C5720 Biochemie
18b-Metody studia nukleových kyselin
10/6/2014
1
Petr Zbořil

Obsah
•Metody studia nukleových kyselin
•Sekvenace
•PCR
10/6/2014
Petr Zbořil
2

Určení sekvence DNA
•Sekvence DNA, základní principy
ochemická (selektivní štěpení – Maxam-Gilbert)
obiochemická (syntéza, dideoxy metoda - Sanger)
•Postupná sekvenace štěpů
•Kombinace oligonukleotidů
•Další zdokonalování metod, modifikace
•Vícekanálová zařízení
•Hybridizační sondy
oFISH (fluorescence in situ hybridization)
•DNA čipy
•
•
10/6/2014
Petr Zbořil
3

Určení sekvence DNA
•Dideoxy sekvenace – nápodoba replikace
oZnačené primery (+ dNTP, DNA polymerasa, templát - ssDNA)
oDideoxy (dd)NTP – 4 nádobky (a)
oProdukty končí danou bazí = (b)
•
•
10/6/2014
Petr Zbořil
4

Určení sekvence DNA
•Dideoxy sekvenace
oElektroforesa – autoradiografie – 4 dráhy
•
10/6/2014
Petr Zbořil
5

Určení sekvence DNA
•Dideoxy sekvenace
oFluorescenční značení – odlišné pro každý ddNTP
oDideoxy (dd)NTP – 1 nádobka
oProdukty končí danou bazí  - odlišně fluoreskující
oCZE v 1 vzorku – automatizace, vícekanálové analýzy
•
•
10/6/2014
Petr Zbořil
6

PCR
•Polymerázová řetězová reakce
oOpakování replikace zkoumaného úseku
oCyklická změna T
•Komponenty
oTaq polymeráza, dNTP, primery, vzorek-templát
oTermocycler
oPotřeba primerů
•Kvantitativní PCR
oRT PCR
•Význam
oanalytický – diagnostika, forenzní analýza,
opreparativní  - pomnožení materiálu, cílené mutace, umělé geny atd.
•
10/6/2014
Petr Zbořil
7

PCR
•Schema
•Nadbytek
•reaktantů
odNTP, primery
•Střídání T – cykly
oDenaturace – ca 95
oHybridizace – ca 50
oPolymerace – ca 65
•Geometrická řada
oAnalýza produktů
•Variace
oHybridizace – vliv T
o
•
10/6/2014
Petr Zbořil
8
Geometrická řada produktu

Kvantitativní PCR
•Schéma RT PCR
oSledování fluorescencí, kvantifikace
oVyužití fluorescence, 3‘-exonukleasové aktivity Taq polymerasy
•
10/6/2014
Petr Zbořil
9

Modifikace PCR
•Využití reverzní transkriptázy
•Syntéza cDNA
•
10/6/2014
Petr Zbořil
10