Stanovení nízkomolekulárních látek
■ Klasické metody - „chemicky"
■ Levné, jednoduché
■ Enzymové metody
■ Specifita, selektivita
■ Vysoká reakční rychlost (37 oC)
■ Mírné reakční podmínky T, pH
=> automatické analyzátory
Využití enzymů jako analytických činidel
- p'
íkd
■  End-point (reakce musí být rychlá a citlivá)
■  Kineticky (většinou metoda konstantního času)
Rovnice Michaelis-Mentenové:
Km+X
V.[S] [S]«Km   V=        — = konst.[S] Km
Možnost sledování enzymové aktivity
Substrát či produkt dokážeme specificky detegovat přímo
Pokud ne, následuje druhá., (obvykle opět enzymová) detekční (indikátorová) reakce
■ Nejčastější indikátorově reakce
H202 - vzniká při reakcích oxidas (využívají k oxidaci Oj)
Substrát + 02   —í^-—   Produkt + H^ H202 + chromogen-------► barevný produkt
V klinické diagnostice nejčastěji 4-aminoantipyrin + subst. fenol => CHINONIMIN  (červený, 555 nm)
Možnost sledování enzymové aktivity
Nejčastější indikátorové reakce ■—Wajibumuf-optidaAiest 340 nm NADH, NADPH
N                CH—O—p—O—P—O—CH             ?        N
k J
^
substráty + NAD+
oxidoreduktasa (dehydrogenasa
produkt + NADH + H+
Stanovení glukosy T__ o Chemické metodv                                                 olN—\ °" l.     redukční vlastnosti monosacharidu	
2.     o-toluidinová metoda 9H3                                                   H20 ArNH2    v°  UL	CH3 [QJ H C-°H modrá (625-630 nm)
Lv-^J              T       H-C-OH	
Stanovení glukosy
Enzymové metodv
3.     hexokinasová
hexokinasa
glc
OH^--------<   OH
ATP       ADP
G6PD glc-6-P —-?—sr—*■ 6-P-glukonolakton
NAD (P)
NAD(P)H
4.     glukosadehvdroaenasová
GD
glc
"^
-»•   glukonolakton
NAD+    |NADI-f H*
Stanovení 5.     qlukosaoxidasová 1-------1        GOD		glukosy	CH2OH OhpJ--------< OH OH
|_gicji     s-^ roh e	kä-------------		
			—^-lamperometrie 1
			
amperometriel 4-aminoantipyrin			
	V_ pod   r;	inonimin	
			
	+  subst. fenol	červený (555 nm)	
Stanovení kyseliny močové
Chemická metoda
l.     Oxidace kvs.fosfowolframovou -> fosfowolframova modř (720 nm)
Enzymová metoda
2.     Urátoxidasa (urikasa)
OH
"\------N                                        "O                 ľ"2^------ľH            m       ETFTl
I     IT    II     *   °2 * H20  ---------►    XXX    *     2 * lH2°2
kys. močová
PS
Stanovení močoviny (BUN)
Chemické metody
l.     Reakce s diketonv a jejich oximv
bisacetylmonoxim
O   NOH                                             O   O
II     II                       hUO                      II     II
H3C-C-C-CH3----------í------«.   H3C-C-C-CH3    +     HNO3
H+
°                               V   V                  H+ H2N-C-NH2    +    H3C-C-C-CH3  ------------► H3C-C-C-CH3 +  2 H20
N   N
Q
II    diazin (žlutý) O
Dobře automatizovatelna, ale fotosenzitibilní, nestálá barva
Stanovení močoviny (BUN)
Enzymové metody
ureasa
NH4
2.     ureasa             urea ---------------».   co2  + 2
a) Berthelot
NH4* +  CIO"  *2(       J^OH  --------—---------►
\=J                nitroprusid                    ^-
indofenol (modrý)
b)GD
glutamátdehydrogenasa NH4++ a-ketoglutarát +InADH|+H+                                            ^   Glu + NAD+
c)ISE
Stanovení		bilirubinu
1.     Obecná metoda sulfanilovou	: kopulace s diazotovanou kys.	
HOOC	COOR	
O^N-^-CH^-N-^		+       N^N—(^)—S03H *o            cp   W
HOOC 1          >      1        (	J	COOR
O-^N-^CH-^-N-^N	=N-<0)— SCl3H      +	"«•s^O^n"   i c   i °
azopigmentA		azopigment B
=> acidobazický indikátor	H+ neutrální OH	- fialový (~ 560 nm) - Malloy-Evelyn - červený - modrý (~ 600 nm) - Jendrassik-Gröf
Stanovení bilirubinu
2.     přímá spektrofotometrie - „bilirubinometr" - 454 nm (+ 540 nm odečet Hb02) - neonatální diagnostika
3.     enzymaticky-bilirubinoxidasa (oxidace na biliverdin -405-460 nm)
koniugovanv bilirubin - „přímý", konjugovaný s kyselinou glukuronovou
nekoniugovanv bilirubin     - „nepřímý", adsorbovaný na Alb, nutno solubilizovat: kofein-benzoát sodný (Jendrassik-Gröf), DMSO, močovina, MetOH
=> kvantitativní stanovení celkového a konjugovaného bilirubinu
A-bilirubin     - kovalentně vázaný na Alb
	Stanovení	kreatininu		
i.     Jaŕfé - 1886				
	N02 * o. Al	OH            .        „ t		N02 Ä
		2	H3C	
nespecifická (interference - askorbát, pyruvát, proteiny, teplota, doba stanovení)			aceton, glc,	červený kys. močová,
=> separace kreatininu	(Lloydovo činidlo,	florid	n, HPLC)	
=> kinetické stanovení				
2.     Enzymové metody kreatininamidohydrolasa => kreatin				
kreatinin iminohydrolasa	=> N-methylhydantoin		+ NH3	
Stanovení cholesterolu
Chemické metody
modifikace Liebermann-Burchardovy metody
několikanásobná oxidace cholesterolu v prostředí HAc, H2S04,
Ac-anhydridu => tvorba nenasycených vazeb => cholestahexaen-sulfonova
kyselina - zelenomodré zbarvení
Enzymové metody (celkový, volný, esterifikovaný, HDL) cholesterolesterasa:      ChE -> Chol + FFA cholesteroloxidasa:      Cholesterol + C^ -> Cholest-4-en-3-on
HDL-cholesterol:  srážení LDL a VLDL     - heparin + Mg2+ - kys. fosfowolframová + Mg2+