1
Analýza proteinů
udržování onkotického tlaku
transport minerálů, hormonů, lipidů, katabolitů
(prealbumin, Alb, ceruloplasmin, transferin,
apoproteiny...)
obrana proti infekci (imunoglobuliny)
hemokoagulace a fibrinolysa (koagulační
faktory a faktory rozpouštějící thromby)
enzymy a inhibitory enzymů (cholinesterasa,
ceruloplasmin, inhibitory proteas)
Stanovení bílkovin
CELKOVÁ KONCENTRACE
­ (málo stavů ovlivňuje koncentraci všech bílkovin dehydratace,
převodnění, malnutrice,
většinou zvýšení či snížení jedné nebo několika málo
bílkovin)
biuretova metoda
bílkovinová chyba indikátoru
bromkresolový purpur (BCP) ­ specifický pro albumin
bromkresolová zeleň (BCG)
pH
A A
c
Alb 1 2 21 
Elektroforéza plazmatických bílkovin
prealbumin, albumin
1-globuliny: 1-antitrypsin, 1-fetoprotein, 1-lipoprotein
2-globuliny: 2-makroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin, feritin
-globuliny: transferin, C-reaktivní protein, -lipoprotein, fibrinogen
-globuliny (hl. IgG, IgA, IgM)
+
_
_
+
2
a) akutní zánět
e)hyperimunoglobulinemie
d) nefrotický syndrom
Specifické stanovení jednotlivých
bílkovin - imunochemie
Antigen ­ látka vyvolávající imunitní odpověď
Vlastnosti ­ imunogennost
­ specifičnost
antigennost
Faktory ovlivňující
vyvolání imunitní odpovědi
- chemická povaha
- velikost
(neúplný antigen = hapten)
- komplexita
- valence
- konformace, přístupnost
- cizorodost
- genetická příbuznost
epitop= antigenní determinanta
3
Protilátky (Ab) - imunoglobuliny
- proteiny vážící specificky antigen
- produkovány B lymfocyty (humorální imunita)
- v lidském těle cca 10 000 různých Ig (~ 20% plasm. bílkovin)
- glykoproteiny (4 - 18% sacharidy)
odlišnosti: specifita
AA sekvence
migrace v el. poli
funkce
Fab Fc
pepsin: (Fab)2 + Fc
papain: 2Fab + Fc
Protilátky (Ab) - imunoglobuliny
IgG: 75% sérových Ig, monomer, prochází placentou
IgM: 10% sérových Ig, pentamer, inicializuje imunitní odpověď
IgA: 15% sérových Ig,
mono a dimer,
hl. imunoglobulin sekretů
(proti lokálním infekcím)
IgD: stopová množství,
monomer, fce ???
IgE: nízké koncentrace,
snadná vazba na buňky,
alergie
Reakce antigen -protilátka
vazebné síly: elektrostatické, vodíkové, van der Waalsovy,
hydrofobní interakce
imunokomplex je stabilní v rozmezí pH 4-9
možnosti disociace: vysoké nebi nízké pH
močovina, chaotropní látky
Základní pojmy:
AFINITA: ,,míra vazebné síly mezi jednou antigenní
determinantou a protilátkou"
AVIDITA: ,,míra stability komplexu"
KŘÍŽOVÁ REAKTIVITA
SEKUNDÁRNÍ PROJEV INTERAKCE Ag.Ab = PRECIPITACE
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1 2
34
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1 2
34
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
[Ag]
nadbytek Ab nadbytek Agekvivalence
1 2
34
anti1 anti2 anti3 anti4
A
1 2
34
anti1
anti2
anti3
anti4
4 5
4 5
4
5
4
5
Křížová reaktivita ­ antiserum proti Ag
příbuzný Ag
+
Typy imunoreakcí
Ag + Ab
Ag.Ab
imunochromatografie
PRIMÁRNÍ REAKCE
SEKUNDÁRNÍ
REAKCE
Ag
AgAb
Ab
Ab
AbAg
imunohistologické metody
imunoblotting/imunofixace
imunoanalýza - EIA,RIA,FIA
precipitace aglutinace
v roztoku
(nefelometrie, turbidimetrie)
v gelu
5
,,Indicator-labelled" imunoassay
Indikátor ­ navázán na Ag nebo Ab
indikuje reakci Ag.Ab
enzym, fluorescenční sonda, radioaktivní značka, ...
E: peroxidasa, alkalická fosfatasa, glukosaoxidasa, G6PD, ..
R: 125I, 3H, 14C
F: fluorescein-isothiokyanát (FITC)
biotin-avidin
koloidní zlato, kov + elektroluminiscence
E + zesilovací systémy: chemiluminiscence, ...
vlastnosti značky: levná
vysoce purifikovaná
specifická reaktivita
(bez interferencí jinak citlivost pozadí)
detekce -ng/ml
-malá spotřeba reagencií
- rychlost stanovení
- vysoká citlivost
- reprodukovatelnost
- možnost stanovení velkého počtu vzorků najednou
homogenní ­ detekce vzniku komplexu přímo v roztoku
heterogenní ­ nutná separace vzniklého komplexu
pro závěrečná měření
EIA, RIA, FIA, ...
přímé ­ značená primární protilátka či antigen
nepřímé ­ využití sekundární protilátky pro detekci
snížení katalytické aktivity znovuobnovení
katalytické aktivity
reakce Ag.Ab způsobuje změnu v katalytické aktivitě enzymu
vázaného na antigen ­ především pro stanovení haptenů
Homogenní EIA
T4
6
přímá
Heterogenní EIA ­ ELISA (enzyme linked imunosorbent assay)
nepřímá
1. jednoduchá
1. vazba různého množství
antigenu ve vzorku
2. vazba std množství Ab
(rabbit anti Ag)
(3. vazba druhé protilátky)
(swine anti rabbit Ig)
4. detekce ,,navázané" enzymové aktivity
S
P
S
P
S
P
S
P
přímá
nepřímá
2. dvojitá sendvičová ELISA
4. detekce ,,navázané" enzymové aktivity
S
P
S
P
S
P
S
P
1. Std. množství Ab
rabbit anti Ag
2. Vzorek (Ag)
3. vazba std
množství Ab
(rabbit anti Ag)
(4. vazba druhé protilátky)
(swine anti rabbit Ig)
3. kompetitivní ELISA ­ ,,nepřímá detekce antigenu"
4. detekce ,,navázané" enzymové aktivity
S
P
S
P
1. std. množství Ab (Ag)
2. Vzorek (Ag)
+ std. množství
značeného Ag (Ab)
7
Imunodifúzní metody
Jednoduchá radiální imunodifúze
Ab
[Ag]
48 ­ 72 h : [Ag] ~ d
6 ­ 24 h : [Ag] ~ log d
citlivost 0.02 mg/ml
Kvantifikace IgG, IgM, IgA, IgD,
albumin, ...
Dvojitá radiální imunodifúze (Ouchterlony 1949)
Ab Ag
Pouze kvalitativní důkaz přítomnosti Ag
REAKCE IDENTITY
Mr...zakřivení precipitačního obloučku
koncentrace ... vzdálenost od jamky
Jednoduchá imunodifúze (Oudin 1946)
Ag
gel+Ab
Imunodifúzní metody
Klasická imunoelektroforéza
1. elektroforéza bílkovin
krevního séra
2. imunodifúze
Raketová imunoelektroforéza
[Ag] NV
Kvantifikace Ag
Aglutinační metody (IgM >> IgG)
Přímá aglutinace ­ detekce antigenů na povrchu Ery, mikrobů, ...
stanovení krevních skupin, infekce Brucella, Salmonella, ...
+
Nepřímá aglutinace ­ Ag vázany na nosič ­ latex, Ery, ...
+ +
Inhibice aglutinace ­ detekce a kcantifikace Ag
+ +