Výzkumné strategie pro využití
čipových technologií,
využití v onkologii
Veronika Navrkalová
Středoevropský technologický institut (MU)
a
Interní hematologická a onkologická klinika (FN Brno)
Obsah
• Obecné využití čipových technologií
• Příklady využití v různých biologických
oborech
• Využití v biomedicíně a onkologii
• Konkrétní příklady z hematoonkologického
výzkumu – lymfomy a leukémie
• Aplikace při studiu CLL a využití na našem
pracovišti
Obecné využití
• profilování genové exprese (GEP)
→ porovnání odpovědi buněk na stres,
vliv prostředí na organismy, identifikace úrovně
rezistence, detekce koexprimovaných genů (mohou
spolu funkčně souviset)
• genotypizace → detekce mutací, SNPs
• analýzy CNVs, exprese mikroRNA, detekce
CpG metylací
• studium interakcí DNA s bílkovinami
• funkční analýzy genů
Mezioborové využití
• Biomedicína: široké využití, hlavně v onkologii
 určení správné diagnózy, klasifikace nádorů,
nasazení efektivní léčby, včasná detekce markerů
onemocnění
• Biochemie: proteinové čipy
o analytické - detekce proteinů ve směsi
(SARS, Treponema pallidum)
o funkční - studování intermolekulárních interakcí,
identifikace vazebných míst pro léčiva
• Mikrobiologie a virologie:
 detekce původců onemocnění (hrozba terorismučip
pro detekci 18 patogenních mikroorganismů,
např. Bacillus antracis, Clostridium botulinum,
Ebola virus a další (Wilson et al., 2002)
 komparativní genomika - porovnávání genomů
příbuzných organismů, druhů, poddruhů a izolátů →
odhalení faktorů virulence, genetické různorodosti
(př. Mycobacterium avium)
 vyhledávání mutací v genech
zodpovědných za vznik resistence
na antibiotika (Mycobacterium
tuberculosis - genu proB a rifampicin)
• Metagenomika:
o studium mikroorganismů bez jejich předchozí
kultivace → lepší pochopení biologické diverzity
o vzorky jsou posbírány přímo v daném prostředí →
izolace DNA → přímá analýza
o využití v medicíně, ekologii, zemědělství, atd.
• Farmacie: vývoj nových léčiv, vyhledávání
potenciálních cílů terapie (genů, proteinů)
• Forenzní genetika:
o SNParray (identifikace osob)
• Biologie rostlin:
o funkční genomika - studium cirkadiánních rytmů,
odpovědi na stres, vývoje semen, signalizačních
drah, asimilace dusičnanů
Využití v biomedicíně
• detekce patogenů a studium vzniku rezistence
na antibiotika
• studium geneticky podmíněných chorob:
 detekce mutací; potvrzení/vyvrácení diagnózy; včasné
odhalení onemocnění; sledování výskytu mutantních alel u
rodinných příslušníků; prenatální testování u postižených
matek
 př. BRCA1 (nádory prsu a vaječníku), CFTR (cystická
fibróza), ATM (Ataxia telangiectasia), TP53 (Li-fraumeni sy.)
• charakterizace nádorových tkání:
 molekulární klasifikace nádorů
 odlišení nádorové tkáně od normální
 identifikace genových profilů predikujících metastázování
a determinujících prognózu
 navržení specifické léčby
 př. nehodgkinské lymfomy
a leukémie, nádory prsu a
další solidní nádory
• profilování genové exprese u pacientek s karcinomem
prsu
• pomocí GEP 70 genů byli schopni predikovat vznik
metastáz s 89% přesností
• výraznější individualizace protinádorové léčby (pacientky
s nízkým rizikem relapsu by tak nemusely vůbec
podstupovat adjuvantní chemoterapii)
(Nature 2002)
Využití v hematoonkologii
Profilování GE částečně odráží druh buňky,
stádium diferenciace, aktivitu vnitrobuněčných
signálních drah, rychlost proliferace
 identifikace molekulárních markerů
(diagnostické, prediktivní)
 klasifikace leukémií a lymfomů
dle aberací
 vývoj nádorově specifické,
individualizované terapie
Nejčastěji se používají:
• expresní čipy – studium odlišně exprimovaných
genů např. před/po léčbě
• aCGH - detekce chromozomových aberací;
srovnatelné s FISH (nižší detekční limit 25-30%
vs. 10%, ale vyšší rozlišovací schopnost 100 kb
vs. 5-10 Mb)
• SNP čipy – detekce SNPs a CNVs
• resekvenační čipy – mutační analýzy
Příklad aCGH
30,6 Mb delece v oblasti
5p15.33-13.3
Aplikace u lymfomů
Difůzní velkobuněčný B-lymfom
Profilování GE vedlo k objevu 2 podskupin DLBCL
podle úrovně diferenciace buněk:
• GCB typ - buňky germinálního centra
• ABC typ - in vitro aktivované periferní B-
lymfocyty
Pacienti s GCB
fenotypem měli
výrazně lepší šanci na
pětileté přežití oproti
pacientům s ABC
fenotypem (76% vs.
16%, p=0,01)
(Alizadeh et al., 2000)
Folikulární lymfom
Expresní profil 191 vzorků rozlišil dvě skupiny FL,
které silně korelovaly s přežitím pacientů (Dave et
al., 2004)
GEP také umožnil rozlišení FL pacientů s
indolentním nebo agresivním onemocněním 
možnost nasazení vhodnější léčby (Glas et al.,
2005)
Burkittův lymfom
GEP je vhodný nástroj pro odlišení BL a DLBCL
(liší se agresivitou a léčbou) (Dave et al., 2006)
Lymfom plášťové zóny
Stanovení typického profilu pro MCL a jasného
rozdílu mezi cyklin D1 pozitivní a negativní
skupinou MCL (Rosenwald et al., 2003)
Analýzou GE bylo identifikováno 300-400 genů s
odlišnou expresí pro MCL ve srovnání s
normálními B-lymfocyty (Sara et al, 2002)
Aplikace u leukémií
Rozlišení základních 4 druhů leukémie podle genové
exprese - 49 genů reprezentujících jednotlivé typy
leukémií (AML, ALL, CML, CLL) (Song et al., 2006)
Akutní myeloidní leukémie
Rozlišení pacientů s příznivou a nepříznivou
prognózou (Yagi et al., 2003)
Pomocí aCGH zjištěny časté amplifikace na chr.21
zahrnující geny ERG, ETS2 a APP (Baldus et al.,
2004).
Akutní lymfoblastická leukémie
Rozdělení ALL do sedmi podskupin na základě
profilu genové exprese - 1. T-ALL, 2. hyperploidní
karyotyp (do 50 chromozómů), 3. BCR/ABL, 4.
E2A-PBX1, 5. TEL-AML1, 6. MLL, 7.unspecified
ALL (Yeoh et al., 2002)
Podle expresního profilu 95 genů je možné
stanovovat citlivost ALL buněk k inhibitoru tyrozin
kináz STI571 (imatinib) používaného pro léčbu
CML (Hofmann et al., 2002)
Chronická myeloidní leukémie
Odlišné profily GE v různých fázích CML
(chronická fáze vs. blastická krize) (Wu et al.,
2004)
Objasnění rezistence na TKIs (imatinib) a
predikce odpovědi na léčbu (Tipping et al., 2003)
Pomocí tkáňových čipů byla zjištěna vyšší
exprese kinázy Fyn ve stádiu blastického zvratu
než v chronické fázi CML (onkogen BCR-ABL1
up-reguluje Fyn) (Ban et al., 2008)
Chronická lymfocytární leukémie
Analýza exprese CD antigenů různých
leukemických buněk pomocí protilátkových čipů:
rozlišení normálních a CLL buněk poskytují
antigeny CD19, CD20, CD21, CD22, CD23,
CD24, CD25 a CD37 (Belov et al., 2001)
Stanovení charakteristického profilu genové
exprese pro CLL: nezávislý na mutačním stavu
IGHV, podobný paměťovým B-lymfocytům (Klein
et al., 2001, Rosenwald et al., 2001).
Korelace několika genů s nemutovaným IGHV:
objev ZAP-70 patří k nejvýznamnějším
příspěvkům DNA čipů do klinické praxe v oblasti
prediktivní diagnostiky (Rosenwald et al., 2001)
Pacienti s del13q jako jedinou cytogenetickou
aberací byly pomocí GEP rozděleni na dvě
skupiny: ≥80% ztrátou 13q přežívají kratší dobu a
mají kratší čas do první terapie než pacienti se
ztrátou ≤ 80 %
(Hernandez et al., 2009)
Pomocí array CGH byly u CLL nalezeny další
chromozómové aberace: kromě rekurentních
del13q, del17p, del11q, tri12 také trizomie 19 a
amplifikace onkogenu MYCN na chrom. 2p24
(Schwaenen et al., 2004)
Korelace nejčastějších genomických aberací s
redukovanou expresí genů ležících v těchto
oblastech (del11q-ATM, del 17p-TP53 aj.)
(Haslinger et al., 2004)  efekt dózy genů u CLL
Studium DDR (DNA damage response) dráhy
Analýza ATM-mut, TP53-mut a wt vzorků odhalila,
že transkripční odpověď na poškození DNA (IR) je
dvojí:
• p53 proapoptická odpověď
(zahrnuje pouze část ATM
transkripční odpovědi)
• ATM odpověď směřující k
přežití buněk (nezávisle na
p53)
(Stankovic et al., 2004)
MicroRNA a CLL
Mikročip pro profilování exprese miRNA (245
lidských a myších genů): CLL specifický profil
miRNA (Liu et al., 2004)
Profilování exprese odhalilo unikátní miRNA profil
13 genů, které jsou specifické pro ZAP-70+ a
IGHV nemut případy s progresí choroby (Calin
et al., 2005)
Výzkumné účely – naše pracoviště
(IHOK FN Brno a CEITEC)
Expresní čipy: rozlišení nejčastějších B-buněčných
lymfomů (DLBCL, FL, MCL, BL)
aCGH: detekce nebalancovaných chromozomových
aberací u CLL
Resekvenační čipy: mutační analýza několika
desítek genů zároveň – TP53, ATM, Rb1, geny
pro miRNA, atd.
SNP čipy: detekce CNVs u CLL
CustomSeq® Resequencing
Array
Navržen pro detekci mutací v genech asociovaných
s patogenezí CLL: DDR geny, apoptické geny,
miRNA, kontrola buněčného cyklu, proliferace a
diferenciace, …
Kapacita 50kb dsDNA
gDNA  long-range PCR  kvantifikace (PicoGreen) 
pooling  purifikace  fragmentace (20-200 bp) 
značení  hybridizace (16 h)  barvení a promývání 
skenování  analýza dat
Pricip
Hybridizace cílových
úseků DNA na
oligonukleotidové
sondy imobilizované
na čipu
8 unikátních prób (25mer)
pro každou
bázi, próby se liší v
centrální pozici
Výstup
Výhody a nevýhody
Robustnost, nižší cena, menší časová náročnost,
senzitivita (10% vs. 20% Sanger), paralelní
analýzy několika genů naráz, předběžná
mutační/SNP analýza
Neschopost detekovat krátké inzerce a delece,
nutnost konfirmace výsledků jinými metodami
Současný stav
Nahrazování čipových technologií sekvenováním
nové generace (NGS)
Limity čipů: spolehlivost a reprodukovatelnost
(nedostatečně homogenními soubory pacientů,
rozdílná kvalita izolované RNA, variabilita
statistických metod a různá kritéria statistické
významnosti), problém s detekcí inzercí/delecí
Výhody NGS: flexibilita, snižování ceny, citlivost,
robustnost
Děkuji za
pozornost