12/12/2014 1 Bioluminiscence Bioluminiscence • celkem je známo asi 550 druhů organismů, které produkujíluminiscenční světlo (suchozemští a mořští živočichové, houby) • v roce 1887 profesor Raphael Duboise izoloval ze světlušek dvě látky: luciferin a luciferázu • na zemi světélkují zejména brouci z čeledi Lampyriade (světlušky) a někteří kovaříci (např. Pyrophorus noctilucus) • v moři bylo zatím objeveno přibližně světélkujících 250 druhů: medusy, chobotnice, krakatice, ryby, paryby, atd. Zatím nebyl objeven žádný sladkovodní živočich jevící bioluminiscenci… • bioluminiscence živočichů je z evolučního hlediska vysvětlována různými důvody: hledání partnera (světlušky), lákání kořisti (např. ryba zubatka, některé druhy světlušek), maskování (žraloček brazilský), zastrašení nepřátel (ryba stříbrnáč, medusy z čeledi klanonožců) • bioluminiscence hub (např. některé druhy václavek, „Jack-O-Lantern“, helmovky) Princip • Luciferin se mění na oxidovanou formu (oxoluciferin), která má přebytek energie, která se může uvolnit ve formě fotonu • Tuto reakci většinou katalyzuje enzym (luciferáza) • Oxidovadlem bývá často H2O2 nebo O2 • Reakci často doprovází přítomnost některých kovů (Cu, Fe, Ca, Mg, atd.) • Analogie s chemiluminiscencí, ale probíhá v těle organismů Základní pojmy • Luciferiny: skupina látek s různou strukturou Luciferin ze světlušky (Firefly) Červí luciferin (Earthworm) Luciferin z obrněnky (Dinoflagallete) 12/12/2014 2 • Luciferáza: oxidativní enzym Základní pojmy • „divoká“ luciferáza ze světlušky Photinus pyralis, tento protein má Mr = 62 000 • jen u čeledi světlušek (Lampyriade) bylo popsáno přes 2000 typů luciferáz • v některých organismech (např. houbách) se luciferáza zřejmě nenachází • místo jednoduchého luciferinu je v některých organismech „komplex“ fotoprotein-luciferin (tedy komplex substrátu s enzymem) • jedná se o intramolekulární reakci • Komplex fotoprotein-luciferin je velmi stabilní • pro bioluminiscenci je zpravidla nutná přítomnost některých iontů nebo molekul, např. peroxid, ATP, Ca2+ nebo Fe2+ , které spustí bioluminiscenční reakci • např. fotoprotein aequorin emituje světlo ve vodném prostředí po dodání Ca2+ • emitované světlo je přímo-úměrné koncentraci fotoproteinu Základní pojmy Světlušky • v ČR se vyskytuje pouze Světluška větší (Lampyris noctiluca) • samečci létají a světélkují méně jak samičky • samičky nelétají (pohlavní dimorfismus), pohybují se po zemi a svítí výrazněji • také larvy světlušek mohou světélkovat • světlušky regulují bioluminiscenčníreakci • „naše“ světlušky světélkují kvůli rozmnožování • existují i druhy světlušek, které vysílají světelné signály s určitou frekvencí • některé světlušky dokáží měnit frekvenci signálů, aby mohly lovit menší druhy světlušek Oxidace luciferinu (světluška) • na oxidaci luciferinu pomocí O2 je třeba ATP, Mg2+ a enzym luciferázu • všechny druhy světlušek využívají tento luciferin („firefly luciferin“), stejně jako další druhy bioluminiscenčních brouků (Lampyridae, Phengodidae, Eleteriodae • jsou ale i druhy hmyzu (např. Arachnocampa), které využívají jiné luciferiny 12/12/2014 3 „Firefly“ luciferin Světlo emitované světluškami je zpravidla zeleno-žluté (552-582 nm), v kyselém prostředí (laboratorní podmínky) může být i červené (615 nm) Žlutozelená bioluminiscenceČervená Využití systému liciferin-luciferáza • Stanovení koncentraceATP • Stanovení některých kovů • Použití v chemiluminiscenční EIA: Příklad stanovení antigenu 1. protilátka je značen enzymem 2. protilátka značená luciferázou se sráží s antigenem 3. zbytková (nesražená) protilátka značená luciferázou zůstává v systému a je schopna katalyzovat oxidaci luciferinu 4. čím větší kvantový výtěžek, tím méně antigenu ve vzorku Bioluminiscence bakterií zdroj: http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/organism/milkysea.html Tzv. Mléčné moře – způsobený pravděpodobně bakteriemi Bioluminiscenční bakterie • Bioluminiscenční bakterie se vyskytují v mořské vodě, na povrchu a v tělech mořských živočichů • Některé žijí v symbióze s vyššími organismy • Všechno jsou to „Gram negativní“ bakterie (např. Photobacterium, Beneckea, Vibrio, atd.) • Bakteriální luciferin je aldehyd s dlouhým řetězcem (10-18 uhlíků), který se v přítomnosti bakteriální luciferázy oxiduje na karboxylovou kyselinu • Za přítomnosti FMNH2 a O2 • Někdy dochází k energetickému přenosu (energy transfer) na jinou molekulu 12/12/2014 4 Bakteriální bioluminiscence – předpokládané schéma Obrněnky (dinoflagallates) a další prvoci (protozoa) • Prvoci jsou mikroskopické jednobuněčné organizmy • Bioluminiscenci jeví pouze obrněnky a mřížovci • Obrněnky někdy tvoří tzv. rudý příliv (red tide) Bioluminiscenční organismy – Austrálie, jezero Gippsland Bioluminiscence kroužkovců • bioluminiscence kroužkovců (bioluminescent earthworms) –v svítí zástupci mnohoštětinatců (např. chaetopterus a tomopteris) i máloštětinatců (např. diplocardia a eisenia) • bioluminiscenci jeví kolem 33 druhů červů rozšířených po celém světě (hlavně Australie a JV Asie) • v ČR: žížala podhorská/svítivá (eisenia submontana/lucens), která žije v podhorských a horskýchoblastech střední Evropy • základem luminiscence je opět reakce luciferinu s vodou, nebo peroxidem • bioluminiscentní je nejčastěji vyloučený sliz • emise záření od modré po oranžovou barvu 12/12/2014 5 Biolumuniscence žížaly Eisenia lucens • Eisenia lucens (submontana) – žížala svítivá (podhorská) • Žije v hnijícím dřevě (nejlépe smíšenélesy bez dlouhodobéúdržby – pralesy) • Beskydy, Orlické hory, Vysočina, atd. • Mechanismus bioluminiscence ještě není zcela prozkoumán • Žížalu můžeme podráždit např. několika kapkami ethanolu nebo formalínu (formaldehydu) Eisenia lucens - video Možné schéma bioluminiscenční reakce – žížala Eisenia lucens Bioluminiscence kroužkovce diplocardia longa http://www.bmb.uga.edu/wampler/biolum/worm/index.htm 12/12/2014 6 21 Nobelova cena za chemii 2008 „…for the discovery and development of the green fluorescent protein“ OSAMU SHIMOMURA (Japonsko) MARTIN CHALFIE (USA) ROGER Y. TSIEN (USA) Bioluminiscence medusy A. Victoria Většina mořských živočichů jevících bioluminiscenci emituje namodralé světlo. Z evolučního hlediska to lze vysvětlit tím, že v mořských hlubinách se modré světlo lépe šíří. U medusy Aequorea Victoria však byla pozorována zelená luminiscence... Bioluminiscence medusy A. Victoria • medusa obsahuje fotoprotein aequorin, který se skládá s apoproteinu (apoaequorin) a prostetického proteinu, resp. luciferinu (coelenterazin) • v přítomnosti O2 a při vysoké hladině Ca2+ dojde k oxidaci coelenterazinu na excitovaný coelenteramid a CO2 • relaxací coelenteramidu do základního stavu se uvolňuje modré světlo (λ = 469 nm) • uvolněné světlo může být absorbováno dalším proteinem obsaženým v těle medusy – GFP „Green fluorescent protein“ • absorpční maxima GFP jsou 395 a 475 nm ~ může dojít k absorpci světla uvolněného z aequorinu • absorbované světlo excituje GFP a dochází k vyzáření zeleného světla (λ = 509 nm) 12/12/2014 7 Struktura GFP • GFP byl objeven Shimamurou v 60. letech • V roce 2008 byla udělena Nobelova cena „za objev a výzkum zeleně fluoreskujícího proteinu“ (Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Y. Tsien) • GFP obsahuje běžné aminokyseliny, ale ve slunečním světle jeví lehce nazelenalou fluorescenci (kolem 500 nm), stejně jako živá Aequorea Victoria v moři... • Klíčová sekvence (Ser-Tyr-Gly) se nachází „uvnitř plechovky“ • Protein má celkem 238 aminokyselin (26,9 kDa) Struktura GFP • GFP vzniká cyklizací, dehydratací a oxidací vzdušným kyslíkem sekvence proteinu obsahujícím Ser-Tyr-Gly Tsien Y. R., Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:509–44. Fluorescenční vlastnosti GFP „Divoký“ typ GFP – směs fenolového a fenolátového derivátu Hlavní excitační pík - 395 nm (emisní maximum - 508 nm) Minoritní excitační pík - 475 nm (emisní maximum – 503 nm) Použití GFP v chemii a biologii • lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly), který má vlastnosti stejné jako ostatní proteiny, ale je mnohem lépe detegovatelný • genové inženýrství – sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... 12/12/2014 8 GFK – Green Fluorescent Králík Použití GFP v chemii a biologii • nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) • obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem • sledování genové exprese • medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Jiné varianty GFP - YFP π-electronový „stocking“ s dalším Tyr (tzv. class 4) 516 nm  529 nm zelenožloutlá luminiscence – YFP (yellow fluorescent protein) Jiné varianty GFP TYR je nahrazen indolem (tzv. class 5) 436 nm  476 nm modrozelená luminiscence, rozštěpení píků 12/12/2014 9 Jiné varianty GFP - BFP TYR je nahrazen imidazolem (tzv. class 6) 383 nm  447 nm modrá luminiscence – BFP (Blue Fluorescent Protein) Jiné varianty GFP Červená bioluminiscence • většina podmořských živočichů světélkuje modře, nebo modro-zeleně • modré, nebo modro-zelené světlo se ve vodě šíří dále, než světla vyšších vlnových délek • „přesto“ několik druhů podmořských ryb (např. Malacosteus, Aristostomias, nebo Pachystomias) je schopno vysílat (a detekovat...) červené světlo (704 nm), aby mezi sebou mohli komunikovat Červená bioluminiscence ryby Malacosteus Energie vzniklá chemickou reakcí je kaskádovitě předávána se ztrátami mezi molekulami (energetický transfer) a výsledná vlnová délka emise má maximum okolo 626 nm. Speciální „biofiltr“ propustí jen světlo s vlnovou délkou nad 700nm (červené světlo). Ryba Malacosteus je schopno pomocí „anténa“ pigmentu toto světlo i zachytit. Campbell AK, Herring PJ, Comp Biochem Physiol B 86: 411-417 (1987). 12/12/2014 10 Bioluminiscenční houby - známo je asi 70 druhů hub jevících bioluminiscenci - některé rostou i v ČR (václavky a helmovky) - nejčastěji dřevokazné houby - někdy není jasné jaký má produkce světla pro houbu význam… Omphalotus olearius - Hlíva olivová - „Jack-O-Lantern“ - „svítí“ lupeny na spodní straně plodnice - výskyt: srpen až říjen - rozšířená celosvětově, vzácně i v ČR Panellus stipticus – pařezník obecný, pňovka obyčejná - roste v mírném pásu severní polokoule (tedy i v ČR), ale bioluminiscence byla pozorována jen u hub rostoucích v sev. Americe  - roste po celý rok, zejména na mrtvém dřevě listnáčů 12/12/2014 11 Armillaria mellea – václavka obecná - "The Honey Fungus„ - celosvětově rozšířená houba, včetně ČR - „svítí“ často i podhoubí, což vyvolává dojem, že svítí samotné dřevo, napadené touto dřevokaznou houbou Collybia tuberosa - Penízovka hlíznatá Mycena rorida - Helmovka lepkavá Další… • Mycena epipterygia • Helmovka mléčná - Mycena galopus • Helmovka ředkvičková - Mycena pura