1
1
Trendy v analytické chemii
Membránové předseparační techniky v analytické chemii.
Elektricky indukovaný přenos iontů přes membrány a
jeho využití v analýze komplexních vzorků
Přednáška pro studenty MU v Brně, 11.11.2015
Pavel Kubáň (kuban@iach.cz)
Vedoucí Oddělení elektromigračních metod
Ústav analytické chemie Akademie věd ČR, v.v.i.
2
 Komplexní vzorky a jejich úprava
 Membránové techniky
 Elektricky indukovaný přenos iontů přes membrány
 Praktické aplikace
 Spojení se současnou analytickou instrumentací
 Shrnutí a výhledy
3
Úprava komplexních
vzorků
PrekoncentracePřečištění (Clean-up)
 Vliv matrice
 Vysoké konc. proteinů/
anorganických solí
 Zhoršený analytický výkon
 Poškození (otrava)
analytického systému
 Nízké koncentrace
analytů
 Analyty nejsou
detekovány
 Špatné kvantitativní
výsledky
4
Lidská plazma 1:1, esenciální amino kyseliny
6543210
migration time (min)
3 mV
1
2
3
5
Klasické metody pro úpravu komplexních vzorků
LLE – extrakce v kapalné fází (extrakce kapalina-kapalina)
SPE – extrakce tuhou fází


Automatizace (SPE)
Vysoká spotřeba organických rozpouštědel a biologických vzorků
Časová náročnost
Finanční nákladnost
Instrumentální vybavení
6
Membránové techniky pro úpravu komplexních
vzorků
Dialýza (MWCO membrány, dutá vlákna)
2
7
Ultrafiltrace (ploché membrány,
dutá vlákna)
8
Supported liquid membrane (SLM)
Nosič – porézní PP, PTFE (tloušťka 25 – 300 µm)
9
Liquid phase microextraction
membránadonor akceptor
A
M
A+
M
membránadonor akceptor
A+
M+
A+
M+
Difuze Electrický potenciál
Fázová rozhraní – membrány
10
Využití elektrického proudu pro úpravu vzorků
 Krátké extrakční časy
 Vysoké extrakční účinnosti
 Vysoká selektivita
 Jednoduchá instrumentace
 Volba membrány
 Elektrodové reakce
 Vysoký elektrický proud kolaps systému
?
?
!
11
ELEKTROMEMBRÁNOVÉ EXTRAKCE – EME
 LLE velké objemy organických rozpouštědel
 1996 – LPME (µL množství organiky)
Liu and Dasgupta, Anal. Chem. 68 (1996) 1817-1821
Jeannot and Cantwell, Anal. Chem. 68 (1996) 2236-2240
 Stabilita organické fáze
 1999 – HF-LPME (inertní polypropylenové duté vlákno)
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, Anal. Chem. 71 (1999) 2650-2656
 Dlouhé extrakční časy
 2006 – EME (zkrácení extrakcí použitím elektrického napětí)
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183-190
!
!
!
12
+
+ analyty
matrice
 Duté vlákno impregnované org. rozpouštědlem (~ 10 L) – SLM
 Laciné jednorázové extrakční jednotky (< 10 h/cm), není carry-over
 DC zdroj napětí (0 – 400 V)
 Donor (~ mL) a akceptor (~ 20 L) jsou vodné roztoky
++
akceptor
biologický
vzorek
1 – 2 mm
200 – 300 m
duté vlákno:
celková délka: 2 – 5 cm
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen, J. Chromatogr. A 1109 (2006) 183
ELEKTROMEMBRÁNOVÉ EXTRAKCE – EME
3
13
Parametry ovlivňující EME
 Složení kapalné membrány
 pH a složení akceptoru a donoru
 Elektrické napětí / proud
 Doba extrakce
 Míchání/třepání
14
EME bazických léčiv – modelový příklad
 SLM – NPOE
 Akceptor – 10 mM HCl
 Donor – v 10 mM HCl
 Extrakční doba – 5 min při 300 V
1 µg/mL
Pedersen-Bjergaard and Rasmussen J.Chromatogr. A 1109 (2006) 183
15 16
1 µg/mL
17
Srovnání LPME a EME bazických léčiv
Gjelstad et al. J.Chromatogr. A 1157 (2007) 38
18
EME za použití kapesní baterie – přenosný
extrakční systém
 SLM – ENB
 Akceptor – 10 mM HCl
 Donor – vzorky zředěné 10 mM HCl
 Extrakční doba – 5 min při 9 V
 Reálné vzorky – plazma, krev, moč
Eibak et al. J.Chromatogr. A 1217 (2010) 5050
4
19
Drop-to-drop EME
 SLM – NPOE
 Akceptor – 10 mM HCl
 Donor – vzorky zředěné 10 mM HCl
 Extrakční doba – 5 min při 15 V
 Reálné vzorky – plazma, moč
Petersen et al. J.Chromatogr. A 1216 (2009) 1496
A – spikovaná moč bez EME
B – spikovaná moč po EME
20
Mikročipová EME
Petersen et al. Microfluid Nanofluid 9 (2010) 881
a) PMMA – horní kryt
b) PP membrána
c) 50 µm kanálek
d) PMMA – základní struktura
21
Mikročipová EME
 SLM – NPOE
 Akceptor – 10 mM HCl
 Donor – vzorky zředěné 10 mM HCl
 Extrakční doba – 10 min při 15 V
 Reálné vzorky – moč
 FR donor = 3 µL/min
A – neupravená moč
B – moč spikovaná léčivy
C – moč spikovaná léčivy + EME
22
EME při konstantním elektrickém proudu
1. Faradayův zákon m =
A – electrochemický ekvivalent
2. Faradayův zákon A =
zF
Mm

tIA 
F = 96485 C mol-1
z – počet nábojů
n =
zF
tI


R
U
I =Ohmův zákon  Špatná reprodukovatelnost
EME (RSD až 30%)
23
EME bazických léčiv
Konstantní U (5 V)
Konstantní i (4 µA)
 SLM – ENB
 Akceptor – 10 mM HCl
 Donor – STD, moč v 10 mM HCl
 Doba extrakce – 5 min
CE-UV v 15 mM fosfátovém pufru (pH 2.9)
4.03.53.02.52.01.5
migration time (min)
10 mAU
RSD = 3 – 8%
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5
extraction time (min)
current(A)
1
2
3
4
5
4.03.53.02.52.0
migration time (min)
10 mAU
RSD = 7 – 15%nortriptyline
haloperidol
loperamide
24
RSD = 6 – 12%
RSD = 3 – 7%
Konstantní i (4 µA)
Konstantní U (5 V)
EME spikované moči při konstantním proudu
 Zlepšení reprodukovatelnosti
 Podobné výsledky pro ostatní analytické parametry
Linearita
LOD
 Vhodné zdroje konstantního proudu nejsou laciné
4.03.53.02.52.01.5
migration time (min)
10 mAU
nortriptyline
haloperidol
loperamide
Šlampová et al. J. Chromatogr. A 1234 (2012) 32
!
5
25
EME elektrickými pulzy
Rezazadeh et al. J. Chromatogr. A 1262 (2012) 214
26
fenolftalein, bezbarvý růžový při pH 8 – 10
0 s – 0 mC
60 s – 0.19 mC
120 s – 0.59 mC
180 s – 0.87 mC
240 s – 1.00 mC
300 s – 1.05 mC
0 s – 0 mC
15 s – 0.07 mC
30 s – 0.18 mC
45 s – 0.39 mC
60 s – 0.50 mC
90 s – 0.54 mC
120 s – 0.56 mC
180 s – 0.57 mC
0 s – 0 mC
30 s – 0.04 mC
60 s – 0.07 mC
120 s – 0.12 mC
180 s – 0.17 mC
300 s – 0.30 mC
360 s – 0.38 mC
420 s – 0.48 mC
V DI vodě V 1 mM HCl V 50 mM HAc
Q, F, Vd/a ~ 7 mM (H+/OH–)
Q, F, Vd/a ~ 4 mM (H+/OH–)
Q, F, Vd/a ~ 3 mM (H+/OH–)
EME a elektrolýza
Kubáň J. Chromatogr. A 1398 (2015) 11
27
40
30
20
10
0
extractionrecovery(%)
4035302520151050
extraction time (min)
procaine
nortriptyline
papaverine
12
10
8
6
4
2
0
pHvalue
4035302520151050
extraction time (min)
donor solution
acceptor solution
80
60
40
20
0
extractionrecovery(%)
4035302520151050
extraction time (min)
procaine
nortriptyline
papaverine
4
3
2
1
0
pHvalue
4035302520151050
extraction time (min)
donor solution
acceptor solution
Šlampová et al. Anal. Chim. Acta 887 (2015) 92
Špatně zvolený akceptor
1 mM HCl
Optimalizovaný akceptor
500 mM k. mravenčí
pKa ~ 9
pKa ~ 6
28
Vybrané aplikace EME v analýze
biologických, environmentálních a dalších
komplexních vzorků
29
EME léčiv proti závislosti na alkoholu a
opiátech v biologických vzorcích
Rezazadeh et al. J.Chromatogr. B 879 (2011) 1143
30
 SLM –NPOE/DEHP
 Akceptor – 100 mM HCl
 Donor – vzorky zředěné 10 mM HCl
 Extrakční doba – 20 min při 100 V
 Reálné vzorky – plazma, moč
6
31
EME peptidů v biologických vzorcích
 SLM – 1-octanol/DEHP
 Akceptor – 0.1 M HCl
 Donor – vzorky zředěné 0.1 M HCl
 Extrakční doba – 5 min při 50 V
 Reálné vzorky – plazma
Balchen et al. J.Chromatogr. A 1194 (2008) 143
A – STD při 300 V
B – STD při 0 V
32
EME amfetaminů v biologických vzorcích
 SLM – NPOE/TEHP
 Akceptor – 100 mM HCl
 Donor – vzorky zředěné 1 mM HCl
 Extrakční doba – 7 min při 250 V
 Reálné vzorky – moč
Seidi et al. J. Chromatogr. A 1218 (2011) 3958
A –moč spikovaná amfetaminy
B – moč uživatele amfetaminů
33
EME dekompozičních produktů nervových
bojových látek v environmentálních vzorcích
Xu et al. J. Chromatogr. A 1214 (2008) 17
 SLM – 1-oktanol
 Akceptor – DI voda
 Donor – vzorky zředěné DI
 Extrakční doba – 30 min při 300 V
 Reálné vzorky – env. vody
(a) – STD
(b) – říční voda spikovaná
fosfonovými kyselinami
34
EME těžkých kovů ve vzorcích vod a
biologických vzorcích
5.04.54.03.53.0
migration time (min)
2 mV
Mg2+ Mn2+ Cd2+ Zn2+ Pb2+
Co2+
Cu2+ Ni2+
1 M HMs po EME
Kubáň et al. Electrophoresis 32 (2011) 1025
 SLM – 1-oktanol/DEHP
 Akceptor – 100 mM HAc
 Donor – vzorky zředěné DI
 Extrakční doba – 5 min při 75 V
 Reálné vzorky – kohoutková voda,
kojenecká strava
35
Analýza zinku pomocí EME a CE-C4D
3.53.02.52.01.5
migration time (min)
5 mV
a
b
c
Ca2+/Na+/Mg2+
Zn2+
3.53.02.52.01.5
migration time (min)
2 mV
Ca2+/Na+/Mg2+
K+
Zn2+
b
a
+ 2 M Zn2+
MP 1:50
+ 10 M Zn2+
+ 5 M Zn2+
TW
Kohoutková
voda
Mléko v
prášku
(kojenecká
strava)
36
 Endogenní koncentrace ~ 100 M
 Koncentrace při metabolických poruchách (MSUD ~ 500 M)
(PKU ~ 350 – 1500 M)
EME amino kyselin v tělních tekutinách
 SLM – ENB/DEHP
 Akceptor – 2.5 M kys.octová
 Donor – vzorky zředěné 2.5 M kys. octovou
 Extrakční doba – 10 min při 50 V
 Reálné vzorky – sérum, plazma, krev, moč
7
37
1210864
migration time (min)
0.3 mV
12 34 5 6 7 8 9 10 11 12sérum
MSUD – rozvětvené amino
kyseliny (Val, Leu, Ile)
1210864
migration time (min)
0.5 mV
12 34 5 6 7 8 9 10 11 12krev
PKU – fenylalanin (Phe)
CE-C4D v 2.5 M kys. octové
Strieglerová et al. J. Chromatogr. A 1218 (2011) 6248
EME amino kyselin v tělních tekutinách
38
EME shrnutí
• Clean-up a prekoncentrace v jednom kroku
• ~ 10 L organického rozpouštědla/analýza
• Jednorázové extrakční jednotky
• Krátké extrakční časy
• Vysoká selektivita SLM
• Vhodné pro biologické vzorky
• Volba SLM
• EME parametry
!
!
39
Spojení membránových předseparačních technik
se současnou analytickou instrumentací
Extrakce a následná analýza off-line
40
1. On-line spojení SLM s HPLC
Lindegard et al. Anal. Chem. 66 (1994) 4490
Objem akceptorováho kanálku ~ 10 µL
41
Stanovení bazických léčiv v plazmě
I – Amperozide
II – metabolit Amperozidu
III – neznámá látka příbuzná Amperozidu
42
2. On-line spojení SLM s GC
Shen et al. Anal. Chem. 70 (1998) 946
8
43
3. On-line spojení SLM s CE
Palmarsdottir et al. Anal. Chem. 69 (1997) 1732
(a) – STD
(b) – plasma
A – IS
B – bambuterol
44
4. On-line spojení ED s CE
Buscher et al. J. Chromatogr. A 788 (1997) 165
45
On-line spojení ED s CE – stanovení inositol trifosfátů
A – bez ED
B – po ED
46
Nozal et al. Electrophoresis 27 (2006) 3075
5. On-line spojení SLM s komerční CE – Beckman
47
Stanovení nitroimidazolů v játrech
1 – metronidazole
2 – ronidazole
3 – dimetridazole
A – vzorek
B – spikovaný vzorek
48
6. On-line mikročipová EME
 SLM – 0.2 µL NPOE
 Akceptor – 100 mM HCOOH
 Donor – vzorky zředěné 10 mM HCl
 Extrakční doba – 10 min při 15 V
 Reálné vzorky – moč
 FR donor = 9 µL/min
 FR akceptor = 0 - 3 µL/min
Petersen et al. Anal. Chem. (2011) 44
9
49
On-line monitorování metabolismu amitriptylinu
50
4.44.24.03.83.63.4
migration time (min)
0.2 mV
Chol
Crea
Orn
Lys
Arg
His
sérum
plasma
C4D
C
Pt Pt
h
HV
6.05.04.03.0
migration time (min)
3 mV
sérum
mat. mléko
SCN-
ClO4
Kubáň
et al. Electrophoresis 33 (2012) 2695
Aplikace
Extrakce ~ 0 – 10 min
8. In-line spojení jednorázové SLM s lab-made CE
Kubáň and Boček J. Chromatogr. A 1234 (2012) 2
51
Elektroda Kapilára
Vialka
Pružinka
Donor
SLM
Akceptor
 SLM ~ 5 µL organického rozpouštědla
 Objem vzorků – 10 – 40 µL
 Jednorázové mikroextrakční jednotky!!!
Akceptor
Donor
SLM
Extrakce Dávkování
9. In-line spojení SLM mikroextrakcí
s komerční CE
52
30
20
10
0
mAU
1.61.41.21.00.80.60.4
migration time (min)
10 mM
1 mM
blank
neředěné sérum – zdravý jedinec
formát
LOD: 30 µM neředěné sérum,
35 µM neředěná plná krev
Normální hodnoty: 0 – 0.4 mM
Otrava metanolem: 1 – 40 mM
 10 mM vážné zdravotní následky
Stanovení formátu v lidském séru a plné krvi
chlorid
20 mM
80
60
40
20
0
mAU
1.61.41.21.00.80.60.4
migration time (min)
formát
chlorid
neředěné sérum – pacient po intoxikaci metanolem
10.4 ± 0.4 mM
Pantůčková et al. J. Chromatogr. A 1299 (2013) 33
Celková doba analýzy: ~ 4 min!!!
 Support: PP fólie (100 µm)
 SLM: 10 µL MeOH
 Donor: surové sérum, plná krev
 Akceptor: DI voda
 Objem: 10 µL
 Doba extrakce: 60 s !!!
53
Polymerně inkluzní membrány (PIMs)
Základní polymer – Cellulose triacetate (CTA)
Plasticizér – 2-nitrophenyloctyl ether
Iontový nosič – Aliquat 336
PIM – suché, homogenní, neporézní
500 nm
Výsledná PIM:
60% (w/w) CTA
40% (w/w) Aliquat 336
Rozpustit v dichlormetanu a odpařit
Schow et al. J. Membr. Sci. 111 (1996)
54
Determination of formate in blood after methanol poisoning
Extrakce přes PIM Spojení s CE CE-C4D analýza surového séra
2.52.01.51.00.5
migration time (min)
13 mV
čerstvá PIM
30 dní stará PIM
90 dní stará PIM
formate
chloride
Dlouhodobá
funkčnost PIM
Jednorázové mikroextrakční
zařízení pro klinické aplikace?
Pantůčková et al. Anal. Chim. Acta 887 (2015) 111
Celkový čas ~ 7 min
10
55
10. Volné kapalné membrány (FLM)
OD1.6mm
ID1.0mm
donor FLM akceptor
Celková délka 20 mm
donor FLM akceptor
PFA hadička
 Extrakční jednotky – PFA, PTFE, FEP hadičky (ID 0.5 – 1.0 mm)
 Minimální spotřeba rozpouštědel/vzorku (350 nL – 1.5 µL/extrakce)
 Laciné, jednorázové extrakční jednotky (~ 1 kč/cm), eliminace sample carry-over
 Stabilní a precizně definované fázové rozhraní
56
µ-EME přes volné kapalné membrány
0 s
60 s
120 s
180 s
240 s
300 s
0 s
5 s
15 s
30 s
60 s
120 s
300 s
Anionty Kationty
 LM: 1.5 µL 1-pentanol
 Donor: SPADNS a crystal
violet
 Akceptor: DI voda
 Objem: 1.5 µL
 Extrakční napětí: 100 V
 Extrační čas: 5 min
+
GND GND
-
57
µ-EMEs přes volné
kapalné membrány
Princip µ-EME
Základy EME
Donor: SPADNS3- v DI vodě
Akceptor: DI voda
FLM: 1-pentanol
Napětí: 100 V
Čas: 3 min
Objemy: 1.5 µL
Donor: fenolftalein v 1 mM HCl
Akceptor: DI voda
FLM: 1-pentanol
Napětí: 100 V
Čas: 3 min
Objemy: 1.5 µL
58
12
10
8
6
4
2
0
electriccurrent(A)
300250200150100500
extraction time (s)
µ
1 mM SPADNS
100 µM SPADNS
10 µM SPADNS
DI water
12
10
8
6
4
2
0
electriccurrent(A)
300250200150100500
extraction time (s)
µ
1 mM crystal violet
100 µM crystal violet
10 µM crystal violet
DI water
Průběh µ-EME – záznam proudových hodnot
59
20
15
10
5
0
UVabsorbance(mAU)
3.02.52.01.51.00.50.0
migration time (min)
Standard
Moč
Sérum
kreatinin
nortriptyline
haloperidol
loperamide
µ-EME bazických léčiv přes volné kapalné membrány
 LM: 1.5 µL ENB
 Donor: surová moč a
sérum + 20 ug/mL léčiv
 Akceptor: DI voda
 Objem: 1.5 µL
 Extrakční napětí: 100 V
 Extrační čas: 5 min
60
SHRNUTÍ A VÝHLEDY
 Membránové techniky jsou ekologické, laciné, rychlé a
efektivní
 Elektrický proud je vhodný pro úpravu komplexních
vzorků
 Výsledný akceptor je možno dávkovat do běžných
analytických systémů
 On-line a in-line spojení je velice atraktivní