Proteinové, buněčné a tkáňové čipy Jitka Malčíková 28.11.2014 Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Molekulární medicína, CEITEC MU Logo CMBGT_verze 5 final zakladni_CZ FN Brno_modra_obdelnik Genom (20-25 tis genů) Transkriptom Proteom (miliony proteinů) Dynamický systém – odráží momentální stav buňky Hladina proteinu často nekoreluje s hladinou mRNA Rozsah exprese - 106 iceberg Transkripce Posttranskripční modifikace Alternativní sestřih Translace Odbouráváni mRNA Posttranslační modifikace Alternativní konformace Proteomika Proteom - soubor všech proteinů v daném biologickém systému (buňka, tkáň, organizmus) Klinická proteomika - studuje celkový buněčný proteom v klinických vzorcích §Cíl - identifikovat a charakterizovat proteiny zapojené do vzniku a vývoje onemocnění Proteomické metody §Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) úČasově, finančně náročné úTěžko reprodukovatelné §2D Kapilární elektroforéza §Hmotnostní spektrometrie §ELISA – zejména v diagnostice §Proteinové čipy úVysokokapacitní úPoměrně jednoduché zpracování úExpresní i funkční studie úVyžadováno minimální množství vzorku Proteinové čipy § § §Expresní („analytické“ čipy) ústanovení přítomnosti a koncentrace proteinů v komplexních vzorcích §Protilátkové čipy §Lyzátové čipy §Antigen čipy § §Funkční ústudium interakce proteinů s jinými molekulami §proteiny, peptidy, nízkomolekulární látky, oligosacharidy, DNA ú Princip proteinových čipů §Vazba protilátka-antigen - mikrospot ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) úMiniaturizace imunoassays - malé množství vázané protilátky a malý objemu vzorku úCitlivější než systém se stonásobně větším objemem materiálu (vyšší poměr signal –to-noise) úRychlejší provedení – kratší difuzní vzdálenost úMožnost multiplexování úMalá spotřeba materiálu ú úCitlivost řádově ve femtomolech - 106 molekul/ml §Množství navázané molekuly je sice velmi nízké, ale v rámci mikrospotu lze dosáhnout vysoké hustoty ú úStanovení koncentrace analytu ve vzorku §Koncentraci přímo odpovídá množství vázaného analytu (Ekins RP, J Pharm Biomed Anal. 1989) abarray Princip proteinových čipů §Stovky – tisíce proteinů imobilizovaných ve formě mikrospotů na pevném povrchu §Planární povrchy ú membrány (polystyrenové, PVDF - polyvinyliden fluorid, nitrocelulosové) ú standardní mikroskopická sklíčka §s chemicky modifikovaným povrchem (poly-lysin, aldehydické skupiny) §potažená membránou §mikrospoty 100–250 mm §„printing“ spotů je zásadní a ovlivňuje variabilitu a reproducibilitu §Kontaktní – využívá kapilární síly §Piezoelektricky – využívá elektrický pulz k uvolnění kapky §Pomalejší ale menší variabilita §Variabilitu snižuje přítomnost replikátů Detekční metody úNejčastěji fluorescence úEnzymaticky – značení alkalickou fosfatázou, křenovou peroxidázou úChemiluminiscence úRadioaktivita úZvýšení signálu – značení biotinem – vazba na značený streptavidin úHmotnostní spektrometrie Možnost dvoubarevné detekce Vyšší citlivost a specifita Čipy pro stanovení antigenů Xiaobo et al. 2010 Xiaobo et al. 2010 Sendvičová metoda Přímé značení Protilátkové čipy §Přímý formát (FPA- forward phase arrays) §Na povrchu spotované protilátky (velikost spotu 0,3-0,5 mm) §Inkubace se vzorkem § § § § § § § § § § §Detekce stovek antigenů ve vzorku §Expresní profilování – „large-scale“ monitorování proteinové exprese §Cílené na určité buněčné procesy (buněčný cyklus, cytokiny, MAPK dráha, p53 dráha…) Lyzátové čipy §Zpětný formát (RPA – reverse phase arrays) §Na povrchu spotované vzorky (proteinové, tkáňové lyzáty, sérum) §Inkubace se specifickými značenými protilátkami § § § § § § § § § §Srovnání exprese až desítek antigenů u stovek různých vzorků §Nevýhoda – malá hustota studovaných molekul ve spotu – pre-frakcionace pomocí 2D kapalinové chromatografie Čipy pro stanovení protilátek § § Antigen čipy §Na povrchu spotované známé antigeny úsyntetické proteiny, peptidy §Inkubace se sérem obsahujícím studované protilátky §Detekce přítomnosti protilátek ve vzorku, nejčastěji v séru Xiaobo et al. 2010 Bead array - mikrosféry § § §průměr ~ 5-10 μm (velikost lymfocytu) § polystyrenové nebo latexové kuličky §„kódovány“ rozdílnými barvami nebo velikostmi § Detekce – na principu flow cytometrie úrozpoznávání rozdílně kódovaných mikrosfér úidentifikace a kvantifikace proteinů ve vzorku §Množství stanovovaných proteinů je limitováno počtem druhů mikrosfér (~1000) §Značení Quantum dots - teoreticky až 40 000 §Možnost automatizace §Využití – cílené – zejména detekce cytokinů, protilátek (alergie, autoimunita), ale např. i detekce fúzních proteinů a onkoproteinů §Luminex xMAPTM - otevřený systém ú www.lucerna.chem.ch Buněčné čipy § § §Přímý formát úSpotované protilátky úInkubace s buněčnou suspenzí úNapř. spotované CD molekuly – inkubace s leukocyty – charakterizace leukemických buněk § §„Transfekční čipy“ - buňky rostou na povrchu čipu s naspotovanou cDNA úBěhem růstu přijmou cDNA úČip se spoty buněk exprimujících různé cizorodé proteiny Buněčné čipy § § § §Detekce úPřímo mikroskopicky na sklíčku úDalší charakterizace značenými protilátkami Tkáňové čipy §Varianta RPA čipů (zpětný formát) §Spotují se celé vzorky tkání např. bioptických §Inkubace se značenými protilátkami §Velikost spotu 0,6 - 2mm nrd1254-f2 SELDI § § §Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation §Inkubace lyzátů na makrospotech adsorpčního povrchu s různou povrchovou úpravou §Nespecifická vazba proteinů §Detekce hmotnostní spektrometrií §Nižší citlivost §Umožňuje vyhledávání neznámých biomarkerů Funkční čipy § § §Studium interakce s jinými molekulami úInkubace s jinými proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) §Studium posttranslačních modifikací §Studium enzymatické aktivity §Studium kofaktorů a inhibitorů §Studium interakcí ligand-receptor Spotovány nativní proteiny §Potřeba zachování struktury a biologické aktivity úProblém imobilizace, zachování konformace a orientace na čipu i během skladování ú1. funkční čipy – mikrojamičky v silikonovém elastomeru na povrchu mikroskopického sklíčka (Zhu et al., Nat Genet 2000) § §Nespecifická vazba přímo na povrch úAdsorpce úKovalentní vazba přirozených chemických skupin proteinu na upravený povrch úAktivní část proteinu může být schovaná, problém zachování konformace § §Chemoselektivní vazba – připojení chemické skupiny na definovanou pozici proteinu → specifická reakce s komplementární chemickou skupinou na povrchu sklíčka úOrientovaná pozice na sklíčku ú §Imobilizace přes specifický rekombinantní tag Imobilizace přes rekombinantní tag §Během syntézy studovaného proteinu se na C nebo N konec přidá afinitní tag, který specificky interaguje s povrchem čipu §Zachování orientace, konformace §Funguje jako „spacer“ – oddálení proteinu od povrchu - odkrytí reaktivních míst a umožnění interakcí úPoly(aminokyseliny) – poly(His), poly(Cys), poly(Lys) úGlutathion-S transferáza (GSH) úMBP (maltózu vázající protein) úBiotinylovaný tag ú… protein attachment biotinylation 50Å Využití interakce biotin - streptavidin § § streptavidinem pokryté mikroskopické sklíčko Biotinylovaný tag správně složený protein Analýza DNA-vazebných schopností p53 mutantů chip barevny s vyznacenyma kodonama §P53 array – 50 variant p53 úwt ú48 mutací – 43 missense, 5 nonsense §Studium efektu mutací a polymorfismů úna interakci s jinými proteiny úna konformaci – konformačně-specifická protilátka úna vazbu k DNA - vazba proteinů navázaných na čipu k fluorescenčně značeným oligonukleotidům obsahujícím responzivní elementy p53 cílových genů ú Další typy funkčních čipů § § §Doménové čipy úSpotovány pouze jednotlivé domény proteinu úPochopení protein-proteinových interakcí § §Peptidové čipy úInkubace s proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) § §Čipy s chemickými knihovnami úInkubace s proteiny (enzymy, receptory…) úStudium inhibitorů, studium ligand-receptorových interakcí- vyhledávání terapeutik Typ čipu Molekuly imobilizované na čipu Stanovované molekuly Inkubace Počet spotů Použití expresní protilátkové (přímý formát) známé protilátky antigeny neznámý vzorek - proteinový lyzát > 1000 proteinové profilování lyzátové (zpětný formát) neznámý vzorek - proteinový lyzát antigeny známé protilátky >1000 proteinové profilování antigen čipy známé antigeny protilátky neznámý vzorek – protilátky v séru >1000 stanovení přítomnosti protilátek v séru funkční protein-protein známé proteiny v nativním, funkčním stavu nebo peptidy, nebo chemické látky partnerské molekuly interagující s proteiny nebo proteiny >100 studium interakcí proteinů s partnerskými molekulami protein-DNA, RNA protein-nízkomolekulární látky Enzym- substrát Využití §Studium biomarkerů – diagnostické, prognostické, prediktivní § §Identifikace terapeutických cílů § §Studium vlivu terapie § §Detekce autoprotilátek a autoantigenů, studium imunitní odpovědi, analýza alergenů § Využití §In vitro diagnostika – více než u ostatních typů čipů úNejčastěji diagnostika autoimunitních onemocnění, alergií úDiagnostika infekčních onemocnění úProfilování biomarkerů úSepse a záněty úNeurodegenerativní onemocnění úNádorová onemocnění ú Cretich et al., 2014