Moderní metody analýzy genomu
25.9.2015
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie
CEITEC MU
Jitka Malčíková
Trocha historie
Publikování sekvence
lidského genomu
PCR
1983 20011996 2007
První individuální
genom
2008
1. Microarray
Analýza exprese 45 genů
Arabidopsis
1995
Affymetrix
GeneChip
Druhý
individuální genom
2010
Projekt
1000 genomů
- Kompletní diploidní sekvence konkrétního člověka
- J.C. Venter
- Sangerovo kapilární sekvenování
- Institut J. C. Ventera
- cena 100 millionů $
(Levy, S., et al. PloS Biol 2007)
- James Watson
- Sekvenování nové generace
- Baylor College, Texas
- Osekvenováno za 2 měsíce
- < 1 million $
(Wheeler, D.A., et al. Nature, 2008)
1. komerčně
dostupný NGS
sekvenátor
2005
 „large-scale“
 Co nejširší
 Exom, genom, tisíc genomů
 „ultra-deep“
 Co nejhlubší
 Jednotlivé buňky a molekuly
3
2015
Lidský genom možno
osekvenovat za 50
hodin a pod 1000 $
 Interpretace
 Komerční „direct-to-concumer“ (DTC)
genetic testing
 „Unsolicited findings“ – nevyžádané
nálezy
Úskalí
Genom (3.2 x 109 bp, < 20 tis genů)
Transkriptom
Proteom (miliony proteinů)
 Dynamický systém – odráží momentální stav
buňky
 Hladina proteinu často nekoreluje s hladinou
mRNA
 Transkripce
 Posttranskripční modifikace
 Alternativní sestřih
 Translace
 Posttranslační modifikace
 Alternativní konformace
Variabilita
Microarrays
Princip čipových technologií
 Princip – sondy vázané na
nosný podklad
 Různé dělení podle
 Aplikace (genotypizace; exprese RNA, proteinů; epigenetika…)
 Technologie výroby (in situ syntéza; deponování)
 Typu sond (umělé chromozómy – BAC, PAC; cDNA; oligonukleotidy)
 Značeni (fluorescence – jedno/více-kanálové; autoradiografie,
chemiluminiscence)
Nosný podklad
 Sklo
 mikroskopické sklíčko (25 x 75 mm)
 speciální formáty
 různé úpravy povrchu – aminosilan, epoxy atd.
 Nylonová nebo nitrocelulózová membrána
 Plast, gel
 Mikrokuličky
 BeadArrays® (Illumina)
 xMAP (Luminex)
Aplikace
 Analýza genomových aberací, genotypizace
 CGH, SNP čipy
 Resekvenační čipy
 Epigenomika
 Mapování vazby proteinů na DNA (ChIP-on-chip)
 Mapování metylované DNA (MeDIP-chip)
 Exprese
 mRNA, miRNA
 Proteiny
 Buňky, tkáně
Kvantifikace,
kontrola kvality
Čipová
analýza
Amplifikace a
značení
Příprava čipu
Hybridizace materiálu
(RNA,proteinů…) s
čipem
Skenování čipu
Analýza dat,
statistické
zpracování
Izolace DNA,
RNA,
proteinů…
Kvantifikace
 Nanodrop
 Spektrofotometrická kvantifikace nukleových kyselin A260
 měření čistoty: A260/280 (kontaminace proteiny); A260/280 (kontaminace org. látkami)
 Qubit
 Fluorometrická kvantifikace
 Specifické značení dsDNA, RNA, proteinů
Kontrola kvality
 Elektroforéza
 Bioanalyser – „lab on a chip“
 Degradace RNA, nevhodný pro gDNA
 RIN – RNA integrity number – poměr 28S a 18S rRNA
 Tapestation
 Umožňuje analyzovat i gDNA
Čipy pro analýzu genomu
 Výchozí materiál - genomová DNA
 Detekce nebalancovaných genomových změn
 Amplifikace, delece – CNV – copy number variations
 Nedetekuje balancované chromozomální translokace
 Array CGH
 Detekce uniparentální dizomie, genotypizace
 SNP čipy
 Detekce mutací, polymorfismů
 Resekvenační čipy
Postup
 Izolace DNA
 Kontrola kvality, stanovení kvantity
 Amplifikace – celogenomová, PCR
 Fragmentace – enzymaticky
 Značení - fluorescence
 Hybridizace, odmytí
 Skenování
 Analýza dat
CGH - komparativní genomová hybridizace
Kohybridizace značené DNA vzorku a kontrolní DNA
www.advalytix.com (Beckman Coulter)
 na sondy navázané na sklíčku
 array CGH – čipová technologie
 na normální metafázní chromozomy
 klasická CGH, HR-CGH
 Metoda molekulární cytogenetiky
Rozdělení aCGH podle typu sond
 Délka a hustota pokrytí DNA sond určuje rozlišení čipu
 Úseky genomové DNA vložené do vektorů
 YAC (Yeast Artificial chromosome) - 200 -1000 kb
 BAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb
 PAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb
 Kosmidy – 30-40 kb
 Rozlišení ~ 1Mb
 cDNA - 1-2 kb
 Pouze genové oblasti
 Horší schopnost detekce jednokopiových změn
 Rozlišení - 1-2 kb
 Oligonukleotidy - 25-85 bazí
 Rozlišení - pod 1 kb
Platformy aCGH
 Cílené
 Analýza vybraných „hot spot“ oblastí spojených s konkrétním
onemocněním
 Chromozomové
 Celogenomové
 Sondy rozmístěné
 rovnoměrně po genomu
 v určitých intervalech
 Tilling arrays – sondy se překrývají – vysoké rozlišení
Davies et al., 2005
Výsledky aCGH
delece 9pizochromozom 17
Delece + amplifikace
Krátká delece mono a bialelická
SNP čipy
 Čipy umožňující rozlišit nejen CNV, ale i SNP
 Sondy pro detekci CNV jako u CGH čipů + sondy
speciálně navržené pro detekci SNP
 SNP – jednonukleotidové polymorfismy
 Určení alelového statusu, haplotypu
 Genotypizace, asociační studie
 Detekce uniparentální dizomie
www.marshall.edu
Uniparentální dizomie (UPD)
CNN LOH – copy number neutral loss of heterozygozity
 Vrozená, získaná
 Heterodisomie vs isodisomie
 Vyskytuje se u řady onemocnění
mutace
monozomie
trizomie
UPD
Normální
karyotyp
*
Princip SNP čipů - Affymetrix
 25b sondy, záměna 13.
nukleotidu - největší vliv na sílu
vazby při neshodě
 Jednobarevná detekce
 na čip se hybridizuje pouze
označená testovaná DNA
Princip SNP čipů - Illumina
 1x 50b, single base extension; pouze A/G,
A/C, T/C, T/G (dvoubarevná metoda)
 2X 50b, allele specific extension
Princip SNP čipů - Agilent
 60b, SNPs pouze v místech rozpoznávaných
restrikčními endonukleázami
Výsledky SNP čipů
Amplifikace + delece
Uniparentální
dizomie
Výsledky SNP čipů - genotypizace
SNP Array →
Využití CGH, SNP čipů
 Nádorová genomika
 V nádorových buňkách často změny genomu – primární i sekundární
 Klinická genetika
 Přesnější charakterizace mikrodelečních syndromů
 Identifikace genomových změn u pacientů s mentální retardací i
jinými vrozenými postiženími
 Prenatální a preimplantační diagnostika
 Asociační studie – asociace SNP i CNV s řadou
onemocnění (revmatoidní artritida, diabetes,
nádorová onemocnění, psychiatrická onemocnění)
 Evoluční studie
Resekvenační čipy
 Affymetrix
 Stejný princip jako detekce SNP
 SNP = testovány 2 varianty X resekvenování = testovány 4
varianty
Resekvenační čipy
 APEX
 Arrayed Primer EXtension
 Prodloužení sondy o jeden nukleotid komplementární ke
vzorku
 4-barevná technologie – nutné speciální vybavení
Resekvenační čipy – hudba minulosti
 Paralelní sekvenace více oblastí
 Detekce mutací, na které je čip navržen
 Screeningová metodika
 Custom arrays – nutno ověřit Sangerovým sekvenováním
 Komerčně dostupné „diagnostické“ čipy
 Roche – platforma Affymetrix
 Cytochrom P450 – FDA approval, CE-IVD
 P53 v testování
 Není nutné ověřovat výsledek
 Jen 1 gen , ale velmi rychlé, „user friendly“ (protokol max 2 dny)
 APEX
 Dostupné čipy pro konkrétní geny + možný vlastní design
 Nutné ověřit sekvenací
 Research use only
ChIP-on-chip (Chromatin immunoprecipitation)
 Mapování vazby proteinů na DNA
 Např. transkripční faktory
MeDIP-chip (Methyl-DNA immunoprecipitation)
 Stejný princip – imunoprecipitace s protilátkou proti 5-metyl-cytosinu
Expresní čipy - princip
Buňky sledovanéBuňky kontrolní
Historie
 1987 Kulesh et al. - cDNA knihovna na papírovém filtru
 Přelom 80./90. - E. Southern – in-situ syntéza
oligonukleotidů
 1991 – Fodor et al. - světlem řízená paralelní syntéza
 1995 – Schena et al. - cDNA expresní microarray
 1996 – lidská cDNA microarray
 1997 – celogenomová (kvasinka)
- cDNA microarray
 1997 – celogenomová (kvasinka)
- oligonukleotidová microarray
Expresní čipy - typy
 Studium exprese mRNA (miRNA)
 Exonové (whole transcript)
 Cílené – konkrétní dráhy, diagnózy
 High- i low- density
 Sondy – krátké i dlouhé oligonukleotidy, cDNA
 Sklíčka, cartridge, mikrokuličky, membrány
 Jedno- a dvou- kanálové
Postup
 Izolace RNA
 Kvantita, kontrola kvality
 Přepis RNA
 Oligo-dT priming
 Kvalitní RNA
 3' biased sondy
 Random priming – hexa-, okta-, nona-mery
 I degradovaná RNA
 Celý transkript
 Značení - fluorescence
 Hybridizace, odmytí
 Skenování
 Analýza dat
 Zpracování obrazu
 Normalizace
 Klastrová analýza (supervised, unsupervised)
 Integrace s dalšími daty – gene ontology, genové interakce, funkční vztahy
Výsledky
 Identifikace genů
rozdílně exprimovaných
u konkrétních skupin
vzorků
 Ověření pomocí realtime
PCR
geny
vzorky
Využití
 Studium efektů stimulů na
genovou expresi
 Chemikálie (např. léčiva)
 Fyzikální faktory (záření)
 Gene knock-out (siRNAm, CRISPR)
 Genová transfekce (např.
transkripční faktory, mutantní alely)
 Studium rozdílů mezi vzorky
 Tkáně a orgány
 Diagnózy
 Studium biomarkerů – diagnostické,
prognostické, prediktivní
Využití
 Komerčně dostupné pro in vitro diagnostiku
 FDA cleared / IVDMA (In Vitro Diagnostic Multivariate Index
Assays)
 MammaPrint®
 Stanovení rizika metastázování po chirurgickém odstranění
nádoru prsu u pacientek v časných stádiích
 nízké riziko – hormonální terapie X vysoké riziko – agresivnější léčba
(chemoterapie)
 70 genů
 Tissue of Origin Test
 Identifikace původu nádorů – metastáze, nediferencované
nebo málo diferencované nádory
 > 2000 genů
 Řada dalších bez certifikace pro IVD (ColoPrint….)
Proteinové čipy
 Expresní
 stanovení přítomnosti a koncentrace
proteinů v komplexních vzorcích
 Protilátkové čipy
 Lyzátové čipy
 Antigen čipy
 Funkční
 studium interakce proteinů s jinými molekulami
 proteiny, peptidy, nízkomolekulární látky, oligosacharidy, DNA
Princip proteinových čipů
 Vazba protilátka-antigen - mikrospot ELISA (EnzymeLinked
ImmunoSorbent Assay)
 Systém využívající malé množství vázané protilátky a malého
objemu vzorku je citlivější než systém se stonásobně větším
objemem materiálu
 Citlivost řádově ve femtomolech - 106 molekul/ml
 Stanovení koncentrace analytu ve vzorku
 Koncentraci přímo odpovídá množství vázaného analytu
(Ekins RP, J Pharm Biomed Anal. 1989)
Princip proteinových čipů
 Stovky – tisíce proteinů imobilizovaných ve formě mikrospotů
na pevném povrchu
 membrány (polystyrenové, PVDF - polyvinyliden fluorid, nitrocelulosové)
 standardní mikroskopická sklíčka
 s chemicky modifikovaným povrchem (poly-lysin, aldehydické skupiny)
 potažená membránou
 kuličky
 Detekční metody
 Nejčastěji fluorescence
 Enzymaticky – značení alkalickou fosfatázou, křenovou peroxidázou
 Chemiluminiscence
 Radioaktivita
 Zvýšení signálu – značení biotinem – vazba na značený streptavidin
 Hmotnostní spektrometrie
Bead array - mikrosféry
 průměr ~ 10 μm (velikost lymfocytu)
 polystyrenové nebo latexové kuličky
 „kódovány“ rozdílnými barvami nebo velikostmi
 Detekce - např. flow cytometricky
 rozpoznávání rozdílně kódovaných mikrosfér
 identifikace a kvantifikace proteinů ve vzorku
 Množství stanovovaných proteinů je limitováno
počtem druhů mikrosfér (~1000)
 Značení Quantum dots - teoreticky až 40 000
 Možnost automatizace
 Využití – cílené – zejména detekce cytokinů,
ale např. i detekce fúzních proteinů a
onkoproteinů
 Luminex xMAPTM - otevřený systém
www.lucerna.chem.ch
Protilátkové čipy
 Přímý formát (FPA- forward phase
arrays)
 Na povrchu spotované protilátky
 Inkubace se vzorkem
 Detekce stovek antigenů ve vzorku
 Expresní profilování – „large-scale“
monitorování proteinové exprese
 Cílené na určité buněčné procesy
(buněčný cyklus, cytokiny…)
Lyzátové čipy
 Zpětný formát (RPA – reverse phase
arrays)
 Na povrchu spotované vzorky
(proteinové, tkáňové lyzáty, sérum)
 Inkubace se specifickými značenými
protilátkami
 Srovnání exprese až desítek antigenů
u stovek různých vzorků
 Nevýhoda – malá hustota
studovaných molekul ve spotu
– pre-frakcionace pomocí 2D kapalinové
chromatografie
Možnost
dvoubarevné
detekce
Vyšší citlivost
a specifita
Čipy pro stanovení antigenů
Xiaobo et al. 2010 Xiaobo et al. 2010
Sendvičová metodaPřímé značení
Čipy pro stanovení protilátek
Antigen čipy
 Na povrchu spotované známé antigeny
 syntetické proteiny, peptidy
 Inkubace se sérem obsahujícím studované protilátky
 Detekce přítomnosti protilátek ve vzorku, nejčastěji v séru
Xiaobo et al. 2010
Buněčné čipy
 Přímý formát
 Spotované protilátky
 Inkubace s buněčnou suspenzí
 „Transfekční čipy“ - buňky rostou na povrchu čipu s
naspotovanou cDNA
 Během růstu přijmou cDNA
 Čip se spoty buněk exprimujících různé cizorodé proteiny
 Detekce
 Přímo mikroskopicky na sklíčku
 Další charakterizace značenými protilátkami
Tkáňové čipy
 Varianta RPA čipů (zpětný formát)
 Spotují se celé vzorky tkání např.
bioptických
 Inkubace se značenými protilátkami
 Velikost spotu 0,6 - 2mm
Funkční čipy
 Studium interakce s jinými molekulami
 Inkubace s jinými proteiny, DNA, malými molekulami
(oligosacharidy, terapeutika, …)
 Studium posttranslačních modifikací
 Studium enzymatické aktivity
 Studium kofaktorů a inhibitorů
 Studium interakcí ligand-receptor
Spotovány nativní proteiny
 Potřeba zachování struktury a biologické aktivity
 Nespecifická vazba přímo na povrch
 Adsorpce
 Kovalentní vazba přirozených chemických skupin proteinu na upravený povrch
 Aktivní část proteinu může být schovaná, problém zachování konformace
 Chemoselektivní vazba – připojení chemické skupiny na
definovanou pozici proteinu → specifická reakce s
komplementární chemickou skupinou na povrchu sklíčka
 Orientovaná pozice na sklíčku
 Imobilizace přes specifický rekombinantní tag
 Zachování orientace, konformace, funguje jako „spacer“
Další typy funkčních čipů
 Doménové čipy
 Spotovány pouze jednotlivé domény proteinu
 Pochopení protein-proteinových interakcí
 Peptidové čipy
 Inkubace s proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy,
terapeutika, …)
 Čipy s chemickými knihovnami
 Inkubace s proteiny (enzymy, receptory…)
 Studium inhibitorů, studium ligand-receptorových interakcívyhledávání
terapeutik
Typ čipu Molekuly
imobilizované
na čipu
Stanovované
molekuly
Inkubace Počet
spotů
Použití
expresní protilátkové
(přímý
formát)
známé
protilátky
antigeny neznámý
vzorek proteinový
lyzát
 1000 proteinové
profilování
lyzátové
(zpětný
formát)
neznámý
vzorek -
proteinový
lyzát
antigeny známé
protilátky
1000 proteinové
profilování
antigen
čipy
známé antigeny protilátky neznámý
vzorek –
protilátky v
séru
1000 stanovení
přítomnosti
protilátek v
séru
funkční protein-
protein
známé proteiny
v nativním,
funkčním stavu
nebo peptidy,
nebo
chemické látky
partnerské
molekuly
interagující s
proteiny
nebo
proteiny
100 studium
interakcí
proteinů
s partnerským
i molekulami
proteinDNA,
RNA
protein-
nízkomolek
ulární látky
Enzym-
substrát
Využití
 Studium biomarkerů
 Identifikace terapeutických cílů
 Detekce autoprotilátek, studium imunitní odpovědi,
analýza alergenů
 In vitro diagnostika – více než
u ostatních typů čipů
 Nejčastěji diagnostika
autoimunitních onemocnění,
alergií
 Diagnostika infekčních
onemocnění
 Profilování biomarkerů
 Sepse a záněty
 Neurodegenerativní onemocnění
 Nádorová onemocnění
Využití
Cretich et al., 2014