středa 3. prosince 14
Analytické systémy v
metabolomice
středa 3. prosince 14
Biologicky aktivní látky
středa 3. prosince 14
Fenolovékyseliny
Flavonoidy
Proanthocyanidiny
Stilbeny
Lignany
Lignin
C6-C1
C6-C2
C6-C3-C6
C6-C2-C6
(C6-C3-C6)n
(C6-C3)2
(C6-C3)n
Přírodní látky
primární metabolity sekundární metabolity
Lipidy
Sacharidy
Proteiny
Aminokyseliny
Terpenoidy
Alkaloidy
Fenylpropanoidy
AAspec,polyketidyatd.
Nukleovékyseliny
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
CO
COOCH3
O
CH3N
OCH3
OCH3
H3CO
H3CO
CH2
N
N
N
O
O
N CH3
HO
HO
O
H3CO
H3CO
H3CO
OCH3
NHCOCH3
O
N
N
HO
H
C
CH CH2
CH3O
N+
CH3O
O
OCH3
O
CH3
Cl-
chinin
chelerytrin
kolchycin
papaverin
kokain
strychnin
morfin
HO
HO
OH
HO O
O
HO
HO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
OH
OH
OH
HO
MeO
OMe
O
OOH
HO
OH
O
OOH
HO
OH
O
OOH
HO
OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
COOH
OH
O
OH
HO
OH
OH
+
středa 3. prosince 14
0
25
50
75
100
Vážení
Měření pH
Filtrace
Rozpouštění,ředění
Kolonová chromatografie
Odpařování
Sonikace
Centrifugace
SPE
LLE
Ohřívání
Mletí
Míchání
Homogenizace
Soxhletova extrakce
Lyofilizace
Ultrafiltrace
Dialýza
Extrakce urychleným tokem rozpouštědla
Mikrovlnná extrakce
Extrakce nadkritickou tekutinou
Metody přípravy vzorků
středa 3. prosince 14
Předúprava vzorku
homogenizace
centrifugace
lyofilizace filtrace
sušení
extrakce
sonikace
SFE MSPD
extrakce
rozpouštědlemMAE
Mletí
ASE
Soxhlet
SPME
Přečištění- izolace
SPE
MSPD
CCC
Kolonová
chromatografie
gelová permeační
chromatografie
Afinitní
chromatografie
TLC -
HPTLC
Instrumentální
analýza
LC GC
ostataní
techniky
HPLC
UHPLC
HPTLC
UV-Vis
DAD
FLD
RI
ELSD
MS
MS/MS
MSn
FID
ECD
MS/MS
MS
CE MS MS/MS
FL UV NMR
LC GC
ostatní techniky
Strategie stanovení přírodních látek
2D
UHPLC
středa 3. prosince 14
Soxhletova modifikovaná
metoda
Extrakce nadkritickou
tekutinou
tlaková extrakce
rozpouštědlem
Mikrovlnná extrakce
Extrakce stlačenou
horkou vodou
Moderní extrakční metody
středa 3. prosince 14
tlaková extrakce
rozpouštědlem
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
extrakční cely
vzorek+matrix
vzorek
zabalen ve
filtračním
papíře
matrix
středa 3. prosince 14
Tlaková extrakce rozpouštědlem
Extrakce isoflavonů
0
25
50
75
100
Daidzin Genistin Daidzein Genistein
Srovnání extračních technik
Soxhlet Sonikace ASE ASE + sonikace
Optimalizace ASE + sonikace
Optimalizace sonikace
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,2 0.6 1,2 2,4 5
Daidzin Genistin
Daidzein Genistein
plochapíku(%)
čas (min)
0%
25%
50%
75%
100%
1 2 3
Daidzin Genistin
Optimalizace počtu cyklů
plochapíku(%)
počet cyklů
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
50 60 70 80 90 100
Daidzin Genistin
plochapíku(%)
methanol (%)
Daidzin Genistin
0%
25%
50%
75%
100%
13 14 15
Daidzin Genistin
plochapíku(%)
tlak kPa
Optimalizace tlaku
Optimalizace solventu a teploty
23%
36%
49%
62%
74%
87%
100%
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
plochapíku(%)
teplota (°C)
Isoflavony:
tlak: 15 MPa, teplota 135°C,
dynamická extrakce:
počet cyklů: 3, čas: 3x5 min,
solvent: MeOH (90% v/v)
relativníodezva
středa 3. prosince 14
Extrakce nadkritickou
tekutinou
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
Hexan
Isooktan
Heptan
Cyklohexan
Toluen
Benzen
Methylen chlorid
Tetrahydrofuran
Ethylacetát
Isopropanol
Chloroform
Ethanol
Aceton
Acetonitril
Methanol
Voda
0 2 3 5 6 8 9
Index polarity(P‛)
polárnínepolární
Ektrakční cely
in situ on-line ventil
Extrakce polárních látek
Polarity
Polarity
středa 3. prosince 14
Účinnost extrakce polárních analytů
Biochanin A
Formononetin
Sissotrin
Glycitein
Daidzein
Ononin
Genistin
Glycitin
Daidzin
0% 25% 50% 75% 100%
Biochanin A
Formononetin
Sissotrin
Glycitein
Daidzein
Ononin
Genistin
Glycitin
Daidzin
0% 25% 50% 75% 100%
SFE isoflavony A in situ
SFE isoflavony B in situ + on-line
Extrakce isoflavonů
Isoflavony:
tlak: 30 MPa, teplota 38°C, čas: 30 min,
modifikátor: MeOH/H2O (14:1 v/v):
300 μl in situ + 500 μl on-line
Extrakce imidazolů z kávy
Imidazoly A:
tlak: 40 MPa, teplota 150°C, čas: 45 min,
modifikátor: MeOH/H2O (5:1 v/v):
200 μl in situ + 500 μl on-line
4 MeI
THI
0% 35% 70% 105%
101,30%
89,40%
SFE imidazoly A
4 MeI
THI
0% 26% 53% 79% 105%
86,90%
98,90%
SFE imidazoly B
Imidazoly B:
tlak: 40 MPa, teplota 150°C, čas: 45 min,
modifikátor: MeOH/H2O (9:1 v/v):
200 μl in situ + 500 μl on-line
středa 3. prosince 14
Účinnost extrakce polárních analytů
Extrakce volných aminokyselin z půdních vzorků
Aminokyseliny:
tlak: 15 MPa, teplota 50°C, čas: 30 min,
modifikátor: H2O: 750 μl on-line
entrainer pro modelové vzorky: 750 μl HCl in situ
0%
26%
53%
79%
105%
ASP GLU SER HIS GLY THR ARG ALA TYR CY2 VAL MET PHE ILE LEU LYS
50°C 15 MPa 750 μl HCl 750 μl H2O
Extrakce alkaloidů z krevní plazmy
Chelerythrin a dihydrochelerythrin:
tlak: 10 MPa, (15 MPa z krevní plazmy) teplota 35°C, čas: 20 min,
modifikátor: MeOH/H2O: 1:1 (v/v) 500 μl in situ + 500 μl on-line Dihydrochelerythrin
Chelerythrin
0% 25% 50% 75% 100%
95,13%
80,97%
SFE chelerythrin, dihydrochelerythrin (krevní plazma)
středa 3. prosince 14
Extrakce pevnou fází
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
Biochanin A
Formononetin
Genistein
Daidzein
0% 25% 50% 75% 100%
41,0%
50,0%
55,0%
40,0%
87,0%
91,0%
94,0%
86,0%
C8 kondicionace
C8 bez kondicionace
Biochanin A
Formononetin
Genistein
Daidzein
0% 25% 50% 75% 100%
34,0%
42,0%
49,0%
66,0%
86,0%
88,0%
89,0%
91,0%
C18 kondicionace
C18 bez kondicionace
Biochanin A
Formononetin
Genistein
Daidzein
0% 25% 49% 74% 98%
90,0%
92,0%
93,0%
89,0%
92,0%
91,0%
98,0%
95,0%
SPE Amide2 kondicionace
SPE Amide2 bez kondicionace
Biochanin A
Formononetin
Genistein
Daidzein
0% 26% 53% 79% 105%
85,0%
98,0%
102,0%
94,0%
97,0%
98,0%
94,0%
93,0%
SPE RP 105 kondicionace
SPE RP 105 bez kondicionace
Biochanin A
Formononetin
Genistein
Daidzein
0% 26% 53% 79% 105%
90,0%
92,0%
90,0%
89,0%
98,0%
101,0%
100,0%
102,0%
SPE ABN kondicionace
SPE ABN bez kondicionace
Nenakondiciovaný sorbent
Kondiciovaný sorbent
C8
C18
C8 C18
středa 3. prosince 14
0%
25%
49%
74%
0%
25%
50%
75%
87%
73%
středa 3. prosince 14
0%
25%
49%
74%
0%
25%
50%
75%
87%
73%
0%
25%
50%
75%
100%
73%
87%
THI 4MEI
0%
25%
49%
74%
98%
92%
98%
THI 4MEI
SROVNÁNÍ SPE SCX A SPE SPEC DISC SCX
SEPARACE NEUROTOXINŮ
SPE SCX
Kondicionace: 1000μl MetOH
1000μl H2O
Vzorek: 3000μl
Promytí: 1000μl MetOH
Eluce: 3000μl MetOH+5M HCl
SPE SCX DISC
Kondicionace: 100μl MetOH
100μl H2O
Vzorek: 300μl
Promytí: 100μl MetOH
Eluce: 100μl MetOH+5M HCl
SPE SCX SPE SCX DISC
středa 3. prosince 14
Extrakce MIP, MSDP, Querchers
středa 3. prosince 14
Extrakce MIP, MSPD, Querchers
Extrakce MIP polymery (Molecular imprinted polymers)
Nanesení vzorku promytí Eluce
Crosslinker Funkční monomer
Formování
imprintingové dutiny
Polymerizací
Selektivní
interakce
Odstranění
templátu
srážení proteinů
LLE
Hydrofobní SPE
Cílená LLE
C18-C2 Silica SPE
Mix-Mod SPE
MIP SPE
Relativní selektivita Prep technik
Neselektivní
Vysoce selektivní
Surový extrakt
Přečištěný extrakt (nízký LOD,LOQ)
středa 3. prosince 14
Extrakce MIP, MSDP, Querchers
Vzorek
1
SPE sorbent
(C18, MIX-MOD)
4
MSDP - Matrix Solid Phase Dispersion
Třecí
miska
Směs
vzorek
sorbnt
Spe
Kolonka
Eluce
Spe
Kolonka
Naplnění
tlakem
Porušení membrán mechanickými a hydrofóbními silami (uvolnění lipidů atd.
Pevná fáze rozpouští a disperguje složky vzorku (nepolární složky k C18,
polární k -OH
Velká styčná plocha
Samotná matrice se stává novou sorpční fází ovlivňující proces
analyty se eluují ve frakcích neodpovídajících pouze systému analyt-čistá
pevná fáze-zvolené rozpouštědlo
Rozetření vzorku se sorbentem (vzorek: C18 1:4)
středa 3. prosince 14
Counts vs. Acquisition Time (min)!
3!
x10!
1!
2!
3!
1! 2! 3! 4!
-ESI MRM (353.0 -> 191.0)!
3!
x10!
1!
2!
3!
1! 2! 3! 4!
-ESI MRM (353.0 -> 191.0)!
3!
x10!
1!
2!
3!
1! 2! 3! 4!
-ESI MRM (353.0 -> 191.0)!
3!
x10!
1!
2!
3!
1! 2! 3! 4!
-ESI MRM (353.0 -> 191.0)!
-ESI MRM (137.0 -> 93.0)!3!x10!
1!
2!
3!
4!
5!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1! 2! 3! 4!
3!x10!
1!
2!
3!
4!
5!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1! 2! 3! 4!
3!x10!
1!
2!
3!
4!
5!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1! 2! 3! 4!
3!x10!
1!
2!
3!
4!
5!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1! 2! 3! 4!
-ESI MRM (137.0 -> 93.0)!
-ESI MRM (137.0 -> 93.0)!
-ESI MRM (137.0 -> 93.0)!
4
x10!
0.1!
0.5!
1.0!
-ESI TIC MRM F1!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1 2 3 4
3
x10!
1
2
3
4
5
6
-ESI TIC MRM F2 !
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1 2 3 4
4
x10!
0.1!
0.5!
1.0!
-ESI TIC MRM F 3 !
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1 2 3 4
3!x10!
1.0!
2.0!
3.0!
3.6!
-ESI TIC MRM F4!
Counts vs. Acquisition Time (min)!
1 2 3 4
GAL
PRO
3,4 DHBALD
pOH
CHLOR
VAN
POHALD
CAF
SYR
VANILIN
PCUM
SAL
FER
SIN
0 500 1000 1500 2000 2500
μElute MCX versus MCX 3cc (UAPLE extrakce)
Cystos μElute MCX Cystos MCX 3cc
SPE:
1. Condition: 500μl MeOH
2. Condition: 500μl water
3. Load sample: 1000μl
4. Wash: 500μl 5%MeOH with 2% acetic acid
5. Elution: 4x1000μl (5%, 10%, 15%, 20% MeOH
(v/v) with 2% NH4OH)
μElution plate:
1. Condition: 50μl MeOH
2. Condition: 50μl water
3. Load sample: 500μl
4. Wash: 20μl 5%MeOH with 2% acetic acid
5. Elution: 4x20μl (5%, 10%, 15%, 20% MeOH
(v/v) with 2% NH4OH)
Extrakční kombinované metody UAPLEμSPE: frakce řasy Cystoseira abies
GAL
3,4DHBALD
CHLOR
POHALD
SYR
PCUM
FER
0 250 500 750 1000
GAL
3,4 DHBALD
CHLOR
POALD
SYR
PCUM
FER
0 300 600 900 1200
GAL
3,4 DHBALD
CHLOR
POHALD
SYR
PCUM
FER
0 250 500 750 1000
GAL
3,4 DHBALD
CHLOR
POHALD
SYR
PCUM
FER
0 750 1500 2250 3000
Srovnání extrakčních technik
1. Fractions free acids
2. Fractions soluble esters
3. Fractions glycosides
4. Fractions insolubles esters
UA PLE μ SPE MS/MS
středa 3. prosince 14
Chromatografie
středa 3. prosince 14
Chromatografie neurotoxinů
středa 3. prosince 14
středa 3. prosince 14
Strategie separace imidazolů
4 MeI
THI
0 1,9 3,8 5,7 7,6
7,00
7,60
pKa THI, 4 MeI
pKa
Vlastnosti imidazolů
Imidazoly:
vysoce polární analyty
silně bazické
2-acetyl-4(5)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-imidazol 4(5)-methylimidazol
středa 3. prosince 14
Optimalizace chromatografických podmínek
Výběr chromatografické kolony: jednoduchý endcaping
dvojtý endacping
trojtý endacping
endcaping s vloženou polární skupinou
Volba mobilní fáze: vodná fáze: H2O, kys. octová, mravenčí, mravenčan
(sodný, draselný,amonný), octan (sodný, draselný,
amonný), amoniak
organická fáze: methanol, acetonitril
Hmotnostní detekce
Polaris C18
Extend C18
XDB C18
XDB C8
0 1 2 3 4
2,3
2,1
3,8
1,2
1,3
1,3
1,3
1,1
THI 4 MeI
Parametry LC a MS
Symetrie píků
0
25
50
75
100
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
THI 4 MeI
Vliv průtokové rychlosti na
relativní citlivosti MS signálu
ml.min-1USP faktor
0
100
200
300
400
20 40 60 80 100
THI 4 MeI
Vliv fragmentačního
napětí na citlivosti MS
signálu
[eV]
středa 3. prosince 14
Optimalizace chromatografických podmínek
Výběr chromatografické kolony: jednoduchý endcaping
dvojtý endacping
trojtý endacping
endcaping s vloženou polární skupinou
Volba mobilní fáze: vodná fáze: H2O, kys. octová, mravenčí, mravenčan
(sodný, draselný,amonný), octan (sodný, draselný,
amonný), amoniak
organická fáze: methanol, acetonitril
Hmotnostní detekce
Polaris C18
Extend C18
XDB C18
XDB C8
0 1 2 3 4
2,3
2,1
3,8
1,2
1,3
1,3
1,3
1,1
THI 4 MeI
Parametry LC a MS
Symetrie píků
0
25
50
75
100
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
THI 4 MeI
Vliv průtokové rychlosti na
relativní citlivosti MS signálu
ml.min-1USP faktor
0
100
200
300
400
20 40 60 80 100
THI 4 MeI
Vliv fragmentačního
napětí na citlivosti MS
signálu
[eV]
středa 3. prosince 14
Polaris C18
Extend C18
XDB C18
XDB C8
0 1 2 3 4
2,3
2,1
3,8
1,2
1,3
1,3
1,3
1,1
THI 4 MeI
Symetrie píků
USP faktor
Hmotnostní detekce
0
100
200
300
400
20 40 60 80 100
THI 4 MeI
Vliv fragmentačního napětí
na citlivosti MS signálu
[eV]
Chromatografie imidazolů test reverzních fází
endcaping s vloženou polární skupinou endcaping pomocí propylénových můstků
dvojtý endcaping
středa 3. prosince 14
0%
25%
50%
75%
100%
2%
98%
0.005M NH4OH ACN
reverzní fáze
0%
25%
50%
75%
100%
80%
20%
0.01M mrav.am. MET
Hilic
Hydrofilní interakční chromatografie
0 2 4 6 8 10
Hilic reverzní fáze
pH
LOD reverzní fáze 3 pg THI 1pg 4 MeI
LOD HILIC 2 pg THI 1.5 pg 4 MeI
středa 3. prosince 14
THI 4 MeI
káva μg.g-1
Marila 0.004 1.05
Jihlavanka 0.003 0.72
Brazil 0.052 0.60
Mexico 0.033 0.39
Haity 0.006 1.38
Vitmelta 0.069 2.05
černé pivo ng.ml-1
Samson 9.40 3.69
Staropramen 7.47 10.51
Krušovice 3.45 3.81
Bernard 12.28 12.70
Guines 3.24 4.05
Velkopop.kozel 13.19 1.58
Starobrno 8.93 28.03
Chromatografie imidazolů reálné vzorky
Limit toxicity: 10 mg THI 200 mg 4 MeI vztaženo na kg Class III. caramel
středa 3. prosince 14
Ultra rychlá
chromatografie
středa 3. prosince 14
Ultra rychlá chromatografie
1972
1985
1992
2000
2003
1967
1950
5μm
3 - 3.5μm
100μm
50μm
10μm
2.5μm
1.8μm
velikost částic
průtok
teplota
0 5 10 15 20 25 30
délka kolony (cm)
1.Daidzin 6.Glycitein
2.Glycitin 7.Sissotrin
3.Genistin 8.Genistein
4.Ononin 9.Formononetin
5.Daidzein 10.BiochaninA
A. 150x2.1; 3μm ; průtok 0.2 ml.min-1
B. 20x2.1; 3μm ; průtok 0.68 ml.min-1
C. 30x2.1;1.8μm ; průtok 1.3 ml.min-1
středa 3. prosince 14
Ultra rychlá chromatografie - separace izoflavonů z reálných vzorků
30x2.1;1.8μm ; průtok 1.3 ml.min-1, teplota 85°C
Tlatlancuayin
Iristectotigenin A Irisone Irignin
středa 3. prosince 14
KOmbinované systémy
středa 3. prosince 14
Strategie extrakce pro kombinované systémy
vzorek Příprava vzorku
Homogenizace
Mleti
Vymražování, sušení
Extrakce
Lyofilizace
Sušení
Hydrolýza
Hydrolytická , ne-hydrolytická
Kapalina-kapalina
Soxhlet, ultrazvuk
Třepání, Míchání
SFE
SPE
MAE
UAE
PLE
Post-extrakční kroky
MS; MS/MS; MSn
UAESFE
UAESPE
UAEMAE
UAEPLE
UAESFESPE
UAEMAESPE
UAEPLESPE
Centrifugace
Filtrace
Kapalina-kapalina
SPE
Hydrolýza
Derivatizace
Odpařování
HPLC, UHPLC, HPTLC
GC, CZE
Analýza
HPTLC
Kombinované systémy
Kvalitativní
Kvatitativní
Kvalitativní - ambientní hmotnostní spektrometrie
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
2.3.1.74
Cinnamoyl-CoA Pinocembrin chalcone Pinocerbrin
Pinostrobin
Chrysin
Isoliquiritigenin
Butein Butin
7,4’-
Dihydroxyflavo
ne
Liquiritigenin
Prunin
Naringin
Hesperitin 7-O-
glucoside
Naringenin
Hesperitin
Neohesperidin
Naringenin chalcone
Xanthohumol
Desmethylxanthohumol
Chalcone 2’-O-glucoside
p-Coumaroyl-CoA
p-Coumaroyl
quinic acid
p-Coumaroyl
shikimic acid
Caffeoyl
shikimic acid
Caffeoyl-CoA
Feruoyll-CoA
Caffeoyl
quinic acid
Naringenin chalcone
4’-O-glucoside
Aureusidin
6-O-glucoside
Bracteatin
6-O-glucoside
2’,3,4,4’,6’- Penahydroxychalcone
2’,3,4,4’,6’- Pentahydroxy
chalcone 4’-O-glucoside
4,2’,4’,6’- Tetrahydroxy-3-
methoxychalcone
Homoeriodictyol
Dihydrotricetin
Tricetin
Luteoforol
Luteolin
Eriodictyol
Apigenin
Vitexin8-C-Glucosylnaringenin
Apiforol
Kaemferol
Quercetin
Dihydroquercetin
Myricetin
(+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Dihydromyricetin
Leucodelphinidin Delphinidin
(+)-Gallocatechin
(-)-Epigallocatechin
CyanidinLeucocyanidin
(+)-Afzelechin
Dihydrokaemferol Leucopelargonidin Pelargonidin (-)-Epiafzelechin
Pinobanksin
Pinobanksin 3-acetate
Galangin
Garbarzol
Dihydrofisetin
5-Deoxyleucopelaronidin
5-Deoxyleucocyanidin
2.3.1.170
2.3.1.74
5.5.1.6
5.5.1.6
5.5.1.6
1.14.11.22
1.14.11.9
1.14.11.9
5.5.1.6
1.21.3.6
1.21.3.6
1.21.3.6
23.1.13323.1.133
23.1.133 23.1.133
2.3.1.74
1.14.13361.14.13361.14.1336
2.4.1.-
2.1.1.-
1.14.1311
1.14.1123
1.14.1219
1.14.1219
1.14.1321
1.14.11.9
2.4.1.185
2.4.1.185
2.4.1.236
2.4.1.236
1.14.11.9
1.1.1.234
1.14.1.122
1.14.1.321
1.14.1.321
2.1.1.104
2.3.1.74
1.14.11.9
1.14.11.22
1.1.1.234
1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.22
1.14.1388
1.14.11.9
1.14.1388 1.14.1388 1.14.1388
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.11.23
1.14.1.321 1.14.1.321
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.14.11.9
1.1.1.219
1.17.1.3
1.3.1.771.14.11.9
1.3.1.77
1.17.1.3
1.14.11.9 1.3.1.77
1.17.1.3
1.1.1..219
1.14.13.21
Phenylpropanoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Isoflavonoid
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Flavone and flavonol
biosynthesis
Anthocyanin
biosynthesis
biosyntéza flavonoidů
Studium rostlinných metabolitů
středa 3. prosince 14
MS; MS/MS; MSnHPLC, UHPLC, HPTLC
Analýza
Kvalitativní - přesná hmota
Kvantitativní
Kvalitativní - ambientní hmotnostní spektrometrie
OH
O
OOH
HO
OH
OH
O
OH
HO
OH
OH
+
HPTLC MS s ambientní technikami
HO O
O
HO
HO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
Ambientní hmotnostní spektrometrie
MS/MS (QQQ) s Jet Strem Technologies
100 attomol
10 attomol
Metabolické studie pomocí hnotnostní spektrometrie
Lišejníkové metabolity
OH
O
O
O
O
OH
OH
O
O
O O
O
HO
Atranorin
Vulpinic acid
Quercetin
Pelargonin
Proanthocyanidin dimer B1
285.03992
255.02992
285.03992 C15H9O6
C14H7O5255.02992
Kaemferol
O
OOH
HO
OH
OH
O
OOH
HO
OH
OH
Kaemferol
200 fmol
Flavonoidy v řasách
středa 3. prosince 14
Metabolické studie pomocí hnotnostní spektrometrie
Ambientní techniky
DART - Direct Analysis in Real Time
Přímá anlýza v reálném čase
Ionizace analytu nastává po kolizi molekul s metastabilními
molekulami helia nebo dusíku v excitovaném stavu
Odpadá úprava vzorku
Odpadá chromatografie
He2
T ºC
středa 3. prosince 14
DART - Direct Analysis in Real Time
MassFingerprint Cladonia Convoluta
středa 3. prosince 14
Metabolické studie pomocí HPTLC s hmotnostní spektrometrií
min0 2 4 6 8 10 12 14 16
LU
0
100
200
300
400
500
FLD1 A, Ex=250, Em=410 (FINGERP\PHYLLAN2.D)
Phyllanthus*miruri*B*
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
10
20
30
40
Densitogram Phylanthus miruri
0 2 4 6 8 min10 12 14 16
mAU
0
50
100
150
200
250
300
DAD1 B, Sig=340,16 Ref=600,100 (FINGERP\PHYLLAN2.D)
Phyllanthus*miruri*B*
Fingerprinty
HPTLC Phylanthus miruri
System 1 Uv Vis System 1 336nm derivatizace System 1 254nm derivatizace
System 3 336nm derivatizace System 4 336nm derivatizace
OH
OH
O
O
O O
O
HO
Atranorin
středa 3. prosince 14
DĚKUJI
středa 3. prosince 14