MINIATURIZACE
&
AUTOMATIZACE
dva nejdůležitější trendy v analytických separačních metodách
Vladislav Kahle
Ústav analytické chemie AV ČR
Veveří 97, 61142 Brno
Separační metody v analytické chemii
Chromatografické: plynová chromatografie (GC, CGC)
kapalinová chromatografie (HPLC)
Elektromigrační: elektroforéza (CE)
izoelektrická fokusace (CIEF)
elektrochromatografie (CEC)
Instrumentace
LC
CGC CE
Příklady separací (GC, LC, CE)
Kapilární plynová chromatografie PCBs
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie PEGs
Kapilární elektroforéza nukleotidů
Kapilární elektroforéza DNA
20 min.
3 min.
12 min.
120 min.
Doba vlastní separace
MINIATURIZACE
Doba předběžných operací
(příprava vzorku, dávkování,
kondicionování kolony…..)
AUTOMATIZACE
Celková doba analýzy
a její zkrácení pomocí automatizace a miniaturizace
Kritéria výkonnosti:
preparativní metody: výkon = m/t (hmotnost za jednotku času)
……………………………………………………………………………………
analytické metody: množství analytické informace
za jednotku času
Jeden nebo více píků? - fingerprint – koncentrace hledaných látek ve vzorku
výkon = N/t (počet teoretických pater za jednotku času)
H = σ2/L
H – výška teoretického patra
σ – standardní odchylka
σ2 – variance Gaussovy křivky
L – délka kolony
Vysoká účinnost = vysoký počet teoretických pater (N) = malé rozmývání zón
N = L/H = (L/σ)2
……………………………………………………………………………………..
Jak může ovlivnit miniaturizace účinnost kolony?
CE – teoretický limit maximální účinnosti: Einstein σ2 = 2Dt
D – difuzní koeficient, t – čas
žádáme vysoký výkon (N/t) – zvýšení rychlosti pomocí vysokých hodnot E (U/L) [V/cm]
to však vede k vyššímu proudu a nutnosti dissipace Jouleova tepla
Kritický je průměr kolony – používají se křemenné kolony o vnitřním průměru 25 – 75 µm
Lze miniaturizovat i délku – užívá se u fluidních mikročipů
CGC – Golay H = 2D/u + d2u/D u – rychlost, d – vnitřní průměr kolony
na separaci se podstatně podílí i pohyb molekul kolmý k ose kolony (rozdělovací rovnováha)
účinnost silně ovlivňována vnitřním průměrem kolony zvláště při vyšších rychlostech
pro vysoký výkon (N/t) se používají křemenné kolony o vnitřním průměru ~200µm
další zmenšení průměru (a snížení tloušťky filmu stacionární fáze) vede při vyšších rychlostech
k podstatnému zvýšení N/t
………………………………………………………………………………………………
HPLC – van Deemter H = A + B/u + Cu (C = d2/D)
A, B, C – konstanty, u – rychlost, d – průměr částic sorbentu
na separaci se podstatně podílí i pohyb molekul kolmý k ose kolony (rozdělovací rovnováha)
účinnost silně ovlivňována průměrem částic sorbentu zvláště při vyšších rychlostech
pro vysoký výkon (N/t) se používají silikagelové sorbenty o průměru částic 3-5 µm
další zmenšení průměru částic (UPLC) při využití vyšších rychlostí vede k podstatnému
zvýšení N/t
Rozměry kolony (4 mm x 150-250 mm délka) přitom mohou zůstat zachovány, nebo zmenšeny
Mimokolonové příspěvky
k rozmytí separovaných zón
σ2
tot = σ2
col + σ2
ex (variance: celková, kolonová, mimokolonová)
Mimokolonové příspěvky k rozmývání zón snižují účinnost separace a tedy i její výkon.
Jsou způsobeny např. nadměrným objemem dávkovaného vzorku, rozmýváním ve
spojovacích kapilárách (HPLC), velkým objemem detekční cely, časovou
konstantou záznamového zařízení atd.
ZÁVĚRY
• miniaturizace a automatizace jsou dva nejdůležitější trendy v
analytických separačních metodách
• miniaturizace je výsledkem pochopení procesů, ke kterým dochází v
průběhu separace a jejím cílem je zvýšení výkonu jednotlivých
separačních technik
• automatizace umožňuje vysoce reprodukovatelné řízení
separačního procesu bez potřeby lidské obsluhy