Typy genetických markerů Single locus Codominant PCR assay Overall variability Nuclear multilocus Minisatellite DNA fingerprints No No No High RAPD No No Yes High AFLP No No Yes High Nuclear single locus Alozymy Yes Yes No Low-medium Mikrosatelity Yes Yes Yes High SINE (LINE) Yes Yes Yes Low SNPs Yes Yes Yes Low-high Multi-locus genetic markers •Mnoho znaků náhodně rozmístěných v genomu – celogenomový scan Øminisatellite DNA fingerprinting ØRAPD (randomly amplified polymorphic DNA) ØAFLP (amplified fragment length polymorphism) •presence vs. absence restrikčního místa (AFLP) či místa pro dosednutí primerů (RAPD) = dominantní znaky (neodliší heterozygota – proužek na gelu buď je nebo není) •není nutno znát předem genom studovaného druhu (tj. primery či sondy) • Př.: chromozóm 1 Každý jedinec má jedinečný genom GTAGAATTCATTCACGCA CATCTTAAGTAAGTGCGT Záměna v restrikčním místě = zde ke štěpení nedojde GTAGAATgCATTCACGCA CATCTTAcGTAAGTGCGT 1. Ztráta nebo nabytí restrikčního místa Enzyme Site Recognition • Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site • Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC) Palindrome Restriction site Fragment 1 Fragment 2 Common Restriction Enzymes EcoRI – Eschericha coli – 5 prime overhang Pstl – Providencia stuartii – 3 prime overhang Každý jedinec má jedinečný genom 2. Ztráta nebo nabytí SINE (např. Alu sekvence) nebo LINE Každý jedinec má jedinečný genom 3. Vysoká mutační rychlost minisatelitů a mikrosatelitů – rozdíly v počtu repeticí, tj. v délce daného úseku Repetitivní DNA DNA Typical sequence length (bp) Location Satellites (>106 repeats/genome) 5-100 Tandem arrays, scattered throughout the genome Minisatellites (>103 loci/genome) 20-300 Tandem arrays up to 5 kb in length, scattered throughout the genome Microsatellites (>104 loci/genome) 1-6 Tandem arrays up to a few 100 bp in length, scattered throughout the genome Telomeres 4-8 Tandem arrays up to 1kb in legth, at the ends of each chromosome SINEs (>105/genome) 50-500 (100-300) Interspersed throughout the genome LINEs (>103/genome) 1-5 k Interspersed throughout the genome (Minisatellite) DNA fingerprinting (Jeffreys et al. 1985) • první celogenomový screening • • restrikční štěpení kompletní DNA – sekvenčně specifické restrikční endonukleázy Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza rozštěpené DNA • Southern blotting – přenesení DNA na membránu dobrý + - „smear“ Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza • Southern blotting – přenesení DNA na membránu • hybridizace se značenou sondou (nejčastěji radioaktivní značení), tj. specifickou sekvencí odpovídající danému minisatelitu (popř. SINE) 123345 Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza • Southern blotting – přenesení DNA na membránu • hybridizace se značenou sondou, tj. specifickou sekvencí odpovídající danému minisatelitu • zásadní objevy např. EPC u ptáků • v posledních 10-15 letech – přesun k PCR-based metodám RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) Krátké náhodné oligonukleotidy (~ 10 bp) jako primery PCR za málo specifických podmínek Wicki08 a) Změna sekvence v místě nasedání primeru b) Delece místa nasedání primeru c) Velká inzerce mezi dvěma místy nasedání primeru Variabilní DNA detekovaná metodou RAPD: RAPD Krátké náhodné oligonukleotidy (~ 10 bp) jako primery PCR za málo specifických podmínek Detekce PCR produktů elektroforézou - + Nízká opakovatelnost v důsledku mnoha faktorů ovlivňujících PCR – dnes již není akceptována jako metoda např. pro studium populační struktury (ale třeba vhodná jednoduchá metoda k odlišení příbuzných druhů) AFLP (amplified fragments length polymorphism) •levná, jednoduchá, rychlá a spolehlivá metoda na generování stovek informativních genetických markerů •současný screening mnoha různých DNA oblastí distribuovaných náhodně v genomu •lépe reprodukovatelná než RAPD – obsahuje krok se specifickou PCR •„genome scan“ – hledání asociací s fenotypovými znaky Princip AFLP metody („generating AFLP markers“) Generating AFLP markers multi-locus genotype image002 „capillary version“ PCR with primers on adaptors Automatizované čtení elektroforetogramu podle zadaných kritérií (např. pozice a minimální výška píku) image002 Ex.: Combination MseI + EcoRI Typy populačně-genetických dat a jejich základní analýza Fylogenetika vs. populační genetika ACGTTTCT ACGTTTCT ACGATTCT ACGATTCT ACGATTGT ACGTTTCT ACGTTTCA ČAS ACGATTCT ACGATTGT ACGTTTCT ACGTTTCT - mutační rychlost - datování - fylogenetické vztahy mezi jednotlivými variantami - selekce na úrovni kódujících sekvencí - většinou nás nezajímají frekvence alel ACGATTGT ACGATTGT ACGATTGT ACGATTCT ACGTTTCA ACGTTTCT ACGTTTCA ACGTTTCT - založená na frekvencích alel - relativně recentní procesy: genetický drift, populační struktura, tok genů, efektivní velikost populace - selekce – srovnání populační struktury na kódujících a nekódujících znacích Laboratorní techniky (= typy genetických markerů) Př.: chromozóm 1 „single-locus“ (PCR, microarrays) „multi-locus“ (dominantní znaky) Typy populačně-genetických dat Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 170/172 133/136 Ind_2 168/172 133/139 Ind_3 168/168 136/139 Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 A/T C/T Ind_2 A/T T/T Ind_3 T/T C/T Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 +/- -/- Ind_2 +/+ +/+ Ind_3 -/- +/- Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 + - Ind_2 + + Ind_3 - - mikrosatelity SNPs SINE AFLP •Jak je variabilní daná populace a jaká je její efektivní velikost • •Nachází se daná populace v období demografické expanze nebo poklesu? • •Existuje mezi dvěma subpopulacemi bariéra toku genů a jak je silná? Jaká je prostorová genetická struktura? • •Vyskytují se v populacích imigranti nebo jejich potomci (hybridi)? Populačně-genetická analýza Populačně-genetická data - v tomto kurzu omezena na diploidní kodominantní znaky (Mendelovská dědičnost) CCGATCAATGCGGCAA CCGATCACTGCGGCAA T G mikrosatelity jaderné sekvence (např. SSCP) SNPs Velké množství populačně-genetických programů Kodominantní znaky (např. mikrosatelity) – GenAlEx formát počet lokusů počet jedinců počet populací počet vzorků v 1. populaci počet vzorků v 2. populaci, atd. genotypy, tj. velikosti fragmentů u jednotlivých jedinců geografické koordináty pop1 pop2 Genepop file format – jednoduchý ASCI kód (.txt) - jednotlivé alely pro daný lokus jsou seřazeny podle velikosti a očíslovány - tj. např. 128/130 je převedeno na 10/11 Vnitropopulační variabilita •Polymorfismus •podíl polymorfních lokusů (znaků) – např. 0,8 = 4 z pěti zkoumaných mikrosatelitů mají v populaci alespoň 2 alely, z nichž ta vzácnější dosahuje frekvence alespoň 1% nebo 5% • •Počet alel (number of alleles) •počet alel na lokus • •Alelická bohatost (allelic richness) •počet alel na lokus vztažený k velikosti vzorku (metodou „rarefaction“) - FSTAT • •Pozorovaná heterozygotnost (observed heterozygosity) •průměrná četnost heterozygotů v jednotlivých lokusech • • Sample size Hardy-Weinbergova rovnováha (HWE) Alela Četnost alely 170 p 172 q Př. Jeden lokus se 2 alelami p + q = 1 p, q - zjistíme analýzou svých vzorků Genotyp Očekávaná četnost genotypu 170/170 p2 170/172 2pq 172/172 q2 = Hardy-Weinbergova rovnováha (p2 + 2pq + q2 = 1) Ø četnosti genotypů zjistíme analýzou svých vzorků Ø odchylky od očekávaných četností Þ test HWE (např. c2 test nebo exact probability test v Genepop) Očekávaná heterozygotnost (expected heterozygosity, He) při HWE He=1-(p2+q2) ..... pro 1 lokus se 2 alelami s četností p a q = rozmístění alel do genotypů v rovnovážné populaci Předpoklady HWE •náhodné párování (panmixia) •zanedbatelný efekt mutací a migrací („closed populations“) •nekonečně velká populace •Mendelovská dědičnost použitých markerů •neutrální znaky – žádná selekce • •znaky nejsou ve vazbě – kontrola na „linkage disequilibrium“ (vazebná nerovnováha; speciální test např. v Genepop) • 2 lokusy ve fyzické blízkosti (snížená pravděpodobnost rekombinace linkage disequilibrium) vs. 2 lokusy fyzicky vzdálené (pravděpodobnost rekombinace není ovlivněna linkage equilibrium) nebo Odchylky od HW rovnováhy •Test HWE – např. Genepop („exact probability tests“) – pokud jsou odchylky, tak některý předpoklad HWE nebyl splněn • •nadbytek heterozygotů = negativní asortativní páření (tj. cílené rozmnožování nepodobných jedinců) – použité lokusy mohou být výhodné v heterozygotním stavu (např. geny MHC) • •nedostatek heterozygotů •inbreeding (postihuje všechny lokusy stejně) •vnitřní struktura („Wahlundův efekt“) •nulové alely (jen na některých lokusech bude deficit heterozygotů) - FreeNA Null alleles nnulové alely (mutace v primerových sekvencích) → vyšší proporce „homozygotů“ TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA TTCAGGCACACATCTCTAGCTTTGA x PCR OK no PCR Příklad – stanovení variability populace Jedinec Locus 1 Locus 2 Locus 3 Locus 4 Průměr Ind 1 170/170 223/227 116/116 316/316 Ind 2 170/172 223/225 112/112 316/316 Ind 3 172/172 223/225 112/112 316/316 Ind 4 170/172 223/227 112/112 316/316 Počet alel 2 3 2 1 2 Ho 0,5 1,00 0 0 0,375 p 0,5 p = 0,5 0,75 1,00 q 0,5 q = 0,25 r = 0,25 0,25 0 He 0,5 0,625 0,375 0 0,375 He=1-(p2+q2) He=1-(p2+q2+r2) Polymorfismus = 0,75 Genetická variabilita (He) jako ukazatel efektivní velikosti populace (Ne) •neutrální genetická teorie: He=4Neµ/[4Neµ+1] • •mutation-drift equilibrium • br05f01 Čím je populace větší, tím má vyšší genetickou variabilitu Efektivní velikost populace (Ne) •Ne = velikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace (vlivem náhody) •ovlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou příbuzenského křížení atd. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg Efektivní velikost populace (Ne) •Ne = velikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace (vlivem náhody) •ovlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou příbuzenského křížení atd. < Ne •vývoj genetické variability v malých populacích závisí na Ne více než na N • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg http://m1.aimg.sk/tahaky/g_18977_4811.jpg Důsledky poklesu Ne He=4Neµ/[4Neµ+1] Pokles pozorované variability (He – odhadnuta z tzv. genetických znaků) = pokles Ne Pokles adaptivní variability „Budoucnost je v genech ...“ •Změny prostředí (např. klima, patogeny, aj.) → přizpůsob se nebo zmiz! •Vysoká genetická variabilita znamená, že je zde více genetických variant, z nichž některé mohou být vhodné pro nové podmínky •Populace s vyšší genetickou variabilitou mají „více losů v loterii“ (= adaptivní potenciál) • • • • • • • Dryas octopetala v Alpách, Německo. Photo: Steve Smith Low genetic diversity is also a problem for the future, because genetic variation can help populations adapt to new conditions. Currently, climate change is forcing species to adapt to new conditions, or else move away. Higher genetic diversity means there are more genetic alternatives that might be suited to the new conditions. In a way, possessing higher genetic diversity provides a population with more 'tickets in the lottery’ so that by chance, one of the gene variants will be suited to the new conditions.