescantia test - mutace
Detekce chromozomových aberací v meristematických
buňkách kořenových
špiček Vicia faba
Kometový test (comet assay)
technika detegující poškození DNA a reparaci v
individuálních buňkách
Östling & Johansson 1984
elektroforéza celých buněk
fragmenty jaderné DNA vycestují z jader
Kometový test
(SCGE – gelová elektroforéza jednotlivých buněk)
• stanovení zlomů DNA nebo lézí vedoucích ke zlomům v
jednotlivých buňkách (DSB, SSB)
Princip:
• izolace buněk (krev)
• nanesení na mikroskopická skla s agarózou (2 vrstvy)
• lze buněk (lyzační pufr, detergenty a soli o vysoké
koncentraci)
• dentaurace
• elektroforéza (DNA negativní náboj….k anodě)
• barvení fluorescenčním barvivem
• pozorování pod mikroskopem, měření délky komet
(jader)
• délka ohonu je úměrná počtu zlomů !!!
Kometový test –parametry používané k
hodnocení úrovně poškození DNA
Příklad použití kometového testu –
délka komet po aplikaci benzpyrenu