STANOVENI KATALYTICKÉ KONCENTRACE ENZYMŮ Enzymy • Biokatalyzátory • Snižují aktivačni energii potřebnou pro chemickou reakci • V klinické biochemii se enzymy použivaji: ► pro diagnostické účely ► jako reagencie Názvosloví ► triviální / historické TRYPSIN ► obecně užívané a-AMYLASA (AMS) ► vědecké 1,4-a-D-glukanglukanohydrolasa EC 3.2.1.1. ► faktory ovlivňující enzymovou reakci: TEPLOTA, pH, koncentrace SUBSTRÁTU, koE,... často se volí kompromis mezi optimálními podmínkami, cenou, technickými požadavky Enzymy - stanovení Rovnice Michaelis-Mentenové: [S]»>Km V =Vlim Ideálně: [S] > 100 Km cena, rozpustnost, inhibice nadbytkem substrátu, Enzymy - stanovení 1) Dvoubodové stanovení („metoda zastaveného času ") fotometrické sledování změny absorbance (přírůstek produktu nebo úbytek substrátu) za časovou jednotku (nevíme, co se v reakční směsi děje!), většinou v daném čase zastavujeme enzymovou reakci (např. denaturace a kolorimetrické vybarvení produktů) AA/At = "2 "1 t2-tl A1; tj většinou rovny 0 (počátek) Enzymy - stanovení 1) Dvoubodové stanovení („metoda zastaveného času ") fotometrické sledování změny absorbance (A) za časovou jednotku 2) „ KINETICKÁ" stanovení („metoda tangent") fotometrické sledování tvorby produktu nebo úbytku substrátu v čase (dA/dt) podmínka: ► konstantní rychlost (kinetika O.řádu) ► vždy kontrolovat průběh reakce ! U rychlost reakce «3m;iaia.ij-M.i.iji.i.ii.k-tj=ťi=i..i.i!=L-n L^src ♦ ♦ ♦ IfcIUA • 1 * 2ULLL K K K 1E6JL t i i tam ■*-*-* urm + ++11TB lit AST Reaction Profile ■'.';.""■■.■. í .'■■:■: ■ nu hid n* i " • O I ; ;..... _£_ ■ Enzymy - stanovení 2) „ KINETICKÉ" testy nejčastěji fotometrické s využitím ► optického testu (Warburgův) fNADH + H+) 340 nm ► chinoniminové reakce (křenová peroxidasa) POD H202 + 4-aminoantipyrin + subst. fenol -> chinonimin (červený, 555 nm) KATALYTICKÁ KONCENTRACE ENZYMU (tkat/l (dříve, ale ještě např. v Německu, USA U/l) 1 ukat/l = 60 U/l 1.2 A" - NAD 1.0 /V. 0.3 # «1 - NADH s i G.-Q í J O.309------f—^T — 0.315 0.2 | V^ X 0,170 260 300 .'339 1 334 365 Wellenlänge 400 nm Enzymy - stanovení 1 a 2) „ KINETICKÉ" a „dvoubodové" metody fotometrické sledování časové změny absorbance (A) t.j. rychlost reakce jednotky Llkat/I 3) IMUNOCHEMICKÉ metody stanovujeme hmotnostní koncentraci enzymu jednotky Lig/l ALT Klinický význam: •onemocnění jater (akutní virová hepatitída) •onemocnění žlučových cest •dekompenzovane srdeční vady (venostasa v játrech) Je obsažena v cytoplasme všech buněk ( zvláště hepatocytů) ALT • L-alanin + 2-oxoglutarát --> pyruvát + L-glutamát • pyruvát + NADH + H* -> L-laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H* -> L-laktát + NAD+ endogenní • pyridoxal-5-fosfát + ApoALT --> ALT* • doporučuje se předinkubace 10 min při +37°C • start: 2-oxoglutarát (2 činidlová metoda) • start: sérum (1 činidlová metoda) • kalibrace: enzymový kalibrátor nebo teoretický faktor AST Klinický, význam: • onemocnění myokardu (nekróza, AIM) • onemocnění kosterního svalstva • j aterní choroby Je obsažena v cytoplasmě(30%) a v mitochondriích(70%) všech buněk (zvláště hepatocytů,buněk srdečního svalu ledvin a kosterních svalů) AST L-aspartát + 2-oxoglutarát --> oxalacetát + L-glutamát oxalacetát + NADH + H* --> L-malát + NAD+ pyruvát + NADH + H* -> L-laktát + NAD+ endogenní • pyridoxal-5-fosfát + ApoAST -> AST* doporučuje se předinkubace 10 min při +37°C start: 2-oxoglutarát (2 činidlová metoda) start: sérum (1 činidlová metoda) kalibrace: enzymový kalibrátor nebo teoretický faktor LD Klinický význam: • onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu) • onemocnění svalů • další choroby (hemolytická anémie, leukémie, onemocnění jaterního parenchymu,.. .herno lýza) LD je cytoplasmatický enzym, katalyzuje reakci anaerobní glykolýzy, to vysvětluje nález LD prakticky ve všech tkáních. LD pyruvát + NADH + H+ -> L-laktát + NAD+ Je to TETRAMER skládající se ze 2 podjednotek: M (muscle) H (heart) Kombinací vzn ká 5 isoenzvmů :LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 H4 H3M H2M2 HM3 M4 Izoenzymy LD Elektroforeticky: DETEKCE l-laktát + NAD+ -> pyruvát + NADH + H+ NADH + H+ + tetrazoliová sůl -> NAD+ + FORMAZAN NBTJNT nerozpustný Rozdílná substrátová specifita: HBD 2-OXOBUTYRÁT + NADH + H* -> 2-HYDROXYBURYRÁT+NAD+ CK Klinický, význam: •onemocnění kosterního svalstva •onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu) CK KREATINFOSFÁT + ADP --> KREATIN + ATP ATP + D-GLUKOSA ->ADP +D-GLUK0S0-6-F0SFÁT D-GLU-6-P + NADP+ --> D-GLUK0NÁT-6-P+NADPH+H! REAKTIVACE: doporučuje se N-ACETYL CYSTEIN (NAC) Je to DIMER skládající se ze 2 podjednotek: M (muscle) B (brain) Kombinací vznikají 3 izoenzymy : CK-MM, CK-MB, CK-BB CK- makro CK-MB mass (hmotnostní koncentrace) IMUNOCHEMICKY ISOFORMY isoenzymů CK-MM a CK-MB • 2 lysiny CKMM3 • 1 lysin CKMM2 • 0 lysin CKMM • 1 lysin CKMB2 • 0 lysin CKMB1 • myokard • karboxypeptidasa What are CK-MB Isoforms? ■ ■ - ■ IB w lili Two CK subunits, M and B, combine to íorm the CK isoenzymes: MM. ti6 and SB. Two CK-MB isorormsh variants of CK-MBl have been detected; MS? and MB-, In AMF, CK-MB?, cht ti*4LiŮ ŔM*rv>. is i"ůlůai&el IfKO CifCufACian from eh« damaged heart and Is converted to ME. by c a ■' boxy pep c idnse- N. Izoenzymy CK CK-MM M M +ANTI-M M M CK-MB M B M B CK-BB B B B B Předpoklad: Potom: CK-BB v séru nepřítomen (=0) CK-B x 2 = CK-MB ALP Klinický, význam: •onemocnění j ater •onemocnění žlučových cest •onemocnění kostí •fyziologicky zvýšené hodnoty: děti a ženy (3 trimestr těhotenství) V séru dospělých zdravých osob převažují latěmi isoenzvmv. u zdravých dětí kostní isoenzvm. u těhotných žen placentami isoenzvm a u osob s krevní skupinou 0 a B stopy střevního isoenzymů. ALP monoestery kyseliny o-fosforečné + H20 t alkohol /fenol + fosforečnan 4-NITROFENYLFOSFÁT + H20-> 4-NITR0FEN0L+ fosforečnan ALP a izoenzymy METODY • N-methyl-D-glucamin (MEG) (v ČR stand.metoda) • 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP) (IFCC metoda) • Diethanolamin (DGKC) • IMUNOCHEMICKY (kostní izoenzym) • ELEKTROFORÉZA • INAKTIVAČNĚ - INHIBIČNÍ metody • srážení LEKTINEM (kostní izoenzym) ALP v rozpuštěných lyofilizátech je nutné reaktivovat ( 2h při lab.teplotě) GMT Klinický, význam: • onemocnění jater • obstrukce žlučových cest • sekundární nádory jater • monitorování chronického alkoholismu GMT je vázána na cytoplasmatické membrány. V krvi dokazatelný enzym je jen jaterního původu. GMT/GGT Katalyzuje prenos y-qlutamylového zbytku z Y-glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid nebo aminokyselina) METODY 7-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitranilid(GLUCANE) •y-L-glutamyl-4-nitranilid (GLU-4-NA) GLUCANE + Glygly -> GLU-Glygly +5-A-2NB 5-AMINO-2-NITROBENZOÁT GLU-4-NA + Glygly -> GLU-Glygly + 4-NA 4-NITROANILID AMS Klinický, význam: •onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida, 5-12h) •onemocnění slinných žláz (parotitis) •přítomnost makroamylasového komplexu MAKROAMYLASOVY komplex = komplexy glykosylovaných isoenzymu s imunoglobuliny a jinými bílkovinami v séru Mr = 400 000 až 2 000 000 •AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem, slinnými žlázami, část vzniká v játrech, plicích. Sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou koncentraci pankreatického a slinného izoenzymu. _____________________AMS___________________ • POLYSACHARIDY-> OLIGOSACHARIDY~> MALTOSA štěpí ot-1,4 glykosidické vazby • METODY • AMYLOKLASTICKÉ ŠKROB -> OLIGOSACHARIDY -> MALTOSA + roztok jodu modré zbarvení • CHROMOLYTICKÉ Substrát = nerozpustný škrob s kovalentně vázaným barvivem AMS s MOLEKULÁRNĚ DEFINOVANÝMI SUBSTRÁTY ► substráty značené 4-nitrofenolem na konci definovaného oligosacharidu a-glukosidasa Maltosa + H20 -> 2 Glc ► metoda I FCC 1 molekula 4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)-a -(1,4)-D-maltoheptaosidu 7 molekul glukosy +1 molekula 4-nitrofenolu ► 2-chloro-4-nitrofenyl-a-D-maltotriosid LPS Klinický, význam: •detekce a vyloučení akutní pankreatitidy •chronická pankreatitida (relapsující) •obstrukce pankreatického traktu LPS TRI- a DIACYLGLYROLY + H20 -> GLYCEROL + 3-,2 MK METODY • TITRAČNÍ (stanovení MK) • TURBIDIMETRICKÉ (snížení zákalu) • „fotometrické" (stanovení glycerolu) GLYCEROL + ATP -> GLYCEROL-3-FOSFÁT + ADP Glycerol-3-fosfát+ 02--> dihydroxyacetonfosfát + H202 2H202 + 4-AAP + deriv.fenolu -> 4H20 + barevný derivát micelární komplexy „nerozpustný substrát-kolipasa- žlučová kyselina (pH 9) poznámka: LPS pankreatická a jaterní, lipoproteinová LPS ACP Klinický, význam: • onemocnění prostaty (karcinom) • některá kostní onemocnění (tumory a metastasy) • chronická ledvinná nedostatečnost •V séru lze dokázat prostatický a kostní isoenzym, dále malé množství jaterního, erytrocytárního a trombocvtárního isoenzvmu. ACP není v séru/plazmě stabilní ! ACPPje pro dg.ca prostaty nahrazováno imunochemickým stanovením PSA ACP METODY • pH < 7,0 • 4-NITROFENYLFOSFÁT + H20-> 4-NITROFENOL+ fosforečnan • 1-NAFTYLFOSFÁT + H20~> 1-NAFTOL + fosforečnan 1-NAFTOL + diazoniová sůl --> azobarvivo • detekce prostatického izoenzymu: ACP - ACP inhibovaná vínanem CHE Klinický, význam: CHE vzniká v ribosomech jaterních buněk a je secernována do krve. Patologické je především snížení aktivity. •poruchy proteosyntézy těžké hepatopatie hladovění organismu •intoxikace organofosfáty nekompetitivní inhibitory •vrozené deficity, atypické varianty CHE estery CHOLINU + H20 --> CHOLIN + příslušná kyselina Sérum / plazma •ACETYLCHOUNESTERASA (substrát: acetylcholin) je obsažena v Ery, mozku •PSEUDOCHOLINESTERASA pochází z ribosomů jaterních buněk thioestery cholinu + H20 -> thiocholin + butyrát thiocholin+DTNB ~>5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina DTNB=kyselina 5,5'dithio-bis-nitrobenzoová žlutá Enzymy v moči 1. NAG (N-acetyl-beta-glukosaminidasa) TUBULÁRNÍ postižení LEDVIN 2. GMT