Aplikační oblasti organelové DNA Vzácné lidské choroby Forenzní vědy Chloroplastové genové inženýrství Samčí sterilita ve šlechtění rostlin Vzácné lidské choroby jsou způsobeny mitochondriálními mutacemi Aminokyseliny, mastné kyseliny a glukóza-vstupují do mitochondrií a jsou oxidovány za tvorby acetyl CoA (acetyl koenzym A). Acetyl CoA vstupuje do Krebsova cyklu, k oxidační kaskáda. Její výtěžek je vázán ve formě redukovaného koenzymu NADH (nicotinamid adenin dinukleoid). NADH přenáší své redukční ekvivalenty na 5 enzymových komplexů Cl až CV. Silné šipky ukazují tok elektronů v respiračním řetězci, který probíhá na vnitřní mitoch. membráně. H+ NADH \ Sukcinyl dehydroge- ) dehydro-náza genáza Cytochrom C oxidore-duktáza Tytoch ro ŕňX /K\P C oxidáza Ysyntáza Mutace a heteroplazmie Zygota získává velký počet organel prostřednictvím vajíčka Organely s mutací - černé Organely bez mutace - bílé Tkáně Organely se množí autonomně Dospelý jedinec má buňky s růz-jnou směsí normálních a abnormál-^ nich organel heteroplazmie V případě mutací způsobujících choroby mohou mít různé tkáně různé množství mutantní a normální mtDNA. Děti jedné matky tak mohou mít odlišné fenotypy v závislosti na množství mutantní mtDNA v jednotlivých tkáních Historie □ 1962 První zpráva o lidské chorobě v důsledku narušené energetické aktivity mitochondrií. Symptomy demence. □ Souvislosti mezi poruchou energetické aktivity mitochondrií a degenerativními postiženími mozku, myokardu i kosterních svalů, ledvin a žláz s vnitrní sekrecí. Názor, že příčinou jsou mutace jaderných genů. □ 80. léta 20. st. prokázáno, že mutace mitochondriálnich genů způsobují poruchy syntézy proteinů, jejichž prostřednictvím je tvořena H+-ATPáza. Důsledek narušení účinnosti komplexu respiračních reakcí, neboli tvorby energie v buňce. □ Choroby způsobené dysfunkcí mitochondrií jsou popisovány až od roku 1988._ Genetická klasifikace mitochondriálních chorob □ Defekty v jaderné DNA Defekty v transportu a využití substrátu Defekty v importu proteinů Defekty v Krebsově cyklu Defekty v oxidačně-forforylačních krocích Defekty v respiračním řetězci □ Defekty v mtDNA (genech) Velká přeuspořádání mtDNA - delece a duplikace Bodové mutace mtDNA = defekty v respiračním řetězci (viz. Komplexy enzymů s podiednotkami kódovanými mtDNA □ Defekty v komunikaci mezi mtDNA a jadernou DNA Tvorba opakovaných delecí mtDNA Ztráta mtDNA Defekty v respiračním řetězci (komplexy s podjednotkami kódovanými mtDNA) □ Získané defekty mtDNA Toxíny Léčiva - zidovudin Stárnutí Typy genových defektů mitochondriálních chorob □ Velká přeuspořádání mtDNA 1988 Holt a kol. koexistence normální a mutantní mtDNA s jednou velkou delecí (především) ve svalstvu pacientu. Kb Ctr P1 P2 P3 Diagnostika podle délky fragmentů mtDNA Ctr mtDNA standard P1 mtDNA standard + mtDNA s delecí 16.6 > (kratší fragment) P2, P3 vícenásobné delece P2 30 let P3 60 let = s věkem se zvyšuje množství mutantní mtDNA □ Bodové mutace mtDNA Diagnostika - všechny tkáně včetně leukocytu Mutace genu pro 12S rRNA, nukleotid 1555, A-G. homoplazmie, hluchota. 22 genů tRNA - identifikována řada substitucí tRNA pro Leu, nt 3243 A-G Onemocnění MELAS Příznaky: opakované záchvaty mrtvice před dosažením 40 let, často již v dětství, demence, hluchota. Asi 1-2% pacientů s diabetes mellitus má tuto bodovou mutaci v genu pro tRNA. Mutace v 22 genech mtDNA pro tRNA Myopathy, MELAS, MERRF, Exercise Intolerance, Ataxia, Mental Deficiency and Deafness Myopathy, MERRF, Ataxia, Retinitis, Pigmentosa and Deafness Ataxia, Mental Deterioration, Deafness, Hemiplegia, Myoclonus Leigh Syndrome and MELAS Encephalomyopathy and Lethal Infantile Mitochondrial Myopathy Myopathy, MELAS, Diabetes, Deafness, CPEO, Cardiomyopathy, KSS, Encephalomyopathy and MERRF Myopathy, Cardiomyopathy, CPEO, Encephalomyopathy, Encephalomyopathy, MELAS, Myopathy, Myopathy. MNGIE, Leigh Syndrome, Encephalomyopathy, DEMCHO and Diabetes Myopathy, DMDF, Encephalomyopathy, Respiratory Failure, Leukoencephalopathy, Retinitis Pigmentosa and Exercise Intolerance CPEO, Cardiomyopathy, Myopathy, MELAS. Exercise Intolerance Myopathy, DMDF and Encephalomyopathy MERRF, MELAS, Deafness and Retinitis Pigmentosa Myopathy, Encephalomyopathy Encephalomyopathy, CPEO, Myopathy and Multi-organ Failure Cardiomyopathy, Encephalomyopathy, Sudden Infant Death Syndrome Myopathy, Cardiomyopathy, Encephalomyopathy. Deafness and Dystonia CPEO and Exercise Intolerance Myopathy, Myoclonic Epilepsy & Psychomotor Regression Diabetes, Deafness, MERRF, MNGIE, Encephalomyopathy, PEO, Myopathy, Cardiomyopathy, MELAS and Exercise Intolerance Analýza mtDNA Histologické preparáty svalových vláken Sekvenování Amplifikace fragmentů mtDNA a reštrikční analýza (a) U C C Muscle Urine Blood (e) i .4 '■ * -131 bp -94 bp (0 U C COX-positive fibers COX-deficient fibers ft* iní uy ^ft^W^M*' ~131 bp -94 bp (g) (h) (i) 100 c o S CD CT) 80 ■ 60 40- 20 COX-positive fibers Mutation threshold -1- COX-deficient fibers a a 5' a c-g a-t g-c a-t g-c a-t ;ata-t T15967 fa a t t t g iiii g ta „ , t t-a g t-a a-t g-c c-g t t t g t C a i i i a g t T4C loop Patient Human Gorilla Chimpanzee Bovine Mouse Rat Chicken X. laevis S. cerevisae Ti|iC stem i-1 ggagt 15978 ggagt ggagt gaagt gaga c gggga gggga ggagg ggagg gttag T141C stem taaag— atttt taaag— cgagg— taatt— tgca--- gtagc— ggtagt-tttgagc tttgagt ttcgagt 15964 acttt acttt acttt gtttc tcctt tcctt cctcc ccttc ctatc FIGURE 2 | Laboratory investigation of novel mt-tRNA variants based on a previously published m.15967G>A MTTP mutation.65 Two muscle fibers (highlighted by an asterisk) are shown in a sequential series of transverse muscle sections from the patient highlighting the following _____i Xľi____ _ j___ Neurologické příznaky mitochondriálních chorob □ Obrna okohybných svalu □ Poškození zrakového nervu □ Mozková mrtvice u mladého člověka □ Křeče □ Svalové poškození □ Únava, neschopnost fyzické zátěže □ Ataxie - porucha koordinace pohybů □ Demence □ Periferní neuropatie - potižení nervů □ Kalcifikace bazálních ganglií Projevy poškození orgánů □ □ □ □ □ □ □ Poruchy vedení srdečního vzruchu Kardiomyopatie1 Diabetes mellitus Šedý zákal Laktátová acidóza2 Poškození ledvinných glomerulů Poškození sluchu □ Poškození jater □ Poškození slinivky bnsni □ Intestinální pseudoobstrukce3 □ Epizodické zvracení □ Pancytopenie4 □ Deprese 1 Úbytek a ochabování příčně pruhovaného svalstva. 2Nadbytek kyseliny mléčné v séru. Laktát je syntetizován při anaerobní glykolýze a při oxidativním aerobním metabolismu je rychle odbouráván. Defekty mitochondrií vedou k poruchám oxidativního metabolismu a tím k hromadění laktátu. 3Poruchy vyprazdňování střeva 4Současný pokles všech typů krevních tělísek. Chronická externí oftalmoplegie CPEO □ Genetický základ - bodové mutace v tRNA □ Paralýza okohybných svalů (oftalmoplegie) □ V pokročilejším stádiu i svalů dolních končetin □ Mikroskopické vyšetření - svalová _vlákna se jeví jako "potrhaná"_ Kearns-Sayrův syndrom KSS □ Genetický základ - delece v různých pozicích mtDNA □ V dětském věku - žádné symptomy, objevují se až v dospělosti (po 20. roku) □ Ztráta vidění- choroba retinis pigmentosa. Sítnice nefunguje jak má - nejdříve jsou nefunkční okrajové buňky tyčinky (špatné vidění za šera, v noci). Později jsou zasaženy i čípky = zrakové buňky ve středu oka = narušení barevného viděni. □ Ztráta sluchu □ Srdeční choroby - vady □ Demence, malý vzrost □ Ataxie □ Čím větší je podíl mtDNA s delecí, tím rozsáhlejší jsou symptomy □ = neuromuskulární choroba Leberova dědičná oční neuropatie LHON □ Mutace v mt genech oro respirační proteiny: ND1, ND2, NĎ4, ND5, ND6, COl, cytb □ Přes 50% případů je způsobeno v určité pozici genu kódujícího jednu podjednotku NADH aehydrogenázy □ Postihuje oční nerv, náhláoZtráta zraku u jednoho nebo obou očí Průměrný věk ztráty videm je 27 let □ Srdeční dysrytmie □ Výskyt vzácný 1:50000 □ Matejnální dědičnost X větvinou zjištěna u mužu, druh interakce genu vázaných na X-chromosom s mtDNA Leighův syndrom □ Mutace genu ATPasaó pro podjednotku mitochondriální ATP syntetázy □ Projevy již v dětském věku, nemoc je letalní: □ Progresivní ztráta motorických a verbálních schopností □ Postupná degenerace bazálních ganglií □ Neurogenní svalová slabost Mitochondriova encefalomyopatie, laktátová acidóza m.3244G>A m.3243A>T I m.3243A>G m.3258T>C m.3271T>C m.3291T>C m.7512T>C m.8316T>C M E LAS □ geny pro tRNA pro leucin □ a lysin □ Symptomy v dětském věku: □ Pomalý vzrůst, záchvaty a zvracení. □ Svalová slabost. Ochrnutí očních víček, poruchy sluchu a dýchání. Ztráta schopnosti řeči. □ Poškození mozku (spongiózní degenerace), laktátová acidóza, křeče, mozková mrtvice u mladého člověka. □ Duševní retardace, demence □ Mutace současně příčinou cca. 1,5% případů diabetu - Langerhansovy ostrůvky nemají dostatek energie, ztrácejí schopnost tvorby inzulínu._ m.12299A>C m.12147G>A Maternálně dědičná myopatie a kardiomyopatie MMC □ Myopatie - skupina chorob projevující se postupným úbytkem a ochabováním příčně pruhovaného svalstva □ Kardiopatie - trvalé poškození srdečního svalu, zbytnění a rozšíření komor a srdeční slabost Myoklonická epilepsie s "potrhanými" svalovými vlákny MERRF □ Poruchy centrální nervové soustavy, kostry a srdeční činnosti □ Epileptické křeče, svalové záškuby □ Ataxie - nedostatečná koordinace svalů □ Hluchota, demence □ Při mikroskopickém vyšetření vypadají svalová vlákna jako "potrhaná". MERRF Mutace genu pro tRNA pro lysin, tranzice A-G Tato záměna znemožňuje plnou kapacitu translace mtDNA v organele, což vede krůzným projevům poruchy. (a) m.611G>A m.3255G>A m.7512T>C i___y\ \ m.OíiyDA>o h—7\ m.8356T>C m.8344A>G m.8361G>A FIGURE 5 | mtDNA mutations associated with the MERRF an with the MERRF phenotype are indicated including m.8344A>G RRF = ragged red fiber = potrhaná vlákna Diagnostika ve vzorku tkáně svalu po biopsii: RRF obklopují normální svalová vlákna. Ultrastruktura mitochondrií je změněna: jsou zvětšené, zvyšuje se jejich počet, mají defektní systém krist Neurogenní svalová ochablost s ataxií a retinis pigmentosa NARP □ Neuromyopatie, ataxie a retinis pigmentosa degenerace retinálního neuroepitelu, □ atrofie zrakového nervu □ pigmentové změny na sítnici Získané poruchy mitochondriálního genomu □ Postupné hromadění mutací mitochondriálního genomu s následnou poruchou funkce mitochondrií bylo označeno za možnou příčinu Alzheimerovy nebo Parkinsonovy nemoci a jiných degenerativních chorob stáří. □ Mutace postihující gen pro tRNA řídící transport glutaminu je považována za příčinu vzniku asi 5% případů Alzheimerovy choroby v evropské populaci. AIDS □ Antivirové přípravky = substráty virové DNA-polymerázy, zabudování do virového genomu, poruchy replikace viru □ Vedlejší účinky léků na mtDNA □ Lék zidovudin - u pacientů myopatie □ zalcitabin - neuropatie □ didanosin - zánět slinivky (u 23% pacientů) □ Zabíjecí lék: fialuridin - hepatopatie (jaterní choroby) □ Lamivudin - nezpůsobuje poškození mitochondrií, minimum nežádoucích účinků Mitochondrie a smrt buňky □ Mitochondriální stárnutí □ lOx častější vznik mutací než v jaderné DNA □ Nadbytek volných radikálů □ Degenerativní choroby □ Stárnutí organismu □ poruchy paměti, sluchu, zraku, pokles vitality a obranyschopnosti Mt DNA a forenzní vědy □ Výhody □ Vysoký počet kopií mtDNA (kvantita) □ Nedochází k rekombinaci (stabilita) □ Maternální dědičnost □ Využití: rutinní analýzy mtDNA starých kostí, zubů, částí vlasů a chlupů (lidské i zvířecí) □ Hypervariabilní oblasti □ HV1 (nt 16024-16365) a HV2 (73-340) Analyza hypervariabilnich oblastf mt genomu Cofn^pare Consensus to Reference 1 Revest Das c npdon: 2 cons ansus sequa-nce s compared to Reference ±1 fCRS Companion Range-: Unriltertd —1 Base Positions: 1^024.. ISEiS 1.576 90 A, 2 ij T 2 -1 Total * 1 0082790 Cut Map TCjl |TG 3G3G 3 ifllG ™A £ 3 ^GA 7 A 3 C A1 5G^§TGCAC3CGiTA3Cil fij: qnh FT* J -: Te o it nTTT"GTGIG3G3GGI G £ i C G C GAT AG C A T El Chvomalogiaros froim 0SZ79Q I a [Hal TH i GGGGT— TGCA< G G T H T G C .-. C fi G T T T & C H C 1 £i t C H c nnnn *