C9045 - Biologie kvasinek hustopece_kvasinka_vinna2 prof. Augustin Svoboda asvoboda@med.muni.cz Oficiální fotografie doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat. doc. Jan Paleček jpalecek@sci.muni.cz Oficiální fotografie prof. MUDr. Augustin Svoboda, CSc., dr. h.c. Hustopeče u Břeclavi Osnova přednášek •Význam – výskyt, výzkum, využití … •Mikrobiologie - základní charakteristiky •Biotechnologie - metody •Genetika - metody •Buněčná biologie – buněčná stěna … •Molekulární biologie – buněčný cyklus, transkripce, oprava DNA, chromosomy, •Klinické aspekty – patogenní kmeny • Rozvrh přednášek 18.9.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Úvod – historie, význam 25.9.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Základní charakteristiky kvasinek 2.10.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Genetické a molekulárně biologické metody 9.10.2014 12-13.50hod A7-2.14 prof. Kopecká O podstatě buněčných stěn kvasinek 16.10.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, 23.10.2014 12-13.50hod A2-2.11 prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 30.10.2014 12-13.50hod A2-2.11 prof. Svoboda Struktura kvasinkové buňky, sekreční dráhy a endocytóza 6.11.2014 12-13.50hod A2-2.11 prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 13.11.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy 20.11.2014 12-13.50hod A2-2.11 Dr. Kolesár Využití kvasinek pro studium procesů opravy DNA 27.11.2014 12-13.50hod A2-2.11 Doc. Paleček Organizce kvasinkového chromatinu 4.12.2014 12-13.50hod A2-2.11 Mgr. J. Kopecká Kvasinky a biotechnologie 11.12.2014 8-12hod A7-2.17 Svoboda+Paleček Cvičení k přednáškám 18.12.2014 9-11hod A2-2.11 Doc. Paleček Zkouška Přednášky – budou na IS Cvičení – blokově (všichni) 2 termíny zkoušení mikromanipulator • •Odborné články (z mezinárodních časopisů tj. anglické) zabývající se výzkumem kvasinek a jejich aplikací, ne starší než 5let •Tématicky blízké diplomové práci (nikoli referát o diplomce!) •Přednáška cca 15minut + 5 minut diskuse •Dobrý úvod k tématu, výsledky a závěry (použitá literatura) •Diskuse – vysvětlení detailů, otázky z přednášek Kvasinkáři •Brno – prof. Svoboda, Doc. Krejčí, Doc. Vaňáčová … •Praha – Doc. Pálková, Dr. Hašek, Dr. Valášek … •SR - Bratislava – prof. Tomáška, prof. Nosek … •Rakousko – Biocentrum - Dr. Ammerer … •UK – Sussex university - prof. Carr, prof. Nurse … •USA – prof. Forsburg, Dr. Amon … http://listserver.ebi.ac.uk/mailman/listinfo/pombelist - S. pombe http://www.yeastgenome.org/cache/yeastLabs.html - S. cerevisiae Informační zdroje Janderová & Bendová: Úvod do biologie kvasinek, nakladatelství Karolinum (1999) F. Sherman, Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002): http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/StartedYeast.html … nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PNAS … vždy uvedeny v rohu SGD databáze: http://www.yeastgenome.org/ http://wiki.yeastgenome.org/index.php/Commonly_used_strains Význam – výskyt, výzkum, využití … - savci pili alkoholický nektar miliony let - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy - dlouhodobá konzumace fermentovaných šťáv vedla k evoluční adaptaci tohoto savce – zvýšená exprese alkoholdehydrogenásy - autoři spekulují o vlivu takovýchto přírodních alkoholických nápojů na evoluci … nastavení hladiny ADH u člověka ;-) - - kvasinky Saccharomyces cerevisiae aj. rostou na substrátech bohatých na cukr - kvasinky fermentují sladký nektar z Bertramovy palmy A B C Wiens et al., PNAS, 2008 … trochu historie - přirozeně v prostředí mohou fermentovat sladké šťávy (např. nektar …) - lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 lety (chleba před ~4000 lety) - poprvé kvasinky pozoroval A. van Leeuwenhoek v roce 1680 - název Zuckerpilz („cukerná houba“) tj. Saccharomyces od roku 1837 (T. Schwann) - L. Pasteur prokázal aktivní účast při kvašení (publikoval 1866, 1876) - první čisté kultury S. cerevisiae izolovány z piva (E.Ch.Hansen) a z vína (Muller-Thorgau) v 80.letech 19. století (cerevisiae = pivo v latině, pombe = pivo ve swahili) ... M. Rees popsal a pojmenoval S. ellipsoideus (fermentuje ovocné šťávy) - -první systém pro klasifikaci (patogenních) kvasinek, založený na morfologii buněk a několika fyziologických testech (fermentace monosacharidů…) vytvořil A. Guilliermond v roce 1912 - v Československu prof. Kratochvilová … - - nejintenzivněji studovaná eukaryotní buňka (buněčný cyklus …) - S. cerevisiae první kompletně osekvenovaný eukaryotní genom (1996) (S. pombe, 2002; v současnosti osekvenovaných >35 druhů kvasinek) Nobelova cena: za výzkum buněčného cyklu - 2001 – Hartwell, Hunt, Nurse) za sekreci – 2013 - Schekman) Science 272 (1996), p.481 + Nature 458, (2009), p337 Soubor:Ptilocercus lowii.jpg Přirozený výskyt - ve vodě (dle čistoty – moře 10/l, jezera 100/l, odpadní až 108/l; v arktických vodách Leucosporidium, v odpadních vodách Candida parapsilosis, S. exiguus, fekální znečištění indikuje Hansenula anomala, C. albicans, v olejem znečištěných vodách Candida (Yarrowia) lipolytica, C. tropicalis, v planktonu v závislosti na řasách např. Rhodotorula - v půdě (mnohem méně než bakterií, do 15cm hloubky – Schwanniomyces, Lipomyces, Pichia, Cryptococcus, schopny hydrolyticky štěpit celobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu) Conell et al., Microb Ecol 56 (2008) - naproti tomu v Antarktidě jsou dominantní (méně bakterii) - výzkum v letech 2003-4: Izolovány 2x asco- a 16x basidiomyceta (7x nové druhy) * * * * * * * Půda a kvasinky • ●Typ vegetace → složení půdních mikrobiálních komunit ●Kvasinky jsou kosmopolitní (autochtonní nebo allochtonní), převážně saprofyti ●Množství a druhové složení kvasinek v půdách je nerovnoměrné (více v asociaci s rostlinami) – ovlivňuje mnoho faktorů ●Nejsou primárními degradátory těžko rozložitelných látek (lignocelulóza), ale degradátoři meziproduktů rozkladu rostlinného materiálu (aerobní rozklad L-arabinózy, D-xylózy, celobiózy) Botha, Soil Biol. Biochem., 2011 • ●Transformace živin ●Koloběhy C, N, S, P v ekosystému ●Aerobní respirace i fermentace živin ●Nitrifikace = přeměna amoniaku na dusičnany (rody Candida, Geotrichum, Rhodotorula, Saccharomyces, Williopsis) ●Sulfurikace = oxidace síry na sírany, thiosírany (rody Rhodotorula, Saccharomyces, Williopsis) ●Rozpouštění těžko rozložitelných fosforečnanů (rody Rhodotorula a Williopsis) → podporuje růst rostlin ●Vazba železa pomocí sideroforů rho1_L Yurkov a spol., Soil Biol. Biochem., 2012 Birkenhofr a spol., PLoS One, 2012 ●Nerovnoměrné (komplexní) rozložení kvasinek ●Pokryv půdy má velký vliv na diverzitu a množství půdních kvasinek (lesy x pastviny), stejně tak i lidská činnost (oblasti zemědělsky a lesnicky využívané x přirozené) Rostliny a kvasinky - na listech rostlin, květech (nektar palmy Bertramové … červené kvasinky rodu Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, černá Aureobasidium pullulans,) - na kazících se plodech (na spadlých plodech … schopny hydrolyticky štěpit celobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu - zahnívající kaktusy => pektolytické bakterie => kvasinky Pichia cactophila, P. opuntiae => přenos a výživa drosofila) - img_levedura Počet kvasinek, log (CFU/g) Měsíc 1 2 3 1 – listy 2 – květy 3 - hrabanka Glushakova & Chernov, Microbiology, 2007 Sezónní dynamika kvasinek • ●Rozpouští nerozpustné fosforečnany … → podpora růstu kořenů (stimulátory růstu a biohnojiva) ●Symbionti nebo paraziti ● ●Interakce s houbami ● Exocelulární polymery (glykolipidy, glykoproteiny) s fungicidními a fungistatickými účinky ●Extracelulární enzymy (glukanázy) ●Mykociny (proteiny) ●Kvasinky a jejich extracelulární polymery a jednoduché metabolity → zdroj potravy pro jiné organismy ●Predátorské kvasinky Saccharomycopsis fermentans a Saccharomycopsis javanensis ●Okyselování prostředí → regulace počtu některých bezobratlých Interakce s živočichy Predátorská kvasinka (Dactylellina candida) napadající hlístici (http://www.uoguelph.ca/~gbarron/2008/dactylel.htm) Hmyz a kvasinky - přenášeny hmyzem (opylovači) - včely, brouci, mouchy - Candida, Cryptococcus, Metschnikowia - např. izolována Metschnikowia orientalis nalezena v květech a přenášena čmeláky na Cookových ostrovech (Int J Syst and Evol Microbiology, 2006) - MP900201230[1] - Kvasinky nalezeny ve střevě mouchy Drosophila - Askus chrání spory během průchodu trávicím traktem, ale zároveň dochází k částečnému natrávení enzymy, čímž se usnadňuje kontakt mezi nepříbuznými gametami - Bylo zjištěno, že průchod trávicím traktem 10x zvyšuje frekvenci sexuálního rozmnožování s nepříbuznými gametami - Hypotéza, že hmyz slouží jako vektor umožňující kvasinkám osidlovat nová prostředí, přičemž zvýšená rekombinace zvyšuje šance na přežití a adaptaci na ně Sandhu & Waraich, Microb. Ecol., 1985 - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy … - i člověku se dostávají kvasinky do trávícího traktu např. při konzumaci burčáku, nefiltrované pivo … neškodné pro zdravé jedince (! ale co pro imunokompromintované jedince?) - nejčastěji je z gastrointestinálního traktu izolována C. albicans (C. dubliensis) - kvasinky tvoří jen malou část stálé mikroflóry ve střevě - méně než 0,1 % mikroflóry - kůže, ústní dutina, sputum, vaginální sekrety, výtěry zvukovodů, moč, stolice ... Kvasinky a savci Findley et al, Nature, 2013 - sekvenace vzorků od 10 zdravých jedinců - ruce, nos, uši, záda, třísla … Malassezia - zatímco na nohou velká diverzita -15 druhů je potenciálními lidskými patogeny (vyvolávají onemocnění u oslabeného organismu – imunosupresiva, cukrovka … významným faktorem virulence je schopnost tvorby biofilmu - antibiotika na eukaryota nezabírají) – více prof. Svoboda - -Kandidózy (C. albicans, dubliniensis, krusei, tropicalis, parapsilosis, glabrata, utilis, lipolytica) -Candida albicans – urogenitální a krevní infekce (vyskytuje se u člověka přirozeně) -Cryptococcus neoformans – 8% AIDS pacientů – plícní onemocnění až do mozku - (přenáší švábi a holubi – kreatinin z trusu používají jako zdroj dusíku) -Malassezia – poruchy pigmentace kůže a lupy tzv. pityriázy (M. furfur, globosa, japonica, obtusa, restricta, yamatoensis, dermatis, slooffiae, sympodialis, nana, pachydermatis) -3 druhy Trichosporon (kúže) hongo_Malassezia_furfur Malassezia furfur tinea_01 pityriasis versicolor Tinea_Versicolor Prof. A. Svoboda Patogenní kvasinky 19177.jpg Murzyn et al., 2010, FEMS Microbiol Lett. - Saccharomyces boulardii – izolován z čínské švestičky Lyči (1920, Henri Boulard) - používán jako probiotikum při střevních potížích (Enterol, Salutil) - ochrana proti patogenům (Salmonella typhimurium, C. albicans) – modulují imunitní systém, inhibují účinky bakteriálních toxinů a růst hyf … - exprese proteinů - příprava „hepatitis B core“ antigenu, anti-thrombin proti srážení krve (Pichia pastoris) - -Pangamin – kvasinkové lyzáty – vitaminy, nenasycené mastné kyseliny, minerály … - - ImmiFlex – obsahuje beta 1-3,1-6 glukany z buněčných stěn kvasinek S.c. – aktivují imunitní systém (neutrofily) a zvyšují tak obranyschopnost organismu - Význam pro zdraví člověka default.jpeg Průmyslový význam - výroba piva, vína, etanolu a pekařského droždí (S.c.), různé kmeny pro spodní (S. bayanus) a svrchní kvašení, vinařské a lihovarské (hybridní kmeny např. S.c. + S.kudriavzevii) - krmná biomasa (Candida utilis), příprava mléčných výrobků (Candida kefyr, Klyuveromyces lactis), získávání ergosterolu (prekurzor vitaminu D), zdroj komplexu vitamínů skupiny B … - štěpení škrobu amylolytickými enzymy (Saccharmycopsis fibuligera, Schwanniomyces occidentalis) - štěpení dřevní hmoty – štěpí xylozu přímo na etanol za aerobních podmínek (Aureobasidium, Candida utilis, Pachysolen tannophilus, Candida shehatae a Pichia stipitis) - odbourávání ropných produktů (Yarrowia lipolytica), - sorpce těžkých kovů (odstranění znečištění) - - - - - - - exprese proteinů - příprava hepatitis B core antigenu, anti-thrombin proti srážení krve (Pichia pastoris) - - GMO např. příprava bioplastů (Lu et al. JACS, 2010) pivo Mgr. J. Kopecká Příprava monomerů pro výrobu plastů – využití Candida tropicalis Lu et al., JACS (2010) •Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku (acetyl-CoA) •mutantní kmen (DPOX4, DPOX5) není schopen b-oxidace a přeměňuje je oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992) •další mutagenezí (pomocí flp rekombinasy – viz genetika) odstranili geny dalších oxidás (4 alkohol oxidásy) a dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás) aby eliminovali w-oxidaci •nový kmen je schopen produkovat •w-hydroxymastné kyseliny, které •lze použít pro výrobu bio-polymerů •(plastů podobných polyetylenům, •bio-odbouratelné na bio-palivo) •další modifikace kmene •(integrace genů pro lipásy) •by umožnilo přímé odbourávání •odpadních olejů … Přednáška o genetice Využití S. cerevisae pro výrobu biopaliv 30949-Clipart-Illustration-Of-A-Yellow-Gas-Nozzle-Emerging-From-A-Yellow-Corn-Biofuel-Pump •Nemají přirozenou metabolickou dráhu pro odbourání celobiosy a xylozy •Vloženy geny XYL1 and XYL2 kódující xylózovou reduktázu (XR) a xylitolovou dehydrogenázu (XDH) z kvasinky Pichia stipitis •Přednostní využívání glukózy (glukózová represe) •Transport celobiosy do buňky (cdt-1 integrován do genomu) a jeho přeměna na glukózu uvnitř buňky (gh1-1 z Neurospora crassa na „multicopy“ plazmidu) obešla represy • • Ha et al, 2011, PNAS Přednáška o transkripci Výzkum - Je třeba kvasinkám rozumět (na molekulární úrovni) aby bylo možné je využít - S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy - jednoduchá eukaryontní buňka (základní procesy jako u vyšších eukar.) - 1. osekvenovaný eukaryontní genom, 1. syntetický eukar. chromosom - buněčný cyklus (sir P. Nurse) - chromosomy a evoluce (např. projekt syntetického chromosomu) - mechanismy opravy poškozené DNA (nádorové syndromy – tabulka) - sekrece, endocytóza, buněčná stěna (prof. A. Svoboda) - Metody využívající kvasinek (např. 2-H, reporterové systémy) - Exprese proteinů (posttranslační modifikace, štěpení …) - Více v dalších přednáškách Srovnání 250 sekvencí lidských genů, jejichž mutace vedou ke vzniku onemocnění – cca 90 genů má S.c. homology