doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 Obsah přednášky 1) Identifikace genů v genomu 2) Určení funkce neznámého genu 3) Studie transkriptomu a proteomu 4) Interakce protein-protein 5) Analýza mikrobiálních komunit 6) Příklady aplikací a výsledků Doporučená literatura Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition GENE CLONING & DNA ANALYSIS A odkazy na jednotlivé články Historická poznámka 1975 > První génom, fág O X 174 1995 > První buněčný génom, Haemophillus influenzae do roku 2001 > Kvasinky, Drosophilla, Caenorhabditis, Arabidopsis, Homo 21. století > Post-genomika neboli funkční genomika > Bioinformatika = molekulární biologie in silico O co jde? Hledáme pozice a funkce všech genů v genomu 1996 - S. cerevisiae má 6 000 genů, funkce známa u 3 600 z nich Zbytek odhalen in silico, ale ne u všech Jak identifikovat geny v genomu Znám sekvenci aminokyselin Znám sekvenci u polypeptidu? cDNA? ANO * NE Predikuji sekvenci genu Hledám ORF Hledání ORF OFR = open reading frame = otevřený čtecí rámec > dlouhá sekvence kodónů vyznačená iniciačním (obvykle, ale ne vždy ATG) a nesmyslnými (TAA, TAG, TGA) kodony > Prohledání je třeba udělat v 6 variantách! 1 ATG -> 2 TGA -> 3 G A C -> 5'- ATGACCAATGACATGCAT — 3' 3'- TACTGGTTACTGTACGTA— 5' <-G T A 4 <-C G T 5 <- A C G 6 Jak často se vyskytne v nahodilé sekvenci jeden z nesmyslných kodonů? 1) Kodonů je 43, tj. 64 2) Kterýkoli z nesmyslných kodonů se vyskytne 1 x za 64 kodonů, tj. 192 nukleotidů Délky ORF V nahodilé sekvenci nebude ORF delší než 30-40 kodonů a ne všechny budou obsahovat ATG > Průměrná délka genu u Escherichia coli\e 317 kodonů > Průměrná délka genu u S. cerevisiae\e 483 kodonů > Průměrná délka genu u člověka je 450 kodonů Bakteriální ORF Genomy bakterií jsou kompaktní, dlouhé ORF jsou zpravidla místy výskytu genů, krátké ORF (uzavřené čtecí rámce) nejsou geny Geny uzavřené čtecí rámce Eukaryotické ORF > mnoho intergenových oblastí - více krátkých ORF > exony, introny Jak odlišit gen od ORF? > Preference kodonů (codon bias) > Hranice exon-intron > Regulační sekvence proti směru transkripce > Hledání homologických sekvencí > Srovnání sekvencí s příbuznými genomy Preference kodonů > Některé aminokyseliny jsou kódovány více kodony - kodonové rodiny > Některé kodóny jsou ale využívány častěji než jiné, tzv. vzácné kodony > Jestliže některý ORF obsahuje vzácný kodón častěji, pak tento ORF pravděpodobně není gen Tabulky s preferencemi kodonů http://www.kazusa.or.jp/codon/ Podívejte se na tabulku preferenčních kodonů pro Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1) Jak často je využíván kodon AUG? 2) Který kodon je využíván nejčastěji? 3) Který kodon je využíván nejméně často? 1) AUG = 18,4% 2) GCC = 59,8% 3) UAA = 0,5% v _ Podívejte se na tabulku preferenčních kodonů pro Mycobacterium tuberculosis H37Rv Vypracujte tabulku četnosti využití jednotlivých kodonů v kodonových rodinách Podívejte se na tabulku preferenčních kodonů pro gen pro katalázu u Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1) Jak často je využíván kodon AUG? 2) Který kodon je využíván nejčastěji? 3) Který kodon je využíván nejméně často? 1) AUG = 0,0% 2) GCC = 67,6% 3) Řada kodonů 0,0%, řada 6,8% Hranice exon-intron > Tyto hranice se vyznačují přítomností tzv. konvenčních sekvencí Hranice lze hledat prostřednictvím NCBI > Saccharomyces cerevisiae PH05 > Zadejte v kategorii „gene" > Hranice hledejte v odkazu „Genomic context" - „MapViewer" Regulační sekvence proti směru transkripce > Konvenční sekvence jsou velmi variabilní, proto je použití tohoto nástroje poměrně problematické Hledání homologických sekvencí Předpokládá se, že pokud dva geny (z různých organismů), které mají podobné funkce, mají podobné sekvence, pak mají společný původ. S ohledem na degeneraci genetického kódu je vhodnější pracovat na úrovni sekvence aminokyselin > 20 aminokyselin oproti 4 nukleotidům znamená, že když se vyskytnout dvě stejné aminokyseliny je méně pravděpodobné, že jde o náhodu Srovnání homologie DNA-protein GAPGMWLRLAAGSFEHAG GGTGCACCCGGTATGTGACTGCGATTAGCAGCGGGATCATTTCAGCATGCAGGG * * ***** **** **** ** *** **** ***** *** ** **** ** * GATACACCCCGTAT T TGACAGCAAT T TGCAGGGGGATGAT TGCACCATGGAGCG DTPRIWEE PAGGWLHHGA Vypočítejte shodu (v %) pro sekvenci nukleotidů a sekvenci aminokyselin > Nukleotidové sekvence jsou shodné ze 76% (41/54) > Sekvence aminokyselin jsou shodné z 28% (5/18) Je daný ORF genem? Prohledáme databázi pomocí BLAST ^ Pokud je sekvence delší než 200 AA a je z 30% a více identická s jednou ze sekvencí v databázi, jsou tyto sekvence téměř jistě homologické a zkoumaný ORF je skutečný gen Srovnání sekvencí s příbuznými genomy > U příbuzných organismů existují homologické geny > ORF bez homologa zřejmě není gen, platí především pro krátké ORF Studovaný genom_ 1 krátký ORF Příbuzný genom 1 ORF chybí Komparativní genomika Výše popsaný způsob vyhledávání homologických sekvencí > Byl použit k umístění genů v genomu Saccharomyces cerevisiae > Následně i u dalších kvasinek - S. paradoxis, S. mikatae, S. bayanus Určení funkce neznámého genu > Určení homologie s genem, jehož funkce je známa > Bioinformatické studie > Metodami reverzní genetiky > Knock-outováním genu Bioinformatické studie > Zatím v počátcích > Na základě sekvence nukleotidů nebo aminokyselin lze predikovat přítomnost a-šroubovic a p-struktur a odhadnout funkci > Proteiny vázající se k membránám = a šroubovice > Zinkové prsty, svinutý helix, leucinový zip, otočka-helix-otočka = regulační proteiny Reverzní genetika Standardní genetika FENOTYP Identifikace a studium m u ta n tu Reverzní genetika 999 FENOTYP Reverzní genetika Standardní genetika > Gen zodpovědný za fenotyp je identifikován určením, které geny zodpovědné za mutantní fenotyp jsou v organismu inaktivovány > Získání mutantů (chemické mutageny, záření, přirozeně v populaci) > Křížení a stanovení genetické mapy > Bližší charakterizace molekulárně-biologicky Reverzní genetika > Výchozím bodem není fenotyp, ale gen > Vyvolání mutace v genu a identifikace výsledných fenotypových změn Knock-outování genu Deletovaná forma genu je využita k vyřazení funkční formy genu v organismu > Provede se homologickou rekombinací > Sleduje se změna fenotypu po knock-outu chromozomální DNA X X —I vektorová DNA rekombinace chromozomální DNA Knock-out u S. cerevisiae Deleční kazety nesoucí gen rezistence k ATB promotor kvasinky genR l-O-1-1-h R1 . R2 DNA vektoru vložení kvasinkové DNA do restrikčního místa R1 R1 I R2 R2 transformace kvasinkové buňky Knock-out u S. cerevisiae chromozómová kopie cílového genu X R1 R1 R2 R2 homologickou rekombinací dojde k přerušení cílového genu kopií genu rezistence exprese genu rezistence Studium transkriptomu Transkriptom je veškerá m RNA buňky a odráží celkový obraz genové exprese v této buňce Studium transkriptomu > Transkriptom může být velmi složitý > Může obsahovat stovky až tisíce různých mRNA > Klasický postup zahrnoval přípravu cDNA a její srovnání s genomovou DNA > Postup velmi zdlouhavý > Analýza sekvenováním > Analýza s využitím čipů Metoda SAGE serial analysis of gene expression > Nevyužívá cDNA, ale krátké 12 bp sekvence > mRNA jsou imobilizovány na celulózové kuličky s oligo (dT) 3'T T T--™^ I O + RNA I A A A T T T mRNA konverze na cDNA Metoda SAGE cDNA odstranění koncového fragmentu T T T A A A štěpení Alu\ T T T A A A linker s BamF\ (štěpí 10-14 bp) — T T T _ A A A štěpení BamF\ a odštěpení kotvičky Metoda SAGE A A A O shromáždění fragmentů, ligace s dalšími fragmenty -vznik katenanů a jejich sekvenování Po sekvenování lze jednotlivé sekvence odlišit, protože jsou odděleny místem BsmF\ http://www.sagenet.org/findings/index.html Metoda SAGE byla použita ke studiu transkriptomu S. cerevisiae ^ Cell 88, 243-251,1997 Nastupuje éra čipů 1) Všech 6 000 kvasinkových genů lze umístit na microarray 80 x 80 2) Alternativně lze využít DNA čipů na silikonu Příklad studia transkriptomů Studium transkriptomů 700 druhů mořských mikroskopických řas (včetně zástupců tzv. pikoplanktonu) Data volně dostupná > GenBank > Cyberinfrastructure for Advanced Mircobial Ecology Research and Analysis, CAMERA (http://camera.calit2.net/index.shtm) Smith D. (2012): Opinion: Learning from Transcriptomes. The Scientist, November 28, 2012. Studium proteomu Proteom jsou všechny proteiny buňky a odrážejí její biochemickou kapacitu Proč studovat proteom? DNA transkripce degradace <- RNA translace degradace <- protein .--^ posttranslační úpravy Transkriptom neodráží celou genovou expresi Jak studovat proteom? Separace proteinu > PAGE > Dvourozměrná gelová elektroforéza > Izoelektrická fokusace Identifikace proteinů po separaci > Hmotnostní spektrofotometrie > MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) > ICAT (isotope coded affinity tag) Studium interakcí protein-protein Poskytují další informace o aktivitě genomu Phage display > Vystavuje proteiny na povrchu bakteriofága > Testovaný protein je konfrontován s knihovnou takových fágů Yeast two-hybrid systém > Genová exprese S. cerevisiae nastává po interakci dvou transkripčních faktorů > Lze jím rozpoznat, jestli dva proteiny spolu interagují - pokud spustí expresi Phage display - příklady aplikací > 1994 Folgori - identifikace dvou epitopů na obalovém proteinu viru hepatitídy B - místo vhodné pro vývoj protilátek > 2008 Majumdar - vazebné vlastnosti membránového glykoproteinu gp41 viru HIV > 2002 Rosander - studium exprese extracelulárních bakteriálních proteinů -faktorů virulence - Staphylococcus, Lactobacillus,... Yeast two-hybrid system - aplikace > Interakce obalových proteinů viru hepatitídy C s lidskými proteiny exprimovanými z cDNA knihovny (2009) > Interakce viru SV40 s nádorovými antigény (1993) > Studium interakcí proteinů rodiny FemABX (rezistence k penicilinům) Staphylococcus aureus (2003) > Studium proteinů zodpovědných za pohyblivost Treponema pallidum (2009) Analýza mikrobiálních komunit Metagenomika Studium genetického materiálu z organismů získaných přímo v nějakém prostředí aniž by bylo třeba kultivovat a izolovat jednotlivé druhy > Vzorky z půdy > Mikrobiální společenstva trávicího traktu člověka Základní premisa metagenomiky > Většina mikrobiální diverzity se v průběhu kultivace ztratí - většinu bakterií neumíme kultivovat Koncept metagenomiky THE METAGENOMICS PROCESS mini Extract all DNA from microbial community in sampled environment mini DETERMINE WHAT THE GENES ARE (Sequence-based metagenomics) • Identify genes and metabolic pathways • Compare to other communities • and more... DETERMINE WHAT THE GENES DO (Function-based metagenomics) • Screen to identify functions of interest, such as vitamin or antibiotic production • Find the genes that code for functions of interest • and more... Metody metagenomiky > Sangerova metoda sekvenování - shotgun > Masivní paralelní pyrosekvenování a podobné techniky Pár historických poznámek I 1985 > Norman Pace započal se sekvenováním genů pro 16S rRNA (publikováno 1991) > Nyní se sekvenují všechny geny > Když se začalo se sekvenováním genů pro 16S rRNA, zjistilo se, že dokážeme kultivovat méně než 1% bakterií a archeí 1995 y Healy izoloval funkční geny z kolekce mikroorganismů ze senného nálevu 1996 > DeLong položil základy environmentálni fylogeneze na bázi 16S rRNA, vzorky z mořské mikroflóry Pár historických poznámek II 2002 > Breitbart a Rohwer objevili 5000 nových druhů virů ve 200 I mořské vody - shotgun sekvenování > Následně zjištěno více než tisíc druhů virů v lidské stolici, a zřejmě miliony druhů virů a fágů v 1kg mořských sedimentů 2003 > Craig Venter vedl Global Oceán Sampling Expedition (GOS) 2004 > Tyson a Banfield sekvenovali DNA z drenážního systému dolů - nekultivovatelné bakterie a archae Pár historických poznámek III 2005 > Schuster první sekvence získané pyrosekvenováním z environmentálních vzorků Shotgun sekvenování i Mímmi' .........n itni .....III! Illllll .....jim It..... ... ,111 Illllll llll 1111......Mill i......■...............II........minimi B iMimiiMiiin in i m n n 11 n 11 Mini........n m......lunu ..............» IMIIMM1MIM F iiiiiimmimmm........llillllMiilli.imilllllilliliiiii Odběr vzorků Filtrování částic Lyže buněk a extrakce DNA Klonování a konstrukce knihoven Sekvenování klonů Tvorba kontigu a skládání sekvencí Masivní paralelní sekvenování Pyrosekvenování > záznamy o délce 800 bp > paralelnost vede k sumě 200-500 Mbp lllumina a SOND > záznamy o délce 25-75 bp > paralelnost vede k sumě 20-50 Gbp Obrovské množství dat vyžaduje jejich specifické bioinformatické zpracování Příklady Metagenom kravského bachoru > 279 Gbp Metagenom lidského střeva > 567,7 Gbp > 3,3 milionu genů Problémy s kompletací výsledků > Repetitivní sekvence > Sekvence více druhů mohou být poskládány do falešných contigů Používané programy > Phrap > Celera Assembler > Velvet assembler Co metagenomika sleduje Predikce genů v mikrobiálních komunitách > Podle vnějších příznaků - porovnáním s již identifikovanými geny (BLAST) > Ab initio - nové geny identifikované podle regulačních oblastí a kódujících sekvencí Sledování diverzity druhů > Kolik druhů > V jakém poměru > Vyváženost množství jednotlivých druhů Ke všemu byly vyvinuty specializované programy Program GLIMMER Využívá Markovových modelů > Aplikace na Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori a další genomy > Umožnil lokalizaci teoreticky všech genů v genomu http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/ Salzberg et al. (1998): Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 2, 544-548 V co metagenomika vyúsťuje Studium metabolismu mikrobiálních společenství > S detailním využitím DNA čipů a analýz proteomu > Hledají se markery průběhu onemocnění Metatranskriptom > Sledování expresních profilů na úrovni mRNA > Teprve v počátcích Studium viromů > Virový metagenom První příklad metatranskriptomu > 2008 > Zemědělsky významný symbiont Sinorhizobium meliloti > Použita metoda py rose kve nová ní > Identifikovali 20 nových transkriptů mRNA Mao, Ch. (2008): Identification of new genes in Sinorhizobium meliloti using the Genome Sequencer FLX system. BMC Microbiology 2008,8:72 Aplikace metagenomiky I Medicína > Studium bakteriálních společenstev v různých částech lidského těla > Korelace složení mikrobiálních společenstev v těle a zdravotního stavu Biopaliva > Využití mikrobiálních společenstev při konverzi celulózy na etanol > Produkce metanu a vodíku > Vyhledávání účinnějších enzymů ve společenstvech Aplikace metagenomiky II Remediace > Monitorování vlivu polutantů na mikrobiální společenstva > Sledování mechanismů odbourávání kontaminantů Zemědělství > Interakce rostlina-mikroorganismus > Využití znalostí o využívání nutrientů pro zlepšení výživy rostlin > Sledování složení mikrobiálních společenstev v souvislosti se zdravím rostliny Aplikace metagenomiky III Biotechnologie > Hledání nových léčiv - nové geny, nové enzymy > Hledání nových chemikálií > Hledání nových agrochemikálií Human Microbiome Project http://commonfund.nih.gov/hmp/ Nasal > Cílem je charakterizovat mikrobiální společenstva z několika míst lidského těla -dýchací cesty, ústní dutina, kůže, gastrointestinální trakt, urogenitální trakt > Analyzovat úlohu těchto mikroorganismů v lidském zdraví a nemoci Individuální variabilita http://the-scientist.com/2012/06/13/microbial-menagerie/ > Od 242 zdravých dobrovolníků (18-40 let) odebrány vzorky z 18 tělních částí u žen a 15 u mužů > Pro některé tělní části existují charakteristické druhy > Některé druhy jsou „univerzálně" přítomny všude > Každý člověk si nese své individuální specifické kmeny jednotlivých druhů > Složení komunit je dlouhodobě stabilní > Nejrozmanitější komunity v ústech a střevě, nejchudší ve vagíně Individuální variabilita u CRISPR éj Co je to CRISPR? > RNAi analogický systém určený k degradaci virových NA > Popsaný v roce 2008 Vlastnosti CRISPR > Využívá interní „antivirové" sekvence začleněné v obrácených repeticích (CRISPR) > CRISPR = clusters of regularly interspaced short palindromic repeats > Po transkripci této sekvence dochází k jejich postupnému štěpení Cas proteiny > Výsledné produkty interferují s nukleovou kyselinou vstupujícího viru Brouns et al. (2008): Small CRISPR R N As Guide Antiviral Defense in Prokaryotes, Science 321,960-964 Struktura CRISPR Ke konci roku 2008 byly CRISPR popsány u asi 40% sekvenovaných eubakterií a téměř všech archeí Všechny obsahují krátké repetice o délce 24 až 48 nukleotidů a mezerník o přibližně stejné délce Marraffini a Sontheimer (2008): Science 322,1843 -1845 repetice mezerníky Edgar (2007): BMC Bioinformatics 8:18 CRISPR interference Viruses Immunity CRISPR/Cas systems Regulation 0 RNA target Viruses Chromosomal sequences (including prophages, transposons...) P. Horvath et al., Science 327,167-170(2010) Science Uaaa.s Individuální variabilita u CRISPR Known CRISPRs identified in reference genomes spacers repeats Whole-metagenome assembly De novo identification of CRISPRs in contigs Search repeats against short reads New CRISPRs not seen before Pooled reads that contain CRISPR repeats Assemble pooled datasets individually, one for each CRISPR More contigs that contain CRISPRs I Rho et al. (2012): Diverse CRISPRs Evolving in Human Microbiomes. PLoS Genetics 8 (6), e1002441 Co zjistili > CRISPR pochopitelně odráží zastoupení mikroorganismů > Sekvence mezerníků v CRISPR se mění podle toho s jakým infekčním agens se nositel potká > Distribuce CRISPR je specifická > Mezi jedinci se sekvence mezerníků v CRISPR liší > Liší se i CRISPR z různých míst stejného jedince Výzkum bakteriálních společenstev osídlujících lidský organismus zásadním způsobem posouvá naše znalosti o významu mikroorganismů především ve vztahu ^ mikroorganismus-lidské zdraví Bacteroides thetaiotaomicron? > Obsahuje 260 enzymů schopných zpracovat rostlinný materiál > Štěpí polysacharidy na glukózu a jiné lidským organismem zpracovatelné cukry Helicobacter pylori? > Reguluje aciditu žaludku > Reguluje hladinu ghrelinu, hormonu hladovění málo Helicobacterů? Bacteroides fragilis? > polysacharid A (PSA) je rozpoznáván dendritickými buňkami, které jej prezentují T lymfocytům - vznikají regulační T lymfocyty > regulační T lymfocyty tlumí prozánětlivé T lymfocyty Co přinesou nové objevy metagenomiky? The search for new major branches on the tree of life. Cultivation-independent methods, novel sequencing technologies, and analytical approaches can be directed toward the detection of life outside currently established domains. Pre-genomic era Cultivation-independent shotgun genomics Targeted approaches for finding new branches Microscopy Leeuwenhoek Discovery of first bacterium Next-generation sequencing WWW Large-scale assemblies of • Environmental nucleic acid sequence • Single cells lacking amplifiable rRNA genes rRNA-based Shotgun Single-cell Meta- Single-molecule molecular taxonomy metagenomics genomics transcriptomics sequencing Advanced analyses • K-mer • tRNA structure • Codon usage • Phylogeny • Detection of non-canonical bases Single-molecule sequencing of environmental nucleic acids Woese Discovery of first archaeon 1990 Woese Three domains V Synthetic life parallel ^r^h^xis^in^dojTiajns^ Is there a Jgu^hJr^mgirH T Woyke, and E M Rubin Science (2014);346:698-699 Science Hams Parasitic remnants of a fourth domain? Electron microscopy images of (A) pandoravirus dulcis particle and (B) acanthamoeba polyphaga mimivirus particle. T Woyke, and E M Rubin Science (2014);346:698-699 Další informace najdete http://dels-old.nas.edu/metagenomics/index.shtml > populární informace o metagenomice http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/ index.htm > výukový popisný materiál o metodách analýzy mikrobiálních společenstev Scientific American, June 2012 > populární článek o významu mikroorganismů sídlících v lidském těle Studium lidského mikrobiomu http://www.metahit.eu/ > Projekt 7.FP - Metagenomika lidského střevního traktu (2008-2012) http://www.nature.eom/nature/journal/v464/n7285/p df/nature08821.pdf > Informace o katalogu genů mikrobů z lidských střev http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id= microbiome-graphic-explore-human-microbiome > Interaktivně o některých klíčových druzích mikroorganismů v našem těle Články vycházejí denně © V. Braniste et al., "The gut microbiota influences blood-brain barrier permeability in mice," Science Translational Medicine, 6:263ra158, 2014. Shrnutí 1) Identifikace genů v genomu 2) Určení funkce neznámého genu 3) Studie transkriptomu a proteomu 4) Interakce protein-protein 5) Analýza mikrobiálních komunit 6) Příklady aplikací a výsledků