Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Laboratoř patofyziologie volných radikálů BFÚ AV ČR Imunologie - Stanovení stavu imunitního systému • Vrozené nebo získané imunodeficience - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů • Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie Hematologie • Diagnóza maligních onemocnění • Stanovení funkčních vlastností trombocytů Metodologické přístupy • Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytů (obecně krevních elementů v krvi, kostní dřeni nebo mozkomíšním moku) • Funkční testy - Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů - Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita) Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Imunofenotypizace • Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací krevních elementů (primárně leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových antigenů případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a expresí intracelulárních antigenů CD2CD4 CD markery • Skupina povrchových molekul buňky mající stejný epitop, identifikovatelný stejnou protilátkou • Rozpoznávání buněčných populací při imunofenotypizaci • Pojí se s určitými funkcemi a vlastnostmi buňky • Typické receptory trombocytů: CD 41, CD 61, CD 42a/b Imunofenotypizace leukocytů • Na základě rozptylu světla jsou buněčné populace rozděleny podle velikosti a granularity • Specifické monoklonální protilátky označené různými fluorochromy proti kombinaci vybraných antigenů umožňující rozdělení populací CD Antigeny • Systém označení povrchových molekul leukocytů • Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře • Dodnes definovány CD1 až CD350 • Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) • Zdroj informací o CD nomeklatuře – učebnice imunologie, www např. PROW www.Ncbi.nlm.nih.gov/prow/ Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Kmenová buňka CD34 Časný pro-B lymf. CD34; CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38 Pozdní pro-B lymf. CD45R; IL-7R; CD10; CD19; CD38; CD20; CD40 Velký pre-B lymf. CD45R; IL-7R; CD19; CD38; CD20; CD25 (rec. IL-2); CD40 Malý pre-B lymf. CD45R; CD19; CD38; CD20; CD40 Exprese vybraných povrchových znaků během vývoje B lymfocytů Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Nezralý B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD40 Zralý naivní B lymf. CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Lymfoblast CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Paměťová buňka CD45R; CD19; CD20; CD21; CD40 Plasmatická buňka CD135; CD38 Nezralé CD3-(jen v cytoplasmě)4-8dvakrát-negativní tymocyty pTa:b+ CD3+ 4+ 8+ velké dvakrát-pozitivní tymocyty g:d+ CD3+ 4- 8a:b+ CD3+ 4+ 8+ malé klidové dvakrátpozitivní tymocyty a:b+CD3+4+8- a:b+CD3+4-8+ malé jedenkrát-pozitivní tymocyty Export do periferie Vývoj T-lymfocytů Možné rozdělení jednotlivých subpopulací lymfocytů podle exprese vybraných povrchových antigenů Lymphocytes in Blood B cells T cells NK cells TH (CD4+) TC/S (CD8+) gd T cells CD5+ CD5– CD4–CD8– CD16+CD56– CD16+CD56+ CD16–CD56+ Vd2 Vd1 Naive Memory Naive Memory Vg9+ Vg9– CD23+ CD23– CD45RB+ CD45RB– CD11a+ CD11a– CD45RA+ CD57+ CD57– CD60+ CD60– CD60+ CD60– CD11a+ CD11a– CD45RA+ CD57+ CD57– CD60+ CD60– CD60+ CD60– CD8dim CD4+ CD4– Vybrané povrchové molekuly charakteristické pro různé typy leukocytů (“markery” jednotlivých typů) Buněčný typ Charakteristické povrchové molekuly Leukocyty (všechny) CD53, CD45, CD43 Hematopoetické prekurz. CD34, CD117, CD137 T lymfocyty CD2, CD3, CD5, CD6, CD7, CD27, CD28, CD96, TCR T pomocné l. (Th) CD4 T cytotoxické l. (Tc) CD8 B lymfocyty CD19, CD20, CD22, CD37, CD39, CD40, CD79, BCR Pre-B lymfocyty CD9, CD10, CD138 Plasmatické buňky CD28, CD138 NK lymfocyty CD2, CD11b, CD16b, CD56, CD57, Cd94, CD158 Neutrofilní granulocyty CD11b, CD15, CD87 Monocyty CD14, CD33, CD64, CD87, CD89 Dendritické buňky CD83, Cd86, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209 E Ab1 Ab2 Možnosti exprese antigenu v rámci dané popuplace A Ab1 Ab2 B Ab1 Ab2 C Ab1 Ab2 D Ab1 Ab2 F Ab1 Ab2 Izotypová kontrola Monoklonální protilátky stejné třídy proti irelevatním antigenům CD45 Všechny leukocyty, lymfocyty silněji CD14 Monocyty CD3 Všechny T lymfocyty CD19 Všechny B lymfocyty CD4 Pomocný T lymfocyt CD8 Cytotoxický T lymfocyt CD56 NK lymfocyt Příklad výběru detekovaných antigenů pro určení zastoupení a počtu jednotlivých subpopulací lymfocytů v periferní krvi Příklad kombinace jednotlivých protilátek při použití dvojího značení Zkumav- ka FITC PE Stanovení 1 CD45 CD14 %lymfocytů v ohraničení (gate) pro lymfocyty 2 Iz.kont. Iz. kont. Nespecifická vazba – autofluorescence 3 CD3 CD4 Pomocné (Th) lymfocyty 4 CD3 CD8 Cytotoxické (Tc) lymfocyty 5 CD3 CD19 Celkové B- lymfocyty 6 CD3 CD56 NK buňky Neutrofily Monocyty Lymfocyty SideScatter Forward Light Scatter 0 200 400 600 800 1000 02004006008001000 SS a FS leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Kontrola “čistoty” lymfocytárního ohraničení na základě FS a SS CD45 FITC (log) R1=monocyty (CD14+) R2=lymphocyty (CD45>monocyty) R3=granulocyty (CD45 101102103104 Anti-TCR-gamma-delta-1PE--> CD8 C D 4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Side Scatter --> 101102103104 Anti-TCR-alpha-beta-1FITC--> C D 3 SIDE SCATTER Stanovení CD4 a CD8 lymfocytů RPCI LFC CD3 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 --> 101102103104 CD8--> CD8 CD3-CD4- CD3-CD4+ CD3-CD8+ CD3+CD4+ Th lymf CD3+CD8+ Tc lymf CD3+CD4- 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 --> 101102103104 CD4--> CD3 CD4 10 1 10 2 10 3 10 4 CD8 --> 101102103104 CD4--> CD8 CD4 RPCI LFC Tří barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8 Antibodies labeled with complex PE/CY5 or PerCP Antibodies labeled with FITC Antibodies labeled with PE Antibodies labeled with complex PE/Texas Red Antibodies labeled with complex APC, CY5 or CY7 Čtyřbarevná imunofenotypizace Antibodies labeled with ALEXA dyes from Molecular Probes Čtyř barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8, CD56 Čtyřbarevná imunofenotypizace 1. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD4APC, CD8PE 2. Zkumavka CD3FITC, CD45PerCP, CD19APC, CD16+56PE Výsledný report Výsledný report Příklad osmi barevná imunofenotypizace Příklad 17 barevná imunofenotypizace Hematologie Použití imunofenoptypizace pro detekci hematologických onemocnění • Stanovení zastoupení jednotlivých buněčných linií • Stanovení stupně diferenciace • Stanovení monoklonální populace (B-lymfocyty) Granulocytes granulocytes Haematopoéza CD34+ CD13- (CD36+) CD34+ CD13+ CD115+ CD34+ CD13+ CD115- CD34+ CD13- CD36- CD115 FSC erythroid monoblasts myeloblasts 26.6 39.6 Příklad identifikace buněk myeloidních linií CD45 Human Leukocytes CD3 Pan T Lymphocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD7 Pan T Lymphocytes CD4 T-helper Lymphocytes CD8 T-suppressor/cytotoxic Lymphocytes CD10 B-cells CD19 Pan B-cells CD20 Mature B-cells FMC7 Activated B-cells CD23 Activated B-cells CD38 Plasma cells, activated T-cells CD103 T and B Lymphocytes CD11c T and B cells, NK cells, monocytes CD25 Activated B-cells CD22 B-cells Kappa Light chains Lambda Light chains Příklad panelu CD antigenů stanovovaných při detekci lymfomů CD45 Human Leukocytes CD5 Pan T Lymphocytes CD10 B Lymphocytes CD19 Pan B Lymphocytes CD20 Mature B Lymphocytes HLA-DR (I3) Activated T and B Lymphocytes CD34 Progenitor Cell CD117 Progenitor Cell CD15 Monocytes/Granulocytes CD33 Myelocyte/Monocyte CD56 Natural Killer Cells CD14 Monocyte CD13 Myelocyte/Monocyte CD64 Monocytes cMPO Myeloperoxidase c79a B Cells C3 Cytoplasmic CD3 T Cells cTDT Immature Lymphocytes/thymocytes Příklad panelu CD antigenů stanovovaných při detekci leukemií Detekce fyziologických funkcí leukocytů a trombocytů Změna povrchové exprese antigenu (receptoru) charakteristického pro aktivovaný stav dané buněčné subpopulace. Příklady: - CD11b - aktivace polymorfonukleárních granulocytů a monocytů - HLA-DR - aktivace T-lymfocytů - CD69 - aktivace lymfocytů - CD62L - aktivace krevních destiček Např. současně s imunofenotypizací v programu Simulset jako krok č. 7 Stanovení aktivace T-lymfocytů Detekce fyziologických funkcí leukocytů a trombocytů - Produkce volných radikálů fagocyty (detekce chronické granulomatózní choroby) - Stanovení fagocytární aktivity (detekce poruch fagocytovat patogeny) Detekce fagocytární aktivity • Pohlcení fluorescenčně značených částic (např. latexové částice, zymosanové částice, obarvené baktérie) • Opsonizace částice – porovnání s neopsonizovanou částicí udává informaci o expresy a funkčnosti opsoninových receptorů Postup: • Značení částice fluorescenční próbou • Opsonizace částic vybranými opsoníny (např. IgG, C3) nebo kompletním sérem daného druhu • Izolované leukocyty jsou inkubovány dohromady s částicemi při teplotě fyziologické pro daný druh FITC-Labeled Bacteria J Paul Robinson 1998 FITC-Labeled Bacteria • Rozlišení pohlcení částice do uzavřeného fagozómu od adherence na povrch fagocytu – aplikace trypanové modři (neprostupuje do živých buněk), která má zhášecí vlastnosti pro FITC J Paul Robinson 1998 Detekce intracelulární produkce cytokinů - Charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce cytokinů - Charakterizace funkčních vlastností buněk odpověď na vybraný stimul Cytokiny produkované TH1 a TH2 lidskými lymfocyty Factors influencing development of Th1 and Th2 cell subtypes Th0 Th2Th1 IL-2 TNF-a INF-g IL-5 IL-4 IL-10 IL-12 Low [Ag] macrophage APC, B7-1/CD28 IL-4 High [Ag] B cell APC B7-2/CD28 www.bdbiosciences.com/pharmingen/CBA/ 1. Stimulate whole blood or PBMC + Brefeldin A 2. Lyse/Fix Wash 3. Permeabilize Wash 4. Stain Wash 5. Flow cytometry CD69PE anti-IFNg FITC Optional: cool to 18oC O/N Optional: freeze directly in BD FACS Lysing Solution BD FastImmune TM Cytokine Flow Cytometry Protocol 1.0% 6 h Metody zkoumání trombocytů • Imunofenotypizace receptorů krevních destiček určení vrozených poruch, stavu aktivace destiček in vivo a aktivovatelnost destiček • Určení prokoagulačních mikročásteček derivovaných z krevních destiček Krevní destičky - klidové - aktivované - změna exprese povrchových receptorů Imunofenotypizace receptorů trombocytů • Stanovení receptorů klidových destiček jako jsou GPIIb-IIIa (CD 41, CD 61) GPIb-IX-V (CD 42a, CD 42b, CD 42d) • Aktivované exprese - P-selektinu (CD62P) nebo PAC1 - Stanovení fenotypu (aktivovaného stavu destiček v cirkulaci) - Zhodnocení reaktivity destiček jako odpověď na agonistu Určení prokoagulačních mikročásteček • Derivované z trombocytů po jejich aktivaci • Určení díky navázání annexinu V nebo protilátek specifických pro koagulační faktory V/Va nebo X/Xa • Zhodnocení schopnosti destiček vytvářet mikročástečky Úskalí laboratorní práce • Zpracování vzorků krve do 30 minut • Použití dostatečně široké jehly • Nepoužívat jako antikouagulant EDTA a heparin • Fixace formalinem pro lepší rozpoznávání protilátkami (x PAC1) • Prokoagulační částečky často vykazují intenzivní autofluorescenci • Při použití trombinu nutné přidat CaCl2 Průtoková cytometrie Defekty trombocytů • Bernard – Soulierův syndrom - absence komplexu GPIb-IX-V - projevy: mírná trombocytopenie zvětšení krevních destiček absence agregace destiček - určení pomocí anti-CD 41nebo anti-CD 61 Defekty trombocytů • Glanzmannova trombastenie - autosomálně recesivní porucha - defekt integrinu komplexu GPIIb-IIIa - projevy: delší čas krvácení (fibrinogen nespustí dominový efekt destiček) pomalé rozpouštění sraženiny - určení pomocí anti-CD 42a nebo anti-CD 42b • Imunofenotypizace • Funkční testy Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita Shrnutí přednášky příklady aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii