Imunohistochemické metody -stanovení Ag či Ab - Reakce: Ag + Ab → IK- imunokomplex - jeden z reaktantů nese značku: -radioaktivní (Ria) -fluorescenční (Fia) -enzymatickou (Eia) -a další EIA, IMUNOENZYMOVÉ METODY nPodstata: tyto metody pracují také s antigenem a protilátkou, které však stanovují na základě označení jednoho z reaktantů enzymem. nVýhody: ekonomičtější (levnější než RIA), časově méně náročná, citlivost (např. Ag s Mr 10 000 lze určovat už při koncentraci 10pg/ml, 10-12 mol/l), vysoká specifita). Jsou vhodné pro automatizaci a vyhodnocení přes počítač, bezpečnější, delší doba expirace, lepší kontrolovatelnost reakce Dělení EIA: npodle toho, zda aktivita enzymu v konjugátu zůstane nezměněná nebo jestli se změní, oddělování značených složek, stanovení látek nhomogenní EIA: katalytická aktivita v konjugátu (AgE,HE, AbE) ve vazbě (po vazbě) s Ab (Ag) se mění nheterogenní EIA: katalytická aktivita v konjugátu s Ab (Ag) se nemění Homogenní EIA ( – enzyme immunoassay technique): npři této metodě se nemusí oddělovat volný značený reaktant od zn. reaktantu vázaného v v imunokomplexu – metoda má 1 krok → je homogenní nenzymová aktivita konjugátu se po vazbě na Ab může snížit nebo zvýšit nStanovení nízkomol. látek nPrincip: enzymová aktivita volného konjugátu enzymu je jiná než aktivita komplexu konjugát-protilátka (nebo AgE,HE), či konjugát-Ag. nNecháme-li zreagovat směs známého zn množství enzymem značeného haptenu (AgE,HE) a neznámého množství neoznačeného haptenu (Ag,H) s limitovaným množstvím Ab, aktivita enzymu je přímo úměrná množství konjugátu navázaného na protilátku. n nHEzn + H + Ab → HE-Ab + H-Ab + HEzn +H n limit.množ. aktivita E je úměrná množství konjugátu navázaného na Ab Schéma homogenní EIA -varianty reaktivity a nereaktivity A)Enzymová aktivita konjugátu po vazbě na Ab se inhibuje: nsubstrát se může vázat na katalytické místo enzymu a lze tuto aktivitu měřit 4a-x E + H + S → aktivita 4b-x nprotilátka se navázala na konjugát E + H. Zabránila tak přístupu substrátu ke katalytickému místu enzymu. E aktivitu nelze měřit (inhibice). EH + Ab = EH-Ab → bez aktivity nPřidaný volný H vytěsní z vazbových míst protilátky konjugát EH a tím se uvolní katalytické místo pro S a Enzymová aktivita se obnoví 4c-x EH – Ab + H → EH + H – Ab → aktivita se obnoví B) Enzymová aktivita konjugátu po vazbě na Ab se aktivuje nsubstrát se nemůže navázat na katalytické místo enzymu, neboť vazbou H vznikly v molekule enzymu také konformační změny, které znemožňují vazbu. E aktivita je neměřitelná. obraz-a[1] n Vazbou haptenu na Ab vznikly opět konformační změny, které umožňují přístup substrátu ke katalytickému místu. E aktivita je měřitelná. n obraz-b[1] nPoužitý enzym: lysozym, malátdehydrogenáza, glukózo-6-fosfátdehydrogenáza. nPoužití: na kvantitativní stanovení především nízkomolekulárních látek (haptenů), např. určení koncentrace antibiotik, omamných látek, hypnotik, sedativ, kardiotonik, cytostatik a hormonů jako tyrozin, trijódtyronin, kortizol aj. nVýhoda: jednoduchost, rychlost (trvá několik minut) – heterogenní trvá několik hodin. nNevýhoda: nižší citlivost, složitá příprava reagencí Další vlastnoti homogenní EIA Heterogenní EIA nZde se musí oddělit volný reaktant od značeného reaktantu vázaného v komplexu s Ab. Technika je dvoustupňová – heterogenní. nZpůsob oddělení: n1. precipitací imunokomplexů polyetylenglykolem n2. pomocí druhé – sekundární Ab n3. nejčastější: imobilizací jedné z dvojic reaktantů navázáním na tuhý nosič (stěna zkumavky, jamka destičky). Oddělení volné a vázané označené složky se uskutečňuje promytím. Jde o princip imunoadsorbentové analýzy = ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY = ELISA nPožadované vlastnosti enzymů: malá Mr, vysoká stabilita a enzymová aktivita, kovalentní vazba na Ab, hapteny, Ag, produkt enzymové reakce musí být dostatečně barevný či jinak detekovatelný, levný , dostupný. nPoužívané enzymy: peroxidáza (křenová), alkalická fosfatáza, β-D-galaktozidáza Základní složky systému ELISA nImunosorbční povrch (pevná fáze): používá se upravený polystyrén ve formě mikrotitračních destiček, kuliček, hřebenů, pruhů. Důležitá je vhodná polymerizační teplota a délka polymerizace. Při přehnaně vysokých sorbčních vlastnostech by docházelo k navázání nežádoucích látek, a tím ke snížení citlivosti a specifity reakce. nPři nízkých sorbčních vlastnostech by nezabezpečovalo dostatečně souvislý a stabilní imunosorbční povrch (nestabilita a nespolehlivost systému vede k snížení citlivosti a reprodukovatelnosti). nPoužívá se koncentrace 1 – 10mikrogramů/ml proteinu v karbonátovém pufru o urč. pH Imobilizace antigenu na pevný nosič nAntigen se váže pasivní adsorpcí, proces se nazývá coating-koutování nPoužívají se destičky s plochým dnem kvůli fotometrickému stanovení nVazba proteinů je ovlivněna: kapacitou adsorpce, povahou proteinů, teplotou a pH vazebného roztoku, dobou adsorpce a koncentrací vazebného proteinu nPromývání-účelem je oddělit navázané a nenavázané reagenty, promývá se 3x, nesmí vzniknout bubliny-brání kontaktu promývacího roztoku s povrchem buněk n n nBlokování- k eliminaci nespecifických vazeb mezi proteiny a volnými vazebnými místy, blokovací roztoky obsahují: hovězí sérový albumin nebo kasein, želatina, sušené mléko atd n nKonjugát: specifická Ab (mono- nebo polyklonální) s vhodným navázaným enzymem.Ten pak reaguje se substrátem a vytváří v přítomnosti vhodného chromogenu dostatečně intenzívní barevnou reakci. n nZastavení reakce: v době, kdy se vztah mezi enzymem, substrátem a produktem nachází v lineární fázi silnou kyselinou či zásadou. Způsobí denaturaci enzymů. Přidáním zastavovacího roztoku se mění absorbční spektrum produktu nSubstrát: při použití konjugátu s peroxidázou jako chromogen slouží (ortofenylén- diamin hydrochlorid = OPD, kyselina aminosalicylová, atd) které v přítomnosti peroxidu vodíku jako substrátu – katalyzátoru vyvolají barevnou reakci. nPřístroje: ELISA – reader je spektrofotometr upravený na odečítání absorbance v reakčních jamkách. Filtry jsou nastavené s volitelnou vlnovou délkou optimální pro určitý ELISA systém (obvykle mezi 405 až 570 nm) v závislosti na typu použitého konjugátu a substrátovo - chromogenním roztoku. Hodnocení a standardizace testů nNesledujeme absolutní hodnotu absorbance, ale její přírustek k blanku n nVzorky můžeme testovat kvalitativním i kvantitativním způsobem n nKvalitativní: je třeba znát pozitivní, negativní kontroly a hraniční hodnotu (cut off). Za pozitivní lze považovat hodnoty statisticky odlišitelné od vzorku s nulovou koncentrací vyšetřovaného agens. Cut off nV praxi se hraniční vzorek stanoví vyšetřením několika desítek hraničních kontrol, 1. pak se uvažuje hodnota X +3sd (X je hodnota negativní kontroly) (sd směrodatná odchylka), 2. neg. kontrola se násobí číslem2,1 n3. hodnoty de vloží do grafu a vypočítají se intervaly podle průměru hodnot n C:\Documents and Settings\Alena\Plocha\Bez názvu.bmp Kvantitativní: využívají se kalibrační křivky vzorku. Vzorek je nutné vyšetřovat ve dvou nebo více zředěních, aby bylo jisté, že se koncentrace Ag ve vzorku nachází v oblasti kalibrační křivky Index pozitivity: IP n nTypy ELISA: n nsendvičová ELISA pro Ag (kompetitivní a nekompetitivní) nkompetitivní ELISA pro Ag nebo hapteny npřímá ELISA pro Ag nsendvičová ELISA pro Ab = nepřímá pro Ab nELISA pro zachycení IgM n Použití: nStanovení při průkazu neinfekčních Ag, na kvantitativní stanovení nízko- i vysokomol. látek (stanovení hormonů: tyrozin, trijódtyrozin, prolakton, inzulin α- fetoprotein atd, léků: teofylin, dioxin aj., a proteinů: IgE, AFP alfa fetoprotein, CEA cefalosporin A nStanovení autoprotilátek nPrůkaz virů, bakterií a parazitických nákaz nPři diagnostice onemocnění vyvolaných obtížně kultivovatelnými původci (viry hepatitidy, borrelie, mykoplazmata atd.) n Sendvičová ELISA pro antigeny 2navazeAb Na tuhou fázi se naváže Ab. Na ni se potom navazuje známé nebo neznámé množství antigenu. Promytí. Přidá se volná enzymem značená Ab, která reaguje s volnými hapteny antigenu imobilizovaného vazbou do komplexu s Ab. Inkubace, promytí, přidání S. Přidá se substrát na detekci enzymové aktivity. nLegenda: nZ naměřených hodnot standardních vzorků se sestrojí analytická čára (kalibrační křivka), podle které se vyhodnotí vzorky s neznámou koncentrací zkoumaného Ag. nVýhoda: nemusí být k dispozici značený čistý Ag. Stačí jen standardní Ag třeba i ve složité směsi jiných Ag (například lidské sérum). Musí v něm však být přesně známý obsah analyzovaného Ag. Ab se může označovat enzymem vždy tou stejnou konjugační reakcí. nNutnost: obě Ab musí mít stejnou specifickost. Ag musí mít nejméně 2 determinanty (reagují s ním 2 molekuly Ab). Kompetitivní přímá ELISA pro Ag a nebo hapteny – stanovení Ag 2Natuhou Na tuhou látku se naváže Ab specifická pro Ag, který se má stanovit Pak se přidá známé množství enzymem značeného Ag (AgE) a buď známé (standardní) množství nebo neznámé (analyzované) množství neoznačeného Ag (Ag) V průběhu inkubace soutěží značený s neoznačeným (standardním čí zkoumaným) Ag. Po promytí zůstávají jen Ag vázané na Ab. Pak se přidá roztok substrátu, který enzym přítomný v imunokomplexech rozloží za vzniku barevného produktu nLegenda: nIntenzita (absorbance) zbarvení roztoku s produktem enzymové reakce se měří spektrofotometricky. Z hodnot absorbancí naměřených v jamkách se známým (standardním) množstvím Ag se sestrojí analytická čára (kalibrační křivka), pomocí které se určí koncentrace analyzovaných roztoků Ag. Přímá ELISA pro antigeny, (kompetitivní), určení % inhibice 2Agsenavaze Ag se naváže na tuhou fázi a reakční prostor se promyje. Pokud jde o malý Ag, naváže se předem na větší nosič, např. BSA. Zkoumaný roztok, ve kterém se předpokládá přítomnost Ag, se míchá se specificky značenou Ab a směs se inkubuje s imobilizovaným Ag. Inkubace, promytí a přidání substrátu, čímž se vyvolá barevná reakce. n nLegenda: n nRozdíl naměřené absorbance ve vzorku s volným Ag a v kontrolní jamce (bez volného Ag) určuje množství Ag ve zkoumaném vzorku. Je to kompetitivní ELISA, ve které o vazbová místa Ab soutěží Ag ve zkoumaném vzorku (volný) a Ag imobilizovaný. Čím víc Ag bude ve vzorku, tím méně Ab se může navázat na imobilizovaný Ag a tím menší barevná intenzita bude v reakčním roztoku. Nejvíce zbarvený roztok bude v kontrolní jamce, kde reakční směs neobsahovala volný Ag. Modifikace: nmísto označené Ab se použije neoznačená Ab (např. králičí IgG) a imobilizované Ag se detekují pomocí označeného Ig ve funkci sekundární Ab (např. prasečího IgG proti králičímu IgG). nAg + (sérum+Ag) +AbE + S →barevná reakce nvirus + (IgG + Ag)+anti IgGE + S →barevná reakce nVýhoda: možnost použití komerčně dostupné označené Ab. n Sendvičová ELISA pro protilátky Neboli nepřímá ELISA na detekci Ab – slouží na důkaz neboli titraci Ab specifických pro určitý Ag. Použití: na titraci Ab třídy IgG + IgM. 2pridasezre Antigen se naváže na tuhou fázi a promyje. Přidá se zředěné sérum, ve kterém se má určit přítomnost Ab. Inkubace, promytí – přitom dochází k navázání na imobilizované Ag Přidá se enzymem značená sekundární Ab, promytí Přidá se enzymový substrát a změří se intenzita barevné reakce. ELISA na zachycení protilátek IgM 2elisaIgM-a Na tuhou fázi se naváží anti-IgM Ab A tou se z vyšetřovaného séra vychytá IgM. Přidá se roztok antigenu, který se naváže na ty imobilizované Ig, které mají pro ně specifické vazbové místo, promytí 2elisaIgM-b Přidá se specificky značená Ab proti Ag. Inkubace, promytí Aplikací substrátu se vyvolá barevná reakce. Její intezita je úměrná množství antigenně specifického IgM imobilizovaného v druhém kroku metody. Použití v praxi : na důkaz Ab proti některým virovým Ag, např. proti viru hepatitidy A.