Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Mgr. et Mgr. Kristýna Brzobohatá pizova@sci.muni.cz Laboratoř biologické a molekulární antropologie, ÚEB, PřF, Mu Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA PCR – polymerase chain reaction •1971 Kleppe et al. objev amplifikace in vitro •1976 objev termostabilní polymerázy z Thermus aquaticus (Chien et al., 1976) •1983 Mullis pracující ve společnosti Cetu Corporation (Kalifornie) vymyslel koncept PCR •1993 Nobelova cena za chemii •Mullis dostal v roce 1983 10 000 dolarů, přičemž firma technologii později prodala firmě Roche za 300 milionů dolarů Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQt3TAgxIdz66U3syl-QnAYRdVhgHCveM3pm1LDPeHhfvX B_TD8 Polymerázová řetězová reakce (PCR) - termostabilní polymerázy, např. Taq DNApolymeráza - 3 kroky: 1.Denaturace 2.Annealing 3.Elongace http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Složení reakční směsi •dNPS •Ionty •Primery •Templát •Polymeráza •Další komponenty… Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA PCR box v LBMA (Foto: Pížová) dNTP •dATP, dGTP, dCTP, TTP •nejběžnější koncentrace dNTP je 200 µM http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/product6/026/dntp100_contents.tif/_jcr_conten t/renditions/medium.jpg Ionty •Mg nebo Li •dATP, dGTP, dCTP, TTP, ve formě solí •volné Mg2+ •koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM Primery •Design primerů (BLAST) •Teplota nasedání (http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/) •Unikátní sekvence •Délka okolo 30 pb •Bez sekundárních struktur •Dimery primerů!! •Rovnoměrně AC/GT •Koncentrace 0,1 – 1 μM •Fluorescenční značky • DNA polymeráza •Enzym polymeráza z bakterie Thermus aquaticus, odtud označení Taq polymeráza •Modifikace polymeráz: •hot start, reparační, syntetické… •Koncentrace 0,25 U/reakci (25 μl) Thermus aquaticus Thermus aquaticus (Foto: Wikipedia) http://www.youtube.com/watch?v=ldXXGt8Ihss Templátová DNA •20 pg/ μl (teoreticky stačí 1 molekula) •Nesmí obsahovat inhibitory •Purifikovaná DNA i přímo vzorek (např. bukální stěr) • • • Pufr Obsahuje pomocné látky jako je BSA •dimetylsulfoxid •Triton atd. Optimalizace PCR •Počet cyklů reakce (25 – 50) •Reakční objem (1 – 50 mikrolitů) •Koncentrace Mg, primerů •Délka počáteční denaturace •Teplota nasedání Modifikace PCR •Hot strart PCR •Nested PCR •Touch down PCR •Multiplexová PCR •Alelově specifická PCR •PCR v reálném čase (kvantitativní) • Hot start PCR •Využívá hot start polymerázu •Redukce nespecifické amplifikace •Taq polymeráza je chemicky (protilátkou) nebo mechanicky modifikována tak, aby její aktivita byla spuštěna až zahřáním na 95 °C Touch down •Redukce nespecifického pozadí reakce •Snížování teploty nasedání primerů od nespecifické - o 3 - 5°C vyšší k přesné teplotě nasedání •Nižší teplota – zvyšuje přesnost nasedání •Vyšší teplota – zvyšuje šanci na nasednutí primerů • Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/image/Image1449.gif Nested PCR •Zvyšuje specifitu PCR •Dva PCR cykly v jednom: • 1) Produkt amplifikace je méně specifický, delší než požadovaný produkt • 2) Přesné primery, jako templát neslouží genomová DNA, ale produkt předchozí reakce • Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA http://link.springer.com/static-content/images/113/chp%253A10.1385%252F1-59259-283-X%253A065/MediaO bjects/978-1-59259-283-8_5_Fig1_HTML.jpg Multiplex PCR •Amplifikace více lokusů během jedné reakce •Nutná OPTIMALIZACE PRIMERŮ! •Šetří čas i pěníze •Náročné na optimalizaci podmínek cyklování Alelově specifická PCR •Detekce polymorfismů •Primery navrženy tak, aby nasedaly pouze na wild type nebo mutantní alelu •Nutné přísné podmínky cyklování bez nespecifických produktů PCR v reálné čase •RNA i DNA •Interkalační barviva (SYBR green, EVA green) •Duálně značené sondy (TaqMan, Scorpionrs…) •Speciální cykler vybavený snímačem fluorescnce •Nárůst fluorescence reflektuje nárůst PCR produktů •Široká škála využití • • • PCR v reálném čase •http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU • Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Real time cykler (Life Technologies) Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA G:\Výsledky\Advanced analytical červen 2015\12-51-40\2015 05 07 12H 51M A3 SampA3.BMP Vzorek aDNA pro amplifikaci PCR a aDNA •Oproti recentní DNA rozdíly v: •Složení reakční směsi •Objemu reakční směsi •Designu primerů •Délce produktu PCR •Podmínkách cyklování •Typu použité PCR • Specifika amplifikace aDNA •Polymeráza •Vysoce specifická, hot start, až 4U/reakce •Reparační polymeráza •BSA, Triton •DNA – až 20 μl vstupního materiálu •Preference vyššího objemu reakční směsi •Redukce použití prefabrikovaných směsí •Nutná optimalizace koncentrace primerů • Specifika amplifikace aDNA •Krátké produkty PCR •Teplota nasedání primerů se může lišit od recentní DNA •Navýšení počtu cyklů •Primer – dimery •Běžné použití modifikací – zejména nested PCR a touchdown PCR • Komerčně dostupné kity •„all in one“ •Forenzní kity – kvantifikace DNA • - amplifikace STR (Y, autosomální) •Velmi robustní aplikace •Optimalizovány pro recentní vzorky, ne aDNA •Poměrně vysoké pořizovací náklady • Sekvencování Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Automatické sekvenátory - použití modifikované dideoxy-terminátorové metody - použití fluorescenčních barviv pro detekci řetězců DNA - elektroforetická separace produktů všech čtyř dideoxy-terminátorových reakcí společně v jedné dráze gelu nebo kapiláře - použiti fotobuňky k detekci fluorescence barviv při jejich průchodu gelem nebo kapilárou - přímý přenos výstupu fotobuňky do počítače – automatické analyzování výsledků http://laboratore.agel.cz/pristroje/labgenetiky/molbiol/abi-prism-3130-avant.jpg Sekvencování Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA • inkorporace terminačních fluorescenčně značených dideoxynukleotidů (ddNTP) • každý ddNTP ma navázaný jiny fluorochrom, odlišení na zakladě různých emisních spekter • zařazení ddNTP do řetězce způsobí ukončení syntézy molekuly DNA • v reakci vzniká směs různě dlouhých produktů • po přečištění od volných nukleotidů je vzorek rozdělen na kapilární elektroforéze (součást genetického analyzátoru) • fotooptický systém přístroje zajistí automatické přečtení sekvence (detekce fluorescenčně značených fragmentů, zachycení emitovaného světla) Masivní paralelní sekvenování Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA •NGS zahrnuje následující kroky: 1.Příprava genomové knihovny 2.Sekvencování a čtení 3.Bioinformatická analýza Principy: Pyrosekvencování Polovodičove sekvencování Sekvencovani pomoci ligace Sekvencovani syntézou (Illumina) HTS NGS Sekvenování 2. a 3. generace Příprava genomové knihovny Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Fragmentace - mechanická nebo enzymatická Připojení adapterů Imobilizaci knihovny na pevném povrchu Amplifikace Navázání primerů pro sekvencování paired-end (A) mate-paired knihovnu (B) Barcode sekvence - další multiplexování Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Shot gun strategie vs. Enrichment strategie Shot gun = analýza celého metagenomu Enrichment = cílené obohacení Označí pouze žádané geonomické regiony knihovny Obohacení probíhá prostřednictvím PCR nebo hybridizace PCR – emulzní (B) nebo můstková (A) Hybridizace - pomocí sond reprezentující cílený region, který po nasednutí zablokují - na čipu nebo v roztoku Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Sekvencování syntézou (Illumina) Masivní paralelní sekvenování aDNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Tvorba genomových knihoven aDNA Enriching aDNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Analýza dat Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Srovnání s referenční sekvencí Adapter removal BWA nebo Bowtie 2 Picard Genome analysis toolkit Paleomix – mapDamage2 ExaML MetaPhlAn Masivní paralelní sekvencování aDNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA •Rekonstrukce fylogeneze druhů a objasněni evolučních procesů •Výzkum dynamiky prehistorických populací •Determinace fenotypu a selekce •Rekonstrukce starobylých epigenomů •Metagenomika •Studium tafonomie aDNA a degradačních procesů •Autentifikace aDNA •Posouvaní limitů analýz ( 500 000 tis jeskyně, 1 mil let permafrost)