Role metabolomiky v systémové biologii Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA mRNA PROTEIN METABOLIT Genom / Genomika Transkriptom / Transkriptomika Proteom / Proteomika Metabolom / Metabolomika „OMICKÉ“ POLE dna_rgb dna_versus_rna_reversed_large protein Atp kys_citronova pet Důležité pojmy uMETABOLISMUS – látková přeměna usoubor všech enzymových reakcí, při nichž dochází k přeměně látek a energií v buňkách a v živých organismech u uPrimární •anabolismus – reakce spojené s biosyntézou •katabolismus – reakce spojené s degradací u uSekundární u • • • u Důležité pojmy • • uMETABOLOMIKA uvědní disciplína zaměřená na studium metabolomu •kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce za daného metabolického stavu. • ®Rychlé zastavení metabolismu ® ®příprava vzorku nesmí vyloučit žádné metabolity ® ®vysoká účinnost a senzitivita analytických technik Důležité pojmy uMETABOLOM ukompletní soubor metabolitů v buňce či biologickém systému v daném čase (Fiehn, 2002) u uMETABOLIT unízkomolekulární organická sloučenina (< 1000 Da), uprodukt látkové přeměny u Chemická třída Typické příklady Aminokyseliny, aminy… L-glutamát, L-aspartát Karboxylové kyseliny Kys. Pyrohroznová Alkoholy Glycerol Aldehydy Acetaldehyd, formaldehyd Fosfátové estery, nukleotidy D-glukosa-1-fosfát, ATP, ADP Sacharidy D-glukosa, D-fruktosa Lipidy, steroidy a mastné kyseliny Cholesterol Vitamíny a koenzymy NAD+, NADH Anorganické ionty Fosfáty, nitráty http://i308.wikispaces.com/file/view/metabolism.jpg/58772752 Strategie pro výzkum metabolomiky uFINGERPRINTING •komplexní analýza intracelulárních metabolitů bez nutnosti kvantifikace a identifikace •Þ screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje • • uFOOTPRINTING •komplexní analýza extracelulárních metabolitů bez nutnosti kvantifikace a identifikace •Þ screening: klasifikace vzorku na základě jeho původu a zdroje u uPROFILOVÁNÍ METABOLITŮ u (metabolite profiling) •analýza daného souboru metabolitů, např. souboru AMK, organických sloučenin •často semikvantitativní analýza • u uCÍLENÁ ANALÝZA METABOLITŮ u (metabolite target analysis) •kvalitativní i kvantitativní analýza vybraných metabolitů související se specifickou metabolickou reakcí •používána zejména když jsou požadovány nízké limity detekce Strategie pro výzkum metabolomiky Strategie pro výzkum metabolomiky uMETABONOMIKA (metabonomics) •komplexní metabolické studie zejména v toxikologii •ohodnocení tkání a biolologických tekutin na základě změn endogenních metabolitů (výsledek nemocí nebo terapeutického léčení) •bez potřeby specifické identifikace • • • u • u Proč se zabývat metabolomikou? uPočet metabolitů v buňce může být až řádově nižší než počet genů a proteinů. u uMetabolom – nejnižší linie genové exprese - přímo odráží funkční úroveň buňky. u uZměny metabolitů v buňce nejsou regulovány pouze genovou expresí, ale i vlivy životního prostředí. u uKvantifikace metabolitů nabízí přímý přístup ke zkoumání vnitřní kinetiky metabolismu (in vivo kinetics). u uMetabolomické experimenty vyžadují 2x – 3x méně času ve srovnání s proteomickými a transkriptomickými experimenty. Metabolom (Escherichia coli K12) (4392 genů) (4464 proteinů) (796 metabolitů) Genom Proteom Nevýhoda oproti jiným omickým přístupům uObtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!! DNA%20Array%201 113px-Elektroforeza image005 RT-PCR, DNA Microarrays, Gene Chips 2D-PAGE MALDI-TOF, 2D-LC, LC-MS Metabolom Genom Proteom NMR, MS GC-MS, LC-MS, CE-MS Aplikace výzkumu metabolomu uSledování fyziologického stavu buňky uadaptace na prostředí, uodhad toxicity xenobiotika, vývoj nových léčiv upřítomnost metabolických biomarkerů ustanovení diagnózy a odhad stupně nemocí uprůběh terapie uzvýšení výtěžků fermentace, … u uCharakterizace buňky – savčí, rostlinné, mikrobiální, GMO,… u uOhodnocení kvality úrody některých rostlin u Příprava vzorku uVýznamně ovlivňuje přesnost, správnost a reprodukovatelnost výsledků uZávislost na typu buněčných struktur a extrahovaných metabolitů Zhášení buněčného metabolismu • rychlá změna teploty • rychlá změna pH Extrakce metabolitů z buňky Separace metabolitů z biomasy VZOREK • analýza • uskladnění VZOREK • analýza • uskladnění Zakoncentrování vzorku • vakuové odpařování •lyofilizace Obrázek: Hlavní kroky přípravy vzorku. Příprava vzorku uExtrakce metabolitů z biologického vzorku •Biologické vzorky obsahují tři hlavní třídy metabolitů: •metabolity rozpustné ve vodě •metabolity nerozpustné ve vodě •těkavé metabolity ®všechny tři třídy metabolitů mohou být nalezeny intra- i extracelulárně • • • u1) Extracelulární metabolity •zisk z extracelulárních médií uZachycení na koloně uOdpaření rozpouštědla – rozpuštění ve vhodném rozpouštědle uPokud vzorky těkavé – přímá analýza GC • • Příprava vzorku u2) Intracelulární metabolity •2 cesty narušení buněčných stěn: uNemechanické •Enzymatické – enzymy •Fyzikální – osmotický, teplotní šok •Chemické – chemická činidla: uKyselá extrakce – HClO4, HCl, CCl3COOH,… uBazická extrakce – NaOH, KOH uOrganickými rozpouštědly – CH3OH, C2H5OH, C2H3N, CHCl3 u uMechanické •Ultrasonikace •Superkritická fluidní extrakce (SFE) •French Press • Analytické metody Buňka Buněčný extrakt Frakce metabolitů Derivatizace MS NMR CE ESI-MS Profilování metabolitů, metabolomika Biologické tekutiny NMR, FT-IR, Raman Fingerprinting metabonomics Derivatizace Čištěná frakce metabolitů MS MS RI UV Cílená analýza metabolitů