C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\C0021375-Lab_mouse,_SEM-SPL.jpg Myš jako model vývojové biologie Vendula Pospíchalová Modelový organismus v experimentální biologii •intenzívně zkoumaný organismus – cílem je poznání jeho samého, ale především popis obecnějších jevů a vztahů platících i pro jiné organismy •Vlastnosti: - krátký životní cyklus – - větší počet potomstva • - ekonomická nenáročnost • - relativní jednoduchost a nevýjimečnost ve zkoumané oblasti • - dostatečné množství dostupných informací (znalost vývoje, sekvence genomu,…) • http://www.google.cz/url?sa=i&source=images&cd=&docid=AcyitJgsw975iM&tbnid=vKifBL1zJA-70M:&ved=0CAU QjBwwAA&url=http%3A%2F%2Fwww.embl.de%2Faboutus%2Fcommunication_outreach%2Fexplore%2F201107_modelorg s%2Fimage01_spotlight.jpg&ei=172DUbWCCOKJ7AaHioCIDw&psig=AFQjCNH67glvDRtEf3zwSJr5WiHZBaRt-Q&ust=136 7674711174942 Upraveno z http://www.embl.de http://moje-zajmy.blogerka.cz/obrazky/moje-zajmy.blogerka.cz/prirodopis/slon2.jpg Nejčastější modelové organismy v experimentální biologii http://www.allthingsstemcell.com/wp-content/uploads/2009/07/ModelOrganism-copy.png http://www.asmusa.org/division/m/foto/UrLambda2.jpg http://www.universityofcalifornia.edu/everyday/agriculture/images/e_coli.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d9/S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg/240p x-S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg Phage (Bactiophage Lambda) Bacterium (Escherichia coli) Yeast (Saccharomyces cerevisiae) http://www.seymourfish.com/wp-content/uploads/2012/03/Zebra-Danio.jpg Zebrafish (Dario rerio) Etické aspekty práce se zvířaty •Práce se zvířaty je výsada/privilegium, rozhodně ne právo • 1.Musí být jasný přínos pro společnost, zdravotní či veterinární péči či získání unikátních poznatků, které jinak než za pomoci živých zvířecích modelů získat nelze 2. Je nutné, aby přínos získaných poznatků jednoznačně převážil případný diskomfort, bolest či utrpení zvířat během experimentů 3. •Etický kodex: • - pokud to lze, mají se použít organismy z co nejnižších pater fylogenetického stromu - raději bakterie než myši, raději myši než primáti • - důkladně zvážit počet a zdroj organismů, plánované procedury (minimalizovat bolest a znehybňující prostředky, zajistit vhodnou pooperační péči, právo na euthanasii, …) – součástí projektů pokusů • • Zásady práce s pokusnými zvířaty „4R“ •1959 - The Principles of Humane Experimental Technique • - W.M.S. Russell and R.L. Burch •Refinement – zjemnění = dobrá obživa, adekvátní zacházení školenými pracovníky, prostor pro život, pokusy v anestézii •Reduction – zmenšení = počtu zvířat, délky pokusu, pokus se nesmí na stejném zvířeti znovu opakovat •Replacement – nahrazení = pokus se provádí na zvířeti jen tehdy, neznáme-li žádnou alternativu, jinak dáme přednost alternativě (tkáňové kultuře atd.) •Responsibility – dodržovat zákony, schválené protokoly a etický kodex •Při nedodržení závažné následky nejen pro jednotlivce, ale i pro skupinu, ústav a celospolečenské vnímání využití laboratorních zvířat při biomedicínském výzkumu Legislativa upravující podmínky práce s modelovými organismy •Nutno dodržovat evropské a české normy • 1) zákon České národní rady na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 ve znění platných úprav, vydaného ve sbírce zákonů č. 149/2004 • 2) vyhláška Ministerstva zemědělství o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat č. 207/2004 Sb. •§ 3 a) zvířetem se rozumí každý živý obratlovec, kromě člověka, včetně volně žijícího zvířecího jedince a jeho samostatné života schopné formy, nikoliv však plod nebo embryo •§ 17 (3) Manipulovat s pokusným zvířetem a provádět zákroky vymezené projektem pokusů mohou pouze osoby, které získaly osvědčení o odborné způsobilosti [§ 18 odst. 5 písm. c)]. http://www.autoservismagazin.cz/wp-content/uploads/legislativa.jpg C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520327-Gene_therapy_research_on_mice-SPL.jpg Schéma přednášky http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ab/House_mouse.jpg Myš domácí (laboratorní) (Mus musculus) •Výhody tohoto modelového organismu: •Savec – z tradičních modelů nejblíže k člověku •Malá velikost – snadná manipulace a relativně levný chov •Nejčastěji používaný model v biomedicíně •Velká vědecká komunita – spousta zdrojů (mutantní kmeny, know how) •Genetika – osekvenovaný genom (28 000 genů, 99% má ortology u lidí, divergence 75 milionů let), inbrední linie •Široká paleta experimentálních přístupů – včetně možnosti homologní rekombinace v embryonálních kmenových buňkách a transgeneze •Množství derivovaných buněčných linií pro in vitro kultivace •Nevýhody •Neprůhledné tělo, nepřístupné embryo, (příliš?) složitý organismus I. Myš jako laboratorní model C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\C0075502-Lab_Mouse-SPL.jpg Životní cyklus myši • Gestace – 19-21 dní • Odstav – 3-4 týdny • Pohlavní dospělost – 6-7 týdnů • Generační doba – 2-3 měsíce • Estrus – polyestrální, 4-5 dní • Počet mláďat ve vrhu 4-10 • Délka života – až 2 roky • Manipulace s laboratorní myší •Přenáší se uchopena za ocas •Pro fixaci myš uchopíme palcem a ukazovákem pevně za kůži za krkem a ocas fixujeme malíkem •Pro intraperitoneální injekci (i.p.) obrátíme zafixovanou myš bříškem vzhůru, hlavou dolů (pokles vnitřností) a druhou rukou aplikujeme injekci http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTFgThyY_lF32YwriXFYiDuOysxttbBTyLb5sNMEfBT5p0R8Yii2A http://www.theodora.com/rodent_laboratory/images/tail_restraint.jpg https://www.aalaslearninglibrary.org/fileupload_content/Course2451/scruff2.jpg C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Bryja lab\Prezentace\Moje prezentace\Výuka\Bi9903 Vyv Biol a fyziol ziv I\klice.jpg Manipulace s laboratorní myší Video – tradiční zacházení s myší Video – zacházení s myší pomocí jen jedné ruky Chov laboratorních myší •Relativně nenáročný – v klíckách- granule, voda, podestýlka, materiál na hnízdo •Max. 6 myšek v jedné klícce •Náklady cca 30Kč na klícku/týden •IVC – individually ventilated cages – brání rozšíření případné infekce • • • http://www.venomousreptiles.org/data/classifieds/images/24554.jpg http://2.imimg.com/data2/AU/AH/IMFCP-4195602/product-images-img87-250x250.jpg http://www.labotal.co.il/upload/categories/cage.jpg IVC Otevřená klícka •Otevřený (konvenční) – vstup i výstup zvířat, osob i materiálu je bez • bariéry, jen se zvýšenými hygienickými opatřeními • - možno vylepšit IVC stojany a flowboxy na přestýlání myší •Bariérový – prostor pro zvířata je oddělen od vnějšího prostředí a • vstup zvířat, osob i materiálu je možný jen přes bariéru • (sterilizace vody, potravy, podestýlky • zvýšená osobní hygiena ) –SPF – specified pathogen free – •pravidelné testy (~ 3 měsíce) na •dané pathogeny (> 40), •uvedeny v certifikátu ke zvířatům -FELASA – Federation of Laboratory • Animal Science Associations Chovy laboratorních myší http://www.lfp.cuni.cz/patofyziologie/materialy/zvirata/izolator.jpg •Izolátorový – prostor pro • zvířata je trvale oddělen • bariérou od vnějšího • prostředí a ošetřovatelů • - imunodeficientní, axenické • (germ-free) a gnotobiotické • myši (definovaná mikroflóra) • - mo-, di-, poly-asociované • - první generace myší pomocí hysterektomie • •Archivace myších kmenů – kryoprezervace – embrya a spermie • - rederivace, in vitro fertilizace (IVF) – pro „oživení“ kmene i pro • „ozdravení“ (očištění od patogenů) (ustanovení SPF linie, izolátory) • • Chovy laboratorních myší Značení laboratorních myší 1)Ušní známky 2)Značení uší nebo prstíků 3)Mikročipy Software pro práci s laboratorními zvířaty pyrat.png pyrat detail.png • Pro správu myší i komunikaci s ošetřujícím personálem • Každá myš unikátní číslo (i třeba jen virtuální) • Databáze informací o každém zvířeti – „iniciály“, rodokmen, historie, chovné záznamy, … • Možnost filtrování při vyhledávání • Nevýhoda – pouze v AJ Kmeny laboratorních myší •Inbrední kmen - produktem 20 a více páření bratr x sestra, kdy všichni jedinci jsou odvozeni od jediného páru a jsou homozygotní ve všech alelách = geneticky identičtí jedinci •Vytvořeny v 1. pol.20.stol. a udržovány (Jackson Lab,NIH,Charles River) •C57BL/6 – „black 6“ - nejpoužívanější kmen, první osekvenovaný myší genom, permisivní pro většinu mutací, resistentní vůči nádorům, •možnost indukce obezity, DM II. typu i aterosklerózy dietou •129 – pro „gene-targeting“ – vysoká frekvence produkce zárodečné linie, mnoho odvozených linií embryonálních kmenových buněk •BALB/c – produkce monoklonálních protilátek pomocí hybridomů •C3H/HeJ – používaný v mnoha odvětvích – výzkum infekčních chorob,.. •FVB/NJ - pro transgenezi – velký samčí pronukleus a velká mláďata • • • • 129, C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G2850146-Transgenic_mouse,_conceptual_artwork-SPL.jpg II. „Experimental toolbox“ v běžně užívané metody a zdroje • - přirozené a indukované mutace - embryonální kmenové buňky (ESCs) - „knock-out a knock-in“ myši - transgenní myši - modelový příklad – β-katenin - zdroje – archivy, databáze,… Metody funkční genomiky Funkční genomika - cílem je určení funkce všech genů v genomu Dva hlavní přístupy: A)přímá genetika (forward genetics) 1.fenotyp (znak) 2.gen - vychází z NÁHODNÉ mutage- neze celého genomu B) reverzní genetika (reverse genetics) 1.sekvence DNA 2.Fenotyp - základem jsou CÍLENÉ mutace http://jaxmice.jax.org/images/jaxmicedb/featuredImage/002019_lg.jpg Přímá genetika – přirozené a indukované mutace 1.Kolekce přirozeně se vyskytujících mutací – vzácný vznik, většinou ve velkých chovech –př. Nahá („nude“, nu/nu, athymická, Foxn1nu) myš •1966: vznik (Glasgow, UK), 1968: myši jsou imunodeficientní (nemají thymus), 1996: myši jsou mutantní v transkripčním faktoru Foxn1 2.Indukované mutace – a) chemická mutageneze – nejčastěji N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) – př. ApcMin myš – model vzniku kolorektálního – karcinomu, mutace v genu Apc –b) Genetické mutace – „gene-traps“ – – inaktivace genu (SA-splice acceptor), – exprese reportéru a DNA značka pro – rychlé určení genu SLC7A5 S2.jpg http://www.cmhd.ca/genetrap/assets/gene_trap.gif C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\mouseDNA.jpg Reverzní genetika „Gene targeting“ – vnášení cílených mutací „Gene targeting“ – homologní rekombinace cílového vektoru v embryonálních kmenových buňkách Jak získat z pozměněných embryonálních kmenových buněk myš A)Klasický (celkový, totální) knock-out – gen zcela vyřazen (dříve často nahrazen selekčním markerem), může vést ke smrti jedince již v prenatálním věku, což neumožňuje studium funkce v dospělém organismu B)Knock-in – do genového lokusu vložena mutace (záměna, inserce, delece,…) nebo např. reportérový gen či Cre rekombináza C)Podmíněný (kondicionální) knock-out – Cre/loxP systém – místně a časově specifická inaktivace genu Genový „knock-out, knock-in“ C) FLOXED GENE B) GENE KNOCK-IN A) GENE KNOCK-OUT Cre/loxP systém • Cre_loxP system loxP recombination Babinet C., Cohen-Tannoudji M.; 2001 loxP loxP site (locus of X-ing over) Nové metody „gene targetingu“ 1.Zinc finger nuclease (ZNF) technologie (© Sigma Aldrich) ZFN-Mediated Targeted Genome Editing Image • založeno na endogenních mechanismech opravy poškozené DNA • funkční v mnoha buněčných liniích a organismech • knock-outové organismy připravené za měsíc či dva 2.TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) (© Cellectis) http://www.vicgene.com/Custom%20Services/Custom2.gif http://www.cellectis-bioresearch.com/sites/default/files/TALEN-structure.png Method of the Year 2011: Gene-editing nucleases http://www.youtube.com/watch?v=zDkUFzZoQAs •CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced pallindromic repeats/CRISPR‑associated) • • • • • • • • • •bakteriální „imunitní systém“ – proti bakteriofágům a plasmidům exogenního původu •odhalen u 40 % bakterií a u 90 % archeí, horizontální transfer komponent systému •ZNF a TALEN náročné na výrobu - zapotřebí proteinů, navíc nezcela specifické •Dnes možno připravit mutantní myš pomocí CRISPR/Cas pouze pronukleární injekcí – plasmidu s Cas9 a sgRNA – trvá 1 měsíc 3.CRISPR/Cas9 technologie (© Sigma Aldrich) C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Bryja lab\Prezentace\Moje prezentace\Výuka\Bi9903 Vyv Biol a fyziol ziv I\crispr-genomic-target-site.jpg •Transgenní organismy - jejich genom obsahuje cizorodou DNA, jejíž místo integrace je NÁHODNÉ •Příprava (pokusná myš) - injekce „nahé“ DNA (konstruktu) do zygoty –náhodná integrace do genomu (často ve formě „ tandem arrays“) –implantace do „náhradních“ (foster) matek (200-300 embryí) –genotypování potomstva na přítomnost transgenu (1-10%) –křížení „founderů“, analýza fenotypu Transgenní zvířata Transgeneze vs. Gene targeting Transgenní myši •Smysl pokusu - co se stane, dojde-li k expresi genu v jiné než původní tkáni –nadprodukce proteinu (v původní či jiné tkáni) –produkce změněného proteinu –studium regulačních oblastí genu nebo značení buněk in vivo (exprese „reportérových“ proteinů – GFP, β-galaktozidáza) •Výhody - rychlost a jednoduchost provedení •Nevýhody - náhodná integrace konstruktu – narušení genů v místě integrace –poziční efekt regulačních oblastí genů v místě integrace na expresi transgenu (umlčování transgenu, ovlivnění exprese trangenu atd.) –integrace více kopií konstruktu (efekt „genové dóze“) •Řešení - nutnost analýzy více „founders“ –použití DNA sekvencí eliminujících poziční efekt – (inzulátory, Matrix Associated Regions; MAR) –použití velkých částí chromozomů (Bacterial •Artificial Chromosome; BAC recombineering) Full-size image (54 K) Cre rekombinázy („deleter strains“) •Transgenní nebo „knock-in“ kmeny •Exprese dána promoterem – vybíráme silné a tkáňově specifické •Otestování aktivity pomocí reportérové myši – využití lokusu ROSA26, který je exprimován v průběhu embryogenese a i v dospělosti ve všech buněčných typech • A) ROSA26-LacZ - beta-galaktozidáza (lacZ) tkáň exprimující tento enzym + X-gal (substrát) -> modrý nerozpustný produkt Fig. 12. Exprese Troy Cre odpovídá expresi Troy (in situ hybridizace) B) ROSA26–EYFP - Reportérová myš pro značení a izolaci živých (=nefixovaných) buněk pro další kultivace a experimenty Cre recombináza fúzovaná s estrogenovým receptorem (CreERT2) je regulována tamoxifenem • Tamoxifen: syntetický analog estrogenu, jeho metabolit 4-0HT (4-hydroxytamoxifen) se váže na modifikovaný estrogenový receptor (ERT2) • CreERT2 – místně i časově specifická regulace rekombinace DNA Příklad využití CreERT2 myši – označení kmenových buněk ve střevě Kříženci kmenů Lgr5 - CreERT2 a ROSA26-LacZ Jak získat myš s cílenou mutací? • LoxP myš 1.Jax nebo jiná laboratoř (www.jaxmice.org) – A) Hledání v literatuře – B) Specializované databáze (www.informatics.jax.org) 2.KOMP, EUCOMM – (www.komp.org, www.eucomm.org) 3.Vytvořit svou vlastní myš (sám či na objednávku - ZNF, TALEN, CRISPR) •Cre myš 1.Jax nebo jiná laboratoř – A) hledání v literatuře – B) specializované – databáze 2.Udělat si svou myš 3. 3. 3. 3. 3. http://4.bp.blogspot.com/-mP7HyylhzzU/Tq41w8zqZlI/AAAAAAAAAC0/37mCFtAyjH0/s400/mutant_mouse_lead.jp g The web services of the International Knockout Mouse (IKMC) have been transferred to the International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC). Cíl IKMC – připravit (kondiciovaný) knock-out pro každý myší gen Updated 2013-05-06 Pomoci tohoto přístupu zjistit funkci každého genu - nutno systematicky studovat fenotyp myší - tzv. myší kliniky (jedna budována i u Prahy) - www.mousephenotype.org - IMPC The IMPC Pipeline Testy prováděné v myších klinikách https://www.mousephenotype.org/impress C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520399-Laboratory_mouse,_conceptual_artwork-SPL.jpg Shrnutí •Myš je nejpoužívanější model pro – biomedicínský výzkum •Chov konvenční vs. bariérový chov –IVC, SPF, izolátorový chov •Výborný genetický model – –inbrední kmeny, možnost manipulace genomu –– gene targeting vs. transgeneze •Klasický vs. kondicionální knock-out (knock-in) –Cre/loxP systém, ZNF, TALEN, CRISPR •Cre linie – test na reportérových myších –ROSA26-LacZ, ROSA26-EYFP •Databáze – www.jaxmice.org, www.komp.org, www.eucomm.org –www.informatics.jax.org, www.creline.org, www.mousephenotype.org • • • C:\Users\vendula pospíchalová\Documents\Korinek lab\My documents\Powerpoint templates\G3520348-Laboratory_mouse-SPL.jpg Děkuji za pozornost!