PCR v reálném čase doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu. cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 Doporučená literatura Bustin S.A. (2004): A-Z of Quantitative PCR, International University Line, La Jolla, California Obsah přednášky 1) Princip PCR v reálném čase 2) Komponenty specifické pro real-time PCR 3) Vlastnosti fluoroforů 4) Vlastnosti zhášečů 5) Sondy 6) Nespecifické formáty 7) Specifické formáty 8) Příklady využití 9) Emulsní PCR a py rose kve n ování „Real-time PCR"je nejmodernějším výdobytkem polymerázové řetězové reakce Real-time PCR - princip > kombinované provádění DNA amplifikace a detekce cílové nukleové kyseliny současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů > je možno dynamicky posuzovat průběh syntézy PCR produktu > stanovení množství matrice vložené do reakce (kvantitativní PCR) Výhody real-time PCR > stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky - snížení rizika kontaminace > není třeba provádět elektroforézu > automatizace procesu pro klinické využití > kvantifikace tem plátu - množství patogenního mikroorganismu, hladina mRNA > rozmanité typy sond - více lokusů v jedné reakci (multiplex) Komponenty real-time PCR > Fluorofory > Zhášeče > Sondy PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye Quencher Dye Fluorofory Navazují se na amplikony nebo jsou jimi značeny hybridizační sondy 1) Nespecifické metody: založené na nespecifické vazbě fluoroforu do vznikající molekuly dsDNA 2) Specifické metody: založené na specifické vazbě sondy označené fluoroforem Vlastnosti fluoroforů 1) Velká část fluoroforů jsou heterocyklické polyaromatické uhlovodíky 2) Jejich konečná fluorescence (emise) závisí na schopnosti molekuly fluoroforů absorbovat a emitovat fotony 3) Emise fluoroforů je silně závislá na teplotě Princip fluorescence Světlo o definované vlnové délce je absorbováno molekulou fluoroforu Molekula fluoroforu přejde do excitovaného stavu s vyšší energii Molekula se vrátí do základního stavu po emisi světelného záření o jiné vlnové délce Wavelength Zhášeče Heterocyklické polyaromatické uhlovodíky schopné absorbovat nebo disipovat energii z excitovaného fluoroforu Zhášeč přijímá energii z fluoroforu a absorbuje nebo disipuje ji mechanismem 1) Proximálního zhášení - proximal quenching 2) FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer Proximální zhášení FRET Ponorová molekula (excitovaná externím světelným zdrojem) předává část své energie na akceptorovou molekulu, která vyzáří světlo o jiné vlnové délce. Účinnost tohoto procesu je mimo jiné silně závislá na vzdálenosti molekuly donoru a akceptoru ( účinně 100Á, cca 30 bp v lineárním formátu sond). Schéma FRET Sondy Krátký oligonukleotid s podobnými vlastnostmi jako PCR primer - váže se na DNA řetězec stejným způsobem jako PCR primer Umožňuje vázat fluorofor a zhášeč v efektivní vzdálenosti od sebe a tím zajistit proces zhášení fluoroforu do doby detekce Fluorofor, sonda, zhášeč - TTC ATG CTT GGA CCG CTG ATT CCT - TTC ATG CTT GGA CCG - TTdBl - TTC ATG CTT GGA CCG Nejčastěji používané kombinace fluorofor/proximální zhášeč ■ ví BHQ-3 (672 nm) BHQ-2 (579 nm) BHQ-1 (534 nm) 6-FAM (518) TET (538) HEX (553)/JOE (554) Cy3 (565) TAMRA (583) ROX (607) LC Red (640) :Cy5 (667) —I-1-1-1-1-1 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 75( Wavelength (nm) Formáty real-time PCR > fluorofory s vazbou na dvou řetězcový fragment DNA = SYBR® Green I; > princip 5' —► 3'exonukleázové aktivity DNA polymerázy na značené sondy = TaqMan®; > princip hybridizace lineárních a nebo vlásenkových („hairpin") sond = FRET, Beacons, aj.; > princip fluoreskujících amplikonů = Amplifluor™, Scorpions; Formáty real-time PCR - jiné dělení > Nespecifické metody: založené na nespecifické vazbě fluoroforu do vznikající molekuly dsDNA > Specifické metody: založené na specifické vazbě sondy označené fluoroforem Nespecifické metody Využívají DNA interkalátory > Fluorofor se interkaluje, „váže" do vznikajícího řetězce DNA v průběhu PCR > Vazba v malém žlábku molekuly DNA > Quencher-Labeled Primer I > Quencher-Labeled Primer II > LUXTM Primers > AmplifluorTM > SYBR Green I Princip použití SYBR™ Green I Co se děje uvnitř termocykleru při real-time PCR? Cílová sekvence je přítomna y Cílová sekvence není přítomna Je vazba molekuly SYBR Green do vznikající molekuly DNA reversibilní nebo ireversibilní děj a proč tomu tak je?_^ Podívej se ještě jednou na strukturu Jak detekovat rozdíly v sekvenci DNA pomocí SYBR Green I - modelový příklad - Úsek A o délce 200 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCC ACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTAT CTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACT ACTGCCTC Úsek Ai s inzercí 5 bp o délce 205 bp ohraničený primery CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTG ACTCCACCTTTGAGAGACACTACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAA TTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCT GTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCC GACTACTGCCTC Výsledek detekce pomocí SYBR Green I Základní data Výsledek analýzy Tm pomocí SYBR Green I Základní data 30 40 65 78 88 Teplota Vyhodnocení detekce pomocí SYBR Green I- analýza Tm Výhody a nevýhody nespecifických systémů Výhody Nevýhody > Cenově „nenáročná" > Není nutná analýza sekvence pro návrh sond > Vazba do ssDNA > Problematická analýza primer/dimer struktur Problematická kvantifikace Specifické metody Využívají značené DNA sondy Metody jsou založené na hybridizaci primerů a sondy specifické pro hledaný úsek DNA Hlavní typy značených DNA sond > Lineární sondy > Strukturní sondy Formáty specifických systémů -ineární sondy Strukturní sondy tsonSense® Probes > Molecular Beacons Lineární sondy ResonSense® Probes Angler® Probes HyBeaconsTM Light-up Probes Hydrolysis (TaqMan®) Probes Lanthanide Probes Hybridization Probes (FRET) EclipseTM Displacement Hybridization/Complex Probe ScorpionsTM CycliconsTM Nanoparticle Probes Conjugated Polymers/Peptide Nucleic Acid Probes Při jakémkoli formátu je výsledek pořád stejný Cílová sekvence je přítomna y Cílová sekvence není přítomna TaqMan sonda > monitoruje 5' —► 3' exonukleázový efekt Taq DNA polymerázy na vzniklý duplex mezi sondou a jejím komplementárním řetězcem na PCR produktu > Taq DNA polymeráza uvolňuje a hydrolyzuje sondu hybridizovanou v průběhu syntézy správného řetězce na matrici DNA > fluorofor s excitační energií (R) a fluorofor (Q) pohlcující energii, tzv. „quencher dye" Schéma fungovaní TaqMan sondy TaqMan sonda - animace Kvalitativní detekce 2 úseků DNA v jedné reakci (duplex PCR) pomocí TaqMan sond - modelový příklad - Úsek A o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 530 nm CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAA Úsek B o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 560 nm TTGTTCACCTCACCATACTGCTCTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACT AATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTTGGAAGATCCAACATC Kvantitativní detekce pomocí Real Time PCR s využitím TaqMan sond - modelový příklad - Úsek A o délce 100 bp ohraničený primery a označený sekvenčně specifickou sondou, která nese fluorofor s emisním maximem při 530 nm CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCC ACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAA Jaký je počet kopií (koncentrace) úseku A ve vzorku 1? Jaký je počet kopií (koncentrace) úseku A ve vzorku 2? Postup kvantifikace pomocí Real Time PCR s využitím TaqMan sondy 1. Stanovení Ct (Treshold cyklus) 2. Vytvoření kalibrační křivky 3. Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady Stanovení Ct Treshold cyclus Vzorek > Ct - číselná hodnota udávající PCR cyklus ve kterém je přístrojem detekována první změna fluorescence v amplifikovaném vzorku > Číselnou hodnotu Ct určuje přístroj automaticky 2 2,5 o -15 8 14 20 26 32 38 44 50 Počet PCR cyklů Vytvoření kalibrační křivky lOexpl 10exp2 10exp3 10exp4 Koncentrace Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10expl Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek Typ vzorku Ct Koncentrace (kopií/ul) 1 Neznámý 25,64 3,50E+03 2 Neznámý 29,23 2,50E+02 10exp2 10exp3 Koncentrace Lineární sondy Hybridization Probes (FRET) Použití FRET analýzy pro detekci jednonukleotidové mutace (SNP) v úseku DNA - modelový příklad - Standardní alela o délce 200 bp A Mutantní alela (s mutací v jediném nukleotidu) o délce 200 bp c Návrh sond pro detekci SNP pomocí FRET A FITC RED Princíp analýzy SNP pomoci FRET sond Neštandardní alela (dCTP) Tm= 55°C Štandardní alela (dATP) Tm= 62°C Výsledek detekce SNP pomocí FRET Základní data Vyhodnocení detekce SNP s použitím FRET pomocí analýzy Tm ■ Light-up sonda Strukturní sondy MolecularBeacons Scorpions Real Time přístroje Je možné metodou real-time kvantifikovat také RNA? Samozřejmě, použiješ metodu RT-Real-Time PCR Real-time PCR v mikrobiologii > Umožňuje všechny formáty klasické PCR > Stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky - snížení rizika kontaminace > Je více specifická - 2 primery + sonda > Umožňuje stanovit počet mikroorganismů ve vzorku (kvantifikace) > Není třeba provádět elektroforézu > Automatizace procesu pro klinické využití Využití Real Time PCR ve formátu Taq Man pro kvalitativní detekci M. tuberculosis komplex Naměření a hodnocení dat Norm. Fluoro 0,25 0,2 0,15 0,1_ 0,05 0 0 5 10 15 20 Adjust 5cale... Auto-5cale Default Scale Log, 5cale 25 30 Name oampie i Sample 3 PK102 NK Type unKnown Unknown Positive Control Negative Control 35 40 23,78 30,68 Cycle Využití Real Time PCR ve formátu TaqMan pro detekci a kvantifikaci HCMV Naměření dat Kvantifikace a odečtení výsledků Name Type Ct Given Cone (copies/ml) Calc Cone (copies/ml) Sample 1 Unknown Sample 3 Unknown 32,78 1,88E+01 Standard Standard Standard PK101 Standard 33,53 1,00E+04 1,10E+01 Stanovte koncentraci cytomegaloviru (v počtu virionů na mililitr) ve 4 vzorcích na základě dat uvedených v následující Tabulce I Tabulka I Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 22,52 1,300x104 PK103 27,86 6,373x102 PK102 30,95 1,119 x102 PK101 35,09 1,078x101 Vzorek 1 34,86 Vzorek 1 35,13 Vzorek 1 35,44 Vzorek 2 38,02 Vzorek 2 Vzorek 2 38,51 Vzorek 3 24,76 Vzorek 3 24,81 Vzorek 3 24,36 Tabulka I Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 22,52 1,300x104 PK103 27,86 6,373x102 PK102 30,95 1,119 x102 PK101 35,09 1,078x101 Vzorek 1 34,86 Vzorek 1 35,13 Vzorek 1 35,44 Vzorek 2 38,02 Vzorek 2 Vzorek 2 38,51 Vzorek 3 24,76 Vzorek 3 24,81 Vzorek 3 24,36 1) Z hodnot pro standardy vytvořte kalibrační křivku (počet virionů/Ct) 2) Podle hodnoty Ct odečtěte z kalibrační křivky počty virionů/ul Vypočítejte průměr ze dvou měření pro jednotlivé vzorky Přepočítejte počet virionů/ml Řešení pro Tabulku I Vzorek ct Počet virionů/|jl Průměr Počet virionů/ml PK104 22,52 1,300x104 - PK103 27,86 6,373x102 - - PK102 30,95 1,119 x102 - - PK101 35,09 1,078x101 - - Vzorek 1 34,99 1,230x101 Vzorek 1 35,13 1,058x101 1,059x101 10 590 Vzorek 1 35,44 8,888x10° Vzorek 2 38,02 2,068x10° Vzorek 2 0,00 1,212x10° 1 212 Vzorek 2 38,51 1,568x10° Vzorek 3 24,76 3,676x103 Vzorek 3 24,81 3,574x103 3,945x103 3 945 000 Vzorek 3 24,36 4,586x103 ŕ-N A pro utužení znalostí ještě jeden příklad Stanovte koncentraci viru Epstein-Barrové (v počtu virionů na mililitr) ve 3 vzorcích na základě dat uvedených v následující Tabulce II > pozor na zápis výsledků z přístroje! > vzorky byly před zahájením izolace DNA 4x „zahuštěny", počítejte s tím při přepočtu Tabulka II Vzorek ct Počet virionů/|jl PK104 21,59 1.041E+04 PK103 25,53 8.779E+02 PK102 28,77 1.149E+02 PK101 32,74 9.522E+00 Vzorek 1 30,53 Vzorek 1 31,89 Vzorek 1 31,30 Vzorek 2 33,11 Vzorek 2 33,34 Vzorek 2 33,69 Vzorek 3 26,63 Vzorek 3 26,78 Vzorek 3 27,00 Řešení pro Tabulku II Vzorek PK103 PK102 PK101 Vzorek 1 Vzorek 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 2 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 3 Vzorek 3 ,59 25,53 28.77 32,74 30,53 31,89 31,30 33,11 33,34 33,69 26,63 26.78 Počet virionů/|jl Průměr 8.779E+02 1.149E+02 9.522E+00 3,826E+01 1,624E+01 2,353E+01 7,559E+00 6,561 E+00 5,262E+00 4,422E+02 4,004E+02 27,00 3,493E+02 2,601 E+01 6 461E+00 3,973E+02 Počet virionů/ml 6 502,3 1 615 99 325 Budoucnost ? - emulsní PCR > Amplifikace probíhá v emulsi (voda-olej) > Jednotlivé matrice navázány samostatně na povrch jednotlivých kapek Emulsní PCR > Amplikon je výsledkem jedinečné PCR > Méně nespecifických produktů Konvenční PCR Emulsní PCR > Mapování genomů > Vyhledávání genových polymorfismů > Analýza mikrobiálních společenstev > bakterie v biofilmech > mikroorganismy v potravinářských vzorcích > nekultivovatelné bakterie Používá se ve spojení s pyrosekvenováním Pyrosekvenování >Metoda popsaná Mostafa Ronaghi et al. v roce 1990 >Určena pro krátké úseky DNA, SNP a úseky methylované > 4 enzymy > velmi přesná > reakce se záhy „zahltí" Pyrosekvenování - záznam Intenzita signálu odpovídá počtu začleněných nukleotidů Shrnutí 1) Princip PCR v reálném čase 2) Komponenty specifické pro real-time PCR 3) Vlastnosti fluoroforů 4) Vlastnosti zhášečů 5) Sondy 6) Nespecifické formáty 7) Specifické formáty 8) Příklady využití 9) Emulsní PCR a py rose kve n ování