D. NUKLEOVÉ KYSELINY

Nukleové baze

Nukleosidy

Primární struktura nukleových kyselin
-struktura vazby nukleotidů: viz prezentace

Metody studia sekvence nukleových kyselin:
Enzymy používané k hydrolýze nukleových kyselin (mohou být specifické na DNA, RNA, nebo bez specifity):

-Fosfomonoesterázy - 
hydrolyzují terminální fosfátovou skupinu

-Fosfodiesterázy: 
hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu: 
	exonukleázy (5´- exonukleázy uvolňují 3´P nukleosidy,  3´- exonukleázy 	uvolňují 5´P nukleosidy)
	endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (deoxyribonukleáza, ribonukleáza)

-Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5´OH skupinu pentózy pomocí ATP

Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin:

1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (32P)
2. Specifická chemická hydrolýza v místě:
	G: působením DMS za tepla
	G + A: působením kyseliny a DMS
	C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCl
	C + T: působením hydrazinu
3. Elektroforéza získaných fragmentů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů)
4. Skenování gelů na fosfoimageru (detekce radioaktivity)

Dnes již automatické sekvenátory v servisních laboratořích (kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí)

Sekundární struktura DNA
Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C. 
Základní dvojitá šroubovice (B-DNA) obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm.
Méně běžné typy: 
A-DNA šroubovice obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední bazemi je 0,23 nm.
Z-DNA šroubovice obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38 nm.

Genetický kód mRNA prokaryot:

1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného.

2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A260 = 0.652 a A280 = 0.284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je  při 260 = 15.4 x 103 M-1.cm-1,  při 280 = 2.5 x 103 M-1.cm-1.  Pro GMP  při  260= 11.7 x 103 M-1.cm-1,  při 280 = 7.7 x 103 M -1.cm-1.

3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a deoxyribodinukleotidu složeného z A a C. 

4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích.  Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby!
(Molekulové hmotnosti složek: A = 135,  G = 151, C = 111,  U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98). 

5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující:
UpCpUpApGpAp

Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů:
a) fosfomonoesteráza
b) fosfodiesteráza hadího jedu (3´- exonukleáza)
c) fosfodiesteráza ze sleziny (5´- exonukleáza)
d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3´P oligonukleotidu)
e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3´P oligonukleotidu)

6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci):
pApCpTpTpApG
5´ terminální nukleotid byl označen 32P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny 32P?
Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí deoxyribonukleázy II a které z nich budou značeny 32P (deoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující  3´P oligonukleotidy). 

7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G.
a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC.
b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U.
(penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3´P oligonukleotidů). 
c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3´P oligonukleotidů) získáme  pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C.
Určete sekvenci oligoribonukleotidu

8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. Na fosfoimageru byl získán následující obraz:

 		G + A		G		C + T		C

start

                                                                                                    

9. Při replikaci řetězce DNA  --AGCGTAG-- byl vytvořen komplementární řetězec. Napište jeho sekvenci. Jaká bude sekvence mRNA vytvořená při transkripci?

10. Napište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DNA, vyhledejte úseky obsahující palindrom. 

a/ GATCAA,  b/ TGGAAC,   c/ GAATTC,  d/ ACGCGT,  e/ CGGCCG, f/ TACCAT

11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí (molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, deoxyribóza 134, kys. fosforečná 98. Nezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby). Jaká je molekulová hmotnost molekuly DNA o délce 1 m v Da a hmotnost v gramech? (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, relativní molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5)

12. Jaterní buňka krysy obsahuje 10-11 g DNA. Tato DNA je rovnoměrně rozdělena do 42 chromosomů buňky.
a) Jaká je molekulová hmotnost DNA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DNA).
b) Vypočítejte počet párů bazí DNA obsažené v jednom chromosomu a jeho délku (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5).

13. Molární složení guaninu + cytosinu v DNA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr mezi purinovými a pyrimidinovými bazemi? Jaké je molární složení v procentech jednotlivých bazí této DNA. 

14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení  bílkoviny, jejíž gen byl mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace provedené změnou jedné baze.
Phe  Leu	Lys  Ala	Ala  Thr	Phe  Lys	Ile  Leu
His  Glu 	Pro  Ser

15. DNA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 m namísto 16, 49 m. 
a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí
b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DNA 
c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 140.

16. Směs nukleosidtrifosfátů značených 32P na -fosfátu byla inkubována s RNApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu . Byla zjištěna inkorporace 3.104 molekul fosfátu do značeného produktu. 
Jaký počet řetězců RNA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka?

17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující sekvence DNA jsou následující:
Phe –Glu –Ile –Leu –Glu –Arg –Arg 
TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG
Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence restrikční místo TT/CGAA
a jiné restrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence aminokyselin ve vzniklém peptidu. 

18. DNA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%. 
a) Co je na této DNA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat
b) Tato DNA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DNA polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DNA?
c) pokud by množství nasyntezované DNA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je celkové složení bazí (to je DNA matrice + DNA syntezované in vitro)
d) mRNA syntezovaná jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C 18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DNA byl použit pro syntézu RNA?

19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mRNA in vitro za použití 90% UTP a 10% CTP.  Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti všech 20 t-RNA. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu. 
Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení polypeptidů.

20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tRNA značená na glutaminu. Poté byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tRNA. Tato tRNA byla přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mRNA. Ke směsi byl přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid? 

21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250 aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu? Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze vyvodit?

G. REDOXNÍ REAKCE

Pro redukci látky obecně platí
                     [ox] + e-   [red]
tento děj charakterizuje redoxní potenciál E’ (v biochemii definován při pH 7)

		         RT        [ox]
  E´ = Eo´ + ------ ln ---------
                                nF       [red]

                    standardní            aktuální
                    redox pot.      koncentrace složek

Pravidlo: Tabulková hodnota redoxního potenciálu vždy odpovídá směru redukce dané složky. Hodnota redoxního potenciálu pro směr oxidace má opačné znaménko.
F = 96500 C.mol‑1 R; R = 8,314 J.K‑1.mol‑1

Reakce mezi dvěma redoxními systémy:

          (ox)1 + (red)2  (red)1 + (ox)2

      Pokud je systém v rovnováze, platí G´ = 0 a E1= E2

	RT	 [ox1]		  RT	  [ox2]
Eo´1 + -----  ln --------  = Eo´2 + ----- ln --------
	nF	[red1]		  nF	  [red2]

		RT	[ox2][red1]
Eo´1 - Eo´2  =  -----  ln ---------------
		nF	[red2][ox1]

        [ox2][red1]			RT
Keq = ----------------   => Eo´1 - Eo´2 = -------  ln Keq
        [ox1][red2]			nF

            Go’= ‑ RT ln Keq  

         Go’
Eo´1 - Eo´2 = ------- 
	          nF

               Go´  = ‑nF Eo´

Tabulka. Hodnoty standardních redoxpotenciálů některých důležitých redoxních párů při pH 7:
    oxidovaná/redukovaná forma 		Eo´ [V]
    acetát/acetaldehyd            		‑0,580
    NAD+/NADH                     		‑0,320
    NADP+/NADPH                		‑0,324
    acetaldehyd/ethanol           		‑0,197
    pyruvát/laktát                			‑0,185
    oxalacetát/malát              		‑0,166
    ubichinon/ubihydrochinon      		+0,100
    2cyt b(ox)/2cyt b(red)        		+0,030
    fumaran/jantaran              		+0,031
    2cyt c(ox)/2cyt c(red)        		+0,235
    2cyt a(ox)/2cyt a(red)        		+0,385
    ½ O2 /H2O                   			+0,816

1. Vypočítejte redoxní potenciál E´ směsi NAD/NADH, je‑li koncentrace NAD 1 mmol.l‑1, NADH 10 mmol.l‑1. 

2. 	Srovnáním standardních redox potenciálů určete, zda reakce bude mít tendenci probíhat doleva nebo doprava: 

     	 malát + NAD+  oxalacetát + NADH + H+
     	 pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+
     	malát +  pyruvát   oxalacetát + laktát
      	acetaldehyd + fumarát  acetát + jantaran

3. 	Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce ze standardního redox potenciálu Eo´ (t=25oC) 
malát + NAD+  oxalacetát + NADH + H+

4. Vypočítejte, jaký musí být poměr koncentrací NAD/NADH, aby reakce:
        pyruvát + NADH + H+  laktát + NAD+
byla při 25oC v rovnováze, je‑li poměr koncentrací pyruvát/laktát = 1.

5. Vypočítejte  G reakce:
        jantaran + NAD+   fumaran + NADH + H+
je‑li koncentrace NAD 10 mmol.l‑1, NADH 1 mmol.l‑1, jantaranu 10 mmol.l‑1, fumaranu 5 mmol.l‑1, t=25oC. 

6. Vypočítejte G reakce při 25oC
        NADH + H+ + UQ   UQH2 + NAD+
je‑li koncentrace NAD 100krát vyšší než koncentrace NADH a koncentrace UQH2 2krát vyšší než koncentrace UQ.
Eo´(UQ/UQH2)= +0.104 V,  Eo´(NAD+/NADH) = ‑0,320 V

7. Určete Go´ reakce:
       acetaldehyd + fumaran   acetát  + jantaran
Eo´ (acetát/acetaldehyd) = ‑0,580 V, E´o (jantaran/fumaran) = 0,030 V. V jakém směru bude reakce probíhat?

8.  Určete Go´ reakce:

       cyt c2+ + cyt a3+    cyt c3+ + cyt a2+

Eo´ (cyt c3+ / cyt c2+)= +0,235 V, Eo´ (cyt a3+ / cyt a2+) =+0,385 V. V jakém směru bude reakce probíhat?

9.  Vypočítejte Go´reakce:

       cyt a(red) + ½ O2 + 2H+  cyt a(ox) + H2O

Eo´(cyt a(ox)/cyt a (red)) = 0,385 V , Eo(½ O2 /H2O)= 0,816 V. Je‑li Go´ syntézy ATP z ADP a Pi  +30 kJ.mol-1, kolik molekul ATP může vzniknout při této reakci za standardních podmínek?

10. Vypočítejte, jaký je poměr koncentrací NAD/NADH u ethanolického kvašení v rovnováze, pokud by koncentrace ethanolu byla 5% a koncentrace acetaldehydu 0,5 mmol.l-1. Hustota roztoku alkoholu = 1 g.ml-1.

NADH + H+ + aldehyd   NAD + alkohol

Eo (acetaldehyd/ethanol) = -0,197 V;  Eo (NAD+/NADH) = -0,320 V.

11. Dokažte pomocí výpočtu Go´, zda při oxidaci acetaldehydu na acetát je vhodnějším koenzymem NAD nebo FAD. 

 Acetaldehyd  + oxid.  koenzym    acetát + red. koenzym 

Při výpočtu berte v úvahu situaci, kdy poměr  reduk. koenzym/oxid. koenzym = 1/100 a koncentrace acetaldehydu a acetátu je ekvimolární. 
Eo´ (acetát/acetaldehyd) = -0,580 V, Eo´ (NAD+/NADH) = -0,320 V, Eo´ (FAD/FADH2) = 0,000 V.

H. CITRÁTOVÝ CYKLUS 

1. Srovnejte Go´ reakcí citrátového cyklu. Které reakce mají tendenci probíhat obráceným směrem a jakým způsobem dochází k posunu reakcí žádoucím směrem? 

2. V kterém místě citrátového cyklu dochází k dekarboxylaci :
Přeměna: a) citrátu na akonitát, b) isocitrátu na oxoglutarát, c) malátu na oxalacetát, d) oxalsukcinátu na 2-oxoglutarát ,e) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA

3. V kterém místě citrátového cyklu dochází k oxidaci substrátu
     Přeměna
    a) sukcinátu na fumarát  b) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA
    c) fumarátu na malát     d) oxalacetátu na citrát e) acetylkoenzym A na citrát

4. Napište bilanční rovnici přeměny oxoglutarátu na sukcinát v citrátové, cyklu.

5. Jaké jsou rovnovážné relativní koncentrace isocitrátu, citrátu a cis‑akonitátu, je‑li Go´ reakcí následující: 
       1/ citrát  cis‑akonitát + H2O        Go´ =+8.4 kJ.mol‑1
       2/ cis‑akonitát + H2O  isocitrát    Go´ =‑2.11 kJ.mol‑1

6. Napište bilanční rovnice přeměny těchto látek v Krebsově cyklu do stadia oxalacetátu: 
a) citrát
b) jantaran
c) malát
Napište vzorce uvedených karboxylových kyselin.

7. Jaká je distribuce uhlíku 14C na oxalacetátu po přidání pyruvátu značeného na a) C1, b) na C2, c) na C3
k enzymům Krebsova cyklu a k pyruvát dekarboxylase?

8. K enzymům Krebsova cyklu byla přidán acetylCoA značený 13C na methylové skupině. Dokažte, jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklém citrátu a jaká ve vzniklém isocitrátu

9. Na základě hodnoty Go´ vypočtené ze standardních redoxpotenciálů zdůvodněte, proč oxidace jantaranu na fumaran v Krebsově cyklu probíhá za účasti FAD jako koenzymu a nikoliv NAD+.
	jantaran + FAD  fumaran + FADH2
        	jantaran + NAD+  fumaran + NADH + H+
           Eo´ (FAD/FADH2) = 0,000 V

10. Navrhněte hypotetický cyklus analogický Krebsově cyklu, kde by jako počáteční krok byla reakce acetylCoA s oxoglutarátem namísto s oxalacetátem.

I. GLYKOLÝZA

1.  Napište vzorce: kys. 1,3 bis fosfoglycerové, fosfoenolpyruvátu. K aldolase byl přidán fruktosa 1,6 bis fosfát značený na C2. Jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklé triose?

2. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku C2. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bis fosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa‑1,6 bis fosfátu?

3. Fruktosa 1,6‑bisfosfát byl značen fosfátem 32P na uhlíku číslo 1. Prokažte, zda se tento značený fosfát objeví ve formě ATP, pokud anaerobní glykolýza proběhla do stadia kys. 3‑fosfoglycerové.

4. Napište bilanční rovnici přeměny glyceraldehyd‑3‑P na fruktosa‑6‑P v procesu glukoneogeneze:

    Glyceraldehyd‑3‑fosfát + A + B +...    fruktosa‑6‑P + X + Y + ...

5. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa‑6‑fosfátu na kys. 3‑fosfoglycerovou v procesu anaerobní glykolýzy. 

  Fru‑6‑P + X + Y + ...    kys.3‑P‑glycer. + A + B +...

6. Látka A je produktem anaerobní glykolýzy. Její redukcí NADH vzniká látka B. Transaminací látky A vzniká látka C. Napište názvy a vzorce látek A,B,C.

7. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosy na pyruvát v procesu anaerobní glykolysy za předpokladu: 	a) fosforylace fruktosy hexokinasou

       fruktosa + ATP fruktosa‑6‑P + ADP

		 b) fosforylace fruktosy fruktokinasou

       fruktosa + ATP fruktosa‑1‑P + ADP

8.. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa‑1,6‑bisfosfátu na fosfoenolpyruvát při anaerobní glykolýze
a) v přítomnosti NAD, Pi a ADP
b) v přítomnosti NAD+, ADP, arseničnanu

9. Glukosa byla značena 14C. Jaká bude distribuce značeného uhlíku v pyruvátu po přeměně značené glukosy v procesu anaerobní glykolýzy.
    a) v případě značení na C1
    b) v případě značení na C6
(izomerace glyceraldehydfosfátu na dihydroxyacetonfosfát je velmi rychlá vzhledem k následujícícmu kroku).
 
10. Jaká bude rovnovážná koncentrace fruktosa‑1,6‑bisfosfátu, glyceraldehyd‑3‑fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu, jestliže fruktosa‑1,6‑bisfosfát 1 mmol.l‑1 byl inkubován s aldolasou (Go´ = + 24 kJ.mol-1).

11. Zdůvodněte, proč při anaerobní glykolyse musí být glukosa‑6‑fosfát izomerován na fruktosa‑6‑fosfát. Vezměte v úvahu reakční mechanismus aldolasové reakce. Proč tato reakce probíhá s fruktosa‑1,6‑bisfosfátem a nikoliv s glukosa‑1,6‑bis fosfátem?

12. Glukosa značená 14C na C1 byla přidána do směsi obsahující enzymy pentosového cyklu. Jaký je osud radioaktivně značeního uhlíku při přeměně na dvě molekuly triosy ?
 
13. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku karboxylové skupiny. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa‑1,6‑bisfosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa‑1,6‑bisfosfátu.

14. Na základě velikosti Go´ odhadněte, které reakce nemohou při glukoneogenesi probíhat zvratem anaerobní glykolysy. Jakým způsobem jsou tyto reakce obcházeny? (Jedna z reakcí probíhá přes nepříznivé Go´. Odhadněte proč.)

15. 	Určité bakteriální mutanty mají nefunkční triosafosfát izomerázu. Vysvětlete, proč je tato mutace letální pro organismus  fermentující glukosu výlučně cestou anaerobní glykolýzy.

16. 	Vysoké koncetrace pyruvátu inhibují izoenzym laktátdehydrogenasy srdečního svalu, nikoli však izoenzym ze svalu kosterního. Jaké by byly důsledky tohoto efektu, kdyby srdeční sval obsahoval pouze izoenzym totožný s izoenzymem kosterního svalu.
Jaké by byly obrácené důsledky, kdyby kosterní sval obsahoval izoenzym totožný s izoenzymem srdečním?

17. Při glukoneogenezi je termodynamická bariéra tvorby fosfoenolpyruvátu obcházena tvorbou oxalacetátu (koenzym biotin). Napište obě dvě rovnice použité k obchvatu pyruvát kinázové reakce a vypočítejte Go´ souhrnné reakce. (Předpokládejte, že GTP je termodynamicky ekvivalentní ATP).

J. RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC

1. Rozdělte jednotlivé složky respiračního řetězce na jednoelektronové a dvouelektronové přenašeče. Napište redoxní rovnice mezi uvedenými partnery a všimněte si, kde vystupuje jako reakční partner H+.

    NADH ‑ UQ    UQH2‑Cyt c    cyt b‑cyt c   cyt a‑ 1/2 O2
    cyt c‑cyt a

2. Vypočítejte Go´ reakce mezi:
    a) NADH + UQ
    b) jantaran + UQ
    c) cyt b(red) + cyt c(ox)
    d) cyt c(red) + ½ O2
Na základě velikosti Go´ odhadněte, při které reakci je kryta energetická spotřeba vzniku jedné molekuly ATP (Go´=‑30 kJ.mol‑1).

3. Vypočítejte Go´ oxidace NADH kyslíkem v respiračním řetězci. Kolik molů ATP by teoreticky vzniklo za standartních podmínek (Go´ = ‑30 kJ.mol‑1). Jestliže namísto kyslíku použijeme umělého akceptoru hexakyanoželezitanu (Eo´= +0,360 V), jaká bude změna standardní volné energie reakce a kolik molů ATP vznikne?

 4. Doplňte bilanční rovnici přeměny následujících látek v Krebsově cyklu a v respiračním řetězci:

    jantaran + ADP + ½ O2   fumaran + ATP
    isocitrát + ADP + ½ O2    jantaran + ATP
    jantaran + ADP + ½ O2   oxalacetát + ATP

5. Po přídavku inhibitoru respirace antimycinu k systému repiračního řetězce mitochondrií  byla zjištěno úplné zredukování ubichinonu, cytochromu b a úplné zoxidování cytochromů c, aa3. Zakreslete místo zásahu tohoto inhibitoru. 

6. Doplňte bilanční rovnici přeměny fumaranu na oxalacetát za spolupráce enzymů Krebsova cyklu a respiračního řetězce:

       fumaran  + ADP + ....  oxalacetát + ATP + ....
       2-oxoglutarát  + ADP +.....    fumaran  + ATP  + .....

7. Vypočítejte Go´ reakce při 25oC

       fumaran + NADH + H+ jantaran + NAD

 víte‑li, že: Eo´ (NAD/NADH) = ‑0,320 V, Eo´ (fum/jan)= +0,030 V
 Bylo by možné, aby za standardních podmínek byla tato reakce využita k syntéze ATP? (hydrolýza ATP: Go´=‑30 kJ/mol)

Zakreslete úseky respiračního řetězce, které se podílejí na této oxidaci NADH.

K. FOTOSYNTÉZA

    Světelná fáze

Souhrnná rovnice:

           2 ferred.(red) + NADP+ + H+  2 ferred (ox) + NADPH
            H2O + ADP + Pi + Aox      ½ O2 + 2H+ + ATP + Ared

Temnostní fáze (Calvinův cyklus)

fixace:

    CO2 + ribulosa‑1,5‑bisfosfát + H2O  2 kys. 3‑fosfoglycerová

redukce:

kys.3‑fosfoglycerová + NADPH + ATP  glycerald.‑3‑P + NADP + ADP + Pi + H20

syntéza hexózy:

                       2P- 3     P- 6    + Pi

regenerace:

  P-  6                                                                         P - 5 
   +
  P-  3                                  P - 4
							                + 3 ATP  3 P- 5 -P + 3ADP
           				                   P- 7            P-  5

          			           P - 3           P- 3             P-  5

souhrnná rovnice: 

                    5 P- 3   + 3 ATP    3 P- 5  -P + 3 ADP + 2Pi

1. Napište souhrnnou rovnici světelné fáze fotosynthesy ve fotosystému I, fotosystému II a souhrnnou rovnici při propojení obou fotosystémů. Pokuste se napsat souhrnnou rovnici temné fáze fotosynthesy s oxidem uhličitým na jedné straně a s triosofosfátem na straně druhé. Vodu nutnou pro hydrolýzu ATP zanedbejte. 

2. Vypočítejte Eo a Go´ reakce mezi redukovaným ferredoxinem a NADP při fotosynthese (Eo´ ferredoxinu = ‑0,43 V).
3. K enzymům temné fáze fotosyntézy (fixace CO2) byl přidán ribulosa‑1,5‑bisfosfát a 14CO2. Jaká bude distribuce radioaktivity v kyselině 3‑fosfoglycerové? Jaká bude distribuce readioktivity v tomtéž případě, pokud byl přidán neznačený CO2 a ribulosa‑1,5bisfosfát značený na C5?

4. Srovnejte proces redukce kys. 3‑fosfoglycerové na glyceraldehyd‑3‑fosfát při fotosyntéze a vratný proces oxidace glyceraldehyd‑3‑fosfátu při anaerobní glykolyse. V čem se oba procesy liší?

5. Fotosystém I má v základním stavu standartní redox potenciál Eo´= +0,460 V. Po absorpci světelného kvanta se jeho potenciál změní na Eo´= ‑0,600 V. Vypočítejte rovnovážný poměr koncentrací NADPH/NADP v reakci: 

     2 fotosys.I(red) + NADP + H+  2 fotosys.I (ox) + NADPH

s fotosystémem I v základním a excitovaném stavu. Poměr koncentrací oxidovaného a redukovaného fotosystému je roven 1, t = 25oC.

6. Dokažte výpočtem G, zda redukovaný ferredoxin (Eo´ =‑0,430 V) je při fotosyntéze schopen redukovat NADP (Eo´ = ‑0,324 V), pokud poměr koncentrací NADPH/NADP je při 25°C roven 100. Výchozí poměr redukovaného a oxidovaného ferredoxinu je roven 1. Napište rovnici této reakce.

7. Jeden z používaných herbicidů diuron je známým inhibitorem fotosyntézy. Tento inhibitor blokuje syntézu NADPH v chloroplastech, přičemž plastochinon se zcela zredukuje. Zakreslete pravděpodobné místo zásahu.

8. Určité primitivní fotosyntetizující bakterie žijící poblíž podmořských sopek obsahují bakteriochlorofyl a fotosystém II. Produktem této fotosyntézy je síra. Vysvětlete pomocí schématu rovnice.

VÝSLEDKY ÚLOH

D
2. 	 A260=[AMP]  260(AMP) + [GMP]  260(GMP)
     A280=[AMP]  280(AMP) + [GMP]  280(GMP)
     [GMP]=3,07.10-5 mol/l, [AMP]=1,90.10-5 mol/l
4. RNA 321, DNA 309
5. a/ UpCpUpApGpA
    b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd.
    c/ UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd.
    d/ UpCpUpA+pGpAp
    e/ UpCpU+pA+pG+pAp
6.  fosfodiesteráza hadího jedu: 32pApCpTpTpA+pG, 32pApCpTpT+pA+pG,  32pApCpT+pT+pA+pG, 32pApC+pT+pT+pA+pG (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený)
     deoxyribonukleáza II: 32pAp+CpTpTpApG, 32pApCp+TpTpApG, 32pApCpTp+TpApG, 32pApCpTpTp+ApG, 32pApCpTpTpAp+G a další
6. 	a) pC…je na volném 3´ konci RNA
b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí polynukleotid (psáno od 5´konce k 3´konci) za U a C
možnosti: ACAGUC
                ACGAUC
                GAUACC
                AGUACC
c) A bude na začátku
    možnosti: AGCAUC…vyřazeno z důvodů b)
                    ACGAUC
                    AGCACU…nesplňuje podmínku a)
                    ACGACU…nesplňuje podmínku a)
         řešení:(pApCpGpApUpC)
8. (-ATAGGCTTAGTACCA-)
9. -TCGCATC-,  -UCGCAUC-
10. a/ GATCAA   palindrom:GATC
          CTAGTT                    CTAG
      b/ TGGAAC   palindrom není
          ACCTTG
      c/ GAATTC    celé palindrom
          CTTAAG
      d/ ACGCGT    celé palindrom
          TGCGCA
      e/ CGGCCG   celé palindrom
          GCCGGC
       f/ TACCAT     palindrom není
          ATGGTA
11. 617,5; 1,82.106 Da, 3,02.10-18 g
12. a) 1,43.1011 Da
      b) 2,32.108 pb, 0,079 m
13. 67,2% G+C, 32,8% A + T, molární poměr purinových a pyrimidinových bazí je 1:1, molární složení: 33,6 % G, 33,6% C, 16,4% A, 16,4% T
14. PheLeu, AlaThr, IleLeu, ProSer-
15. a) 8500 pb 
      b) rozdíl v molekulové hmotnosti je 5,25.106 Da, což je 8,72.10-18 g
      c) 2833 kodonů a tedy aminokyselin, což je 3,97.105 Da
16. 100 řetězců, průměrná délka 300 bazí (za předpokladu, že polymerace proběhne v obou  pokusech stejně)
17. TTC GAA pro Phe a Glu,  
      TTT GAG ATC TTG GAG CGG CGG nebo TTT GAG ATC TTA GAG CGG CGG
18. a)jednoduchá šroubovice
      b)G 19%, T 25%, A 33%, C 23%
      c)G 21%, T 29%, A 29%, C 21%
      d)nový řetězec DNA
19. frekvence kodonů:
      UUU     0,9.0,9.0,9= 72,9%  Phe
      UUC     0,9.0,9.0,1= 8,1%    Phe
      UCU                         8,1%    Ser
      CUU                         8,1%    Leu 
      UCC                         0,9%    Ser
      CUC                         0,9%    Leu
      CCU                         0,9%    Pro
      CCC                         0,1%    Pro
 Po součtu dostáváváme teoretické aminokyselinové složení shodné s experimentálním.
20.	frekvence kodonů:
GGG                     12,5%    Gly
GAA                      12,5%    Glu
       AGA                      12,5%    Arg
       AAG                      12,5%    Lys
       GGA                      12,5%    Gly
       GAG                      12,5%    Glu
       AGG                      12,5%    Arg
       AAA                       12,5%    Lys
       Syntezovaný polypeptid bude obsahovat 25% glutamátu.
21.	strukturní gen: 750 nukleotidů (+ iniciační a terminační kodony)
serin je v aktivním centru

G
1. 	E=‑0,35 V
2. 	doleva, doprava, doleva, doprava
3. 	Při výpočtu EO odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované.
    +29,7 kJ/mol, 6,13.10‑6
4. 	 [laktát]/[pyruvát]=1
     E0= E0/LAK- E0/NAD=-0,185-(-0,32)=0,135V
     E0= (RT/nF)  ln([laktát][NAD+]/[pyruvát][NADH])
     [NAD+]/[NADH]=3,71 104
5. 	 E0= -0,32-(-0,031)= -0,351V
     G0= 67,7 kJ/mol
     G= G0 + RT ln ([fumaran][NADH]/[jantaran][NAD+])=+60,3 kJ/mol
6. 	 E0=0,104-(-0,32)= 0,424V
     G0= -81,8 kJ/mol
     G= G0 + RT ln ([UQH2][NAD+]/[UQ][NADH])= -68,7 kJ/mol
7. 	E0= 0,03-(-0,58)= 0,61V
    G0= -117,7 kJ/mol
    Reakce probíhá doprava.
8. 	G0= -14,5 kJ.mol-1
    Reakce probíhá doprava.
9. 	G0= -83 kJ.mol-1, 2-3 molekuly ATP
10. 	[alkohol]=(5/46,0829)/0,1= 1,0854mol/l
      E0=0,123V
      G0= -23,74 kJ/mol
 [NAD+]/[NADH+]=6,71 
11. 	NAD+:
      E0=0,26 V, G0= -50,2 kJ/mol, G= -61,6 kJ/mol    
      FAD: 
      E0=0,58 V, G0= 111,9 kJ/mol, G= 100,5 kJ/mol
  
H 
1.    malát + NAD+  oxalacetát + NADH + H+
       citrát  isocitrát
2.    b,e
3.    a,b
4.    oxoglutarát + NAD+ + GDP + P  jantaran + CO2 + NADH + H+ + GTP
5.    K1=0,0336397
   K2=2,3444484
   citrát  isocitrát, G0= 6,29 kJ/mol, K=0,0788666
   cis-akonitát/citrát=0,0336, isocitrát/cis-akonitát=2,3444, isocitrát/citrát=0,07887
   [citrát]=1, [isocitrát]=0,07887, [cis-akonitát]=0,03364, tedy 0,079:1:0,034
6.    postupným sčítáním reaktantů a produktů dostaneme bilanční rovnice:
       a) citrát + 3 NAD+ + GDP + P + FAD + H2O  oxalacetát + 2CO2 + 3 NADH + 3H+ +                                                                                                                  + GTP + FADH2
b) jantaran + FAD + H2O + NAD+  oxalacetát + FADH2 + NADH + H+
c) malát + NAD+  oxalacetát + NADH + H+
7. U tohoto typu úloh se uvažuje pouze první průchod cyklem trikarbonových kyselin, v dalších krocích by se značený  14C objevoval i v jiných pozicích.
a)	uvolní se jako 14CO2
b)	C1 oxalacetátu
c)	C2 a C4 oxalacetátu
2. 	v citrátu na C2
v isocitrátu na C2 a C4
8. 	reakce s FAD: G0=5,98 kJ/mol
    reakce s NAD+: G0=67,7 kJ/mol
10.

I  
1.	C2 obou trios
2.	2,5
3.	ne
4.	2 glyceraldehyd-3-P + H2O  fruktosa-6-P + P
5.	fruktosa-6-P + 2 P + ADP+ 2 NAD+  2 kys.3-P-glycerová + ATP + 2 NADH + 2 H+
      1NADH je ekvivalentní 3ATP
      fruktosa-6-P + 8 P + 7 ADP  2 kys.3-P-glycerová + 7 ATP
6.	pyruvát, laktát, alanin
7.	a) hexokinasa
           fruktosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 P + 4 ADP 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+                                                                                                                                                                                                     + 4 ATP
           fruktosa + 8 ADP + 8 P  2 pyruvát + 8 ATP
      b) fruktokinasa
          fruktosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 P + 4 ADP 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+                                                                                                                                                                                                     + 4 ATP
      fruktosa + 8 ADP + 8 P  2 pyruvát + 8 ATP
8.   a) fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD+ + 2 P + 2 ADP  2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH + 2H+                                                                                                                + 2 ATP + 2 H2O
  b) neproběhne, nevzniká ATP (arseničnan nahrazuje v reakcích fosfát, ale estery s               arseničnanem okamžitě hydrolyzují)
      fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD+ + 2 HAsO42- + 2 H2O  2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH                                                                                              + 2H+ + 2 HAsO42- + 2 H2O
9.   methylová skupina v obou případech 
10.  0,22 GAP a DHAP, 0,78 mM FBF
11.  mechanismus aldolové kondenzace
12.	odštěpí se jako 14CO2
13.	C3, C4
14.	i) fruktosa-1,6-bisP + ADP   fruktosa-6-P + ATP  NEPROBÍHÁ(GO=+14,2kJ/mol)
           ve skutečnosti:
           fruktosa-1,6-bisP + H2O  fruktosa-6-P + P       FRUKTOSABISFOSFATASA
       ii) glukosa-6-P + ADP   glukosa + ATP                NEPROBÍHÁ(GO=16,7kJ/mol)             ve skutečnosti:
           glukosa-6-P + H2O  glukosa + P                      GLUKOSA-6-FOSFATASA
        iii) pyruvát + ATP  fosfoenolpyruvát + ADP         NEPROBÍHÁ (GO= +31kJ/mol)
             ve skutečnosti:
a)	fosfoenolpyruvátsynthetasa (bakterie)
b)	pyruvát + ATP + CO2  oxalacetát + ADP + P
oxalacetát + GTP  fosfoenolpyruvát + GDP + CO2
       Přes nepříznivé GO probíhá reakce:
       fruktosa-1,6-bisP  glyceraldehydfosfát + dihydroxyacetonfosfát
15.	hromadí se dihydroxyacetonfosfát dle výsledné bilanční rovnice:
glukosa + P  dihydroxyacetonfosfát + laktát    NEPRODUKUJE SE ENERGIE!
16.  LDH srdečního svalu (izoenzym H4)  je vhodnější pro oxidaci laktátu na pyruvát. Pokud by se zde uplatnila LDH kosterního svalu, mohl by se v srdečním svalu hromadit laktát. 
LDH kosterního svalu (izoenzym M4) je lépe uzpůsobena pro oxidaci pyruvátu na laktát, což umožňuje kosternímu svalu pracovat na "kyslíkový dluh".  Při nedostatku kyslíku se hromadí NADH vznikající při anaerobní glykolýze a likviduje se redukcí pyruvátu na laktát (únava). Svalové buňky předávají laktát do krve, následně může být  v játrech přeměněn na glukosu. 
17. 	 I) pyruvát + ATP + CO2  oxalacetát + ADP + P
II) oxalacetát + GTP  fosfoenolpyruvát + CO2 + GDP
Souhrnná reakce:
pyruvát + 2 ATP  fosfoenolpyruvát + 2 ADP + P
[součet: a) pyruvát + ATP  fosfoenolpyruvát + ADP (GO= +31kJ/mol)
               b) ATP = ADP + P                                          (GO= -30,5kJ/mol)]
GO(celk) = +0,5 kJ/mol

J
1.	jednoelektronové: cyt c, cyt b, cyt a, UQ
dvouelektronové: NADH
NADH + H+ + UQ  NAD+ + UQH2
UQH2 + cyt c (ox)  UQH + H+ + cyt c (red) 
UQH2 + 2 cyt c (ox)  UQ + 2H+ + 2 cyt c (red)
cyt c (red) + cyt b (ox)  cyt c (ox) + cyt b (red)
2 cyt a (red) + 1/2 O2 + 2H+ 2 cyt a (ox) + H2O
cyt c (red) + cyt a (ox)  cyt c (ox) + cyt a (red)
2.	Ve vzorci GO= -n  F  EO se při výpočtu EO odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované.
      a) NADH + H+ + UQ  NAD+ + UQH2
           E0/NAD+= -0,32V
           E0/UQ= +0,10V
           GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,10-(-0,32))= -81,06 kJ/mol 
           Kryta energetická spotřeba vzniku dvou ATP.
      b) jantaran + UQ  fumarát + UQH2
          E0/fum= 0,031V
          E0/UQ= 0,10V
          GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,1-0,031)= -13,317 kJ/mol
      c) 2 cyt b (red) + 2 cyt c (ox)  2 cyt b (ox) + 2 cyt c (red)
          GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,235-0,03)= -39,57 kJ/mol
          Kryta energická spotřeba vzniku jednoho ATP.
      d) 2 cyt c (red) + 1/2 O2 + 2H+  2 cyt c (ox) + H2O
          GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,816-0,235)= -112,13 kJ/mol
          Kryta energetická spotřeba vzniku tří ATP.
3.	a) NADH + 1/2 O2 + H+  NAD+ + H2O
          GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,816-(-0,32))= -219,25 kJ/mol
          Teoreticky by vzniklo 7,3 molů ATP.
      b) NADH + 2 [Fe(CN)6]3-  NAD+ + H+ + 2 [Fe(CN)6]4-
          GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,36-(-0,32)= -131,24 kJ/mol
          Teoreticky by vzniklo 4,4 molů ATP.
4.	 jantaran + 2 ADP + 1/2 O2  fumaran + 2 ATP + H2O + 2P
 isocitrát + 7 ADP + 7P + O2  jantaran + 2 CO2 + 7 ATP + 2 H2O
 jantaran + 5 ADP + 5P + O2 + H2O  oxalacetát + 5 ATP + 2 H2O
5.	Antimycin je inhibitorem komplexu III, zasahuje v místě cytochromu bc1.
6.	fumaran + 3 ADP + 3P + 1/2O2  oxalacetát + 3 ATP + H2O
2-oxoglutarát + 6 ADP + 6P + O2  fumaran + 6 ATP + CO2 + H2O
7.	GO= -n  F  EO= -2  96500  (0,03-(-0,32))= -67,55 kJ/mol
Tato reakce by mohla být využita k syntéze 2,2 molů ATP.

K
1.	souhrnná rovnice pro fotosystém I:
2 PSI* (red) + NADP+ + H+  2 PSI (ox) + NADPH
souhrnná rovnice pro fotosystém II:
4 PSII (ox) + 2 H2O  4 PSII (red) + O2 + 4 H+
souhrnná rovnice pro oba fotosystémy:
2 H2O + 2 NADP+  O2 + 2H+ + 2 NADPH
temná fáze fotosyntézy:
3CO2 + 6NADPH + 6H+ + 9ATP  glyceradehydfosfát + 6NADP + 9ADP + 8P +                                                                                                                               3H2O
2.	2 ferredoxin (red) + NADP + H+  2 ferredoxin (ox) + NADPH
      GO= -21 kJ/mol
      EO= 0,106 V
3.   na C1 v prvním případě, na C3 ve druhém případě
4.   lokalizace: chloroplasty (NADPH) X cytoplazma (NADH)
5.  2 fotosystém I (red) + NADP + H+  2 fotosystém I (ox) + NADPH
      EONADP= -0,324 V
      základní stav:
      GO= -n  F  EO= -2  96500  (-0,324-0,46)
      GO= 151,312 kJ/mol= -R  T  ln([fot I (ox)]2  [NADPH]/ [fot I (red)]2  [NADP])
      [NADPH] / [NADP] = 2.995  10-27
      excitovaný stav:
      GO= -n  F  EO= -2  96500  (-0,324-(-0,60))
      GO= -53,268 kJ/mol= -R  T  lnK
      [fot I (ox)]2  [NADPH]/ [fot I (red)]2  [NADP]= 2,175  109
      [NADPH] / [NADP] = 2,175  109
6.  2 ferredoxin (red) + NADP + H+  2 ferredoxin (ox) + NADPH
      GO= -n  F  EO= -2  96500  (-0,324-(-0,43))= -20,46 kJ/mol
      G = GO + R  T  ln ([ferr(ox)]2  [NADPH]/[ferr(red)]2 [NADP])
      G = -20460 + 8,31  298  ln (100)= -9056 J/mol…samovolný průběh
      poměr v rovnováze: ferr(ox)/ferr(red)= 6,2 
      Redukovaný ferredoxin je schopen redukovat NADP, dokud se poměr  ferr(ox)/ferr(red) nezmění z 1 na 6,2.
7. diuron zasahuje v místě komplexu b6f
8.	Jedná se o zelené sirné bakterie (rod Chlorobium) patřící mezi obligátně fototrofní organismy. Jsou inhibovány vyšší tenzí O2.
rovnice fotosyntézy: 2H2S + CO2  {CH2O} + H2O + 2S, kde {CH2O} je např.cukr