Monolity v separačních technikách
Dana Moravcová
Ústav analytické chemie AV ČR, v. v. i., Brno
 Alternativa k náplňovým kolonám
 Charakteristická struktura
- zcela zaplňuje vnitřek separačního prostoru
??? monolitické materiály
Silikagelový monolit
Kolona plněná 5 µm částicemi
Monolit v čipu - (A, B) – nemodifikovaná
a (C, D) modifikovaná stěna čipu.
D. A. Mair, Lab Chip 9 (2009) 877–88.
 Monolit - porézní materiál – bimodální distribuce pórů
 Makropóry > 50 nm, průtokové póry
 Mezopóry 2-50 nm, plocha pórů
 Mikropóry < 2 nm
 Materiálové inženýrství
 Průměrná velikost pórů - rtuťová porozimetrie
 Specifický povrch - adsorpční/desorpční izoterma dusíku
 Infračervená spektroskopie - přítomnost funkčních skupin
 Elementární analýza
 Fotografie - elektronový mikroskop
 Chromatografie
 Permeabilita, porozita
 Účinnost
 Selektivita
 Doba analýzy
Charakterizace monolitických materiálů
 Monolit - porézní materiál – bimodální distribuce pórů
 Makropóry > 50 nm, průtokové póry
 Mezopóry 2-50 nm, plocha pórů
 Mikropóry < 2 nm
Charakterizace monolitických materiálů
 Permeabilita kolony
 Kozeny-Carmanova rovnice
2F
F L
K
p r


 

  
0 3
0
180
(1 ) F
p
K
d 

  01000 ( , 0.4)p Fd K ODS   
Fm – objemový průtok mobilní fáze kolonou, η – viskozita mobilní fáze, Δp – tlak na koloně, L – délka
kolony, ε0 – mezičásticová (průtoková) porozita, r – poloměr kolony, dp, - průměr zdánlivé částice kolony
 Monolit - porézní materiál – bimodální distribuce pórů
 Makropóry > 50 nm, průtokové póry
 Mezopóry 2-50 nm, plocha pórů
 Mikropóry < 2 nm
Charakterizace monolitických materiálů
 Porozita
 Celková porozita
 Mezičásticová porozita (makropóry)
 Vnitřní porozita (mezopóry) 0
0
 

 T
C
TO
i
V
VV
CV
V0
0 
C
TO
T
V
V

VTO – mrtvý objem kolony (toluen - ISEC), V0 – eluční objem polystyrenového standardu s nejvyšší
molekulovou hmotností, VC – geometrický objem kolony.
t R,j
t M
w 1/2,j
analyt j
inert
 Účinnost kolony
- počet teoretických pater (n)
 N – počet teoretických pater
na metr kolony
 Výškový ekvivalent teoretického patra
l – délka kolony
 Retenční faktor k
2
,2/1
,
545.5









j
jR
w
t
n
l
N
H 
M
MjR
t
tt
k


,
Účinnost kolony, retenční faktory
 1967 - separace proteinů na koloně plněné poly(etylen glykol
metakrylátem) - elastický gel - gelová filtrace, malá průchodnost gelu a
nízká účinnost (M. Kubín).
 70. léta - kolony obsahující polyuretanové pěny - použití v GC a LC,
nedosahují kvalit v té době používaných chromatografických médií (W. D.
Ross, R. E. Sievers).
 80. léta - stlačené hydrofilní polyakrylamidové gely - separace proteinů iontová
výměna (Hjertén).
 90. léta - makroporézní rigidní monolitické materiály na bázi metakrylátů
a polystyren-divinylbenzenu (F. Švec, J. M. J. Fréchet) - separace
proteinů; monolitické kolony na bázi silikagelu (K. Nakanishi, N. Soga, N.
Tanaka).
Historie
 Techniky – HPLC, CEC, GC, mikrofluidní systémy, extrakce, enzymové
reaktory, heterogenní katalýza
 Separační módy – RP, IEC, NP, HILIC, chirální separace, bioafinitní
chromatografie
 Stlačené hydrofilní gely (UNO, BioRad)
 Kolony (Chromolith, Merck; Monoliths, LC Packings; Swift, ISCO)
 Polymerní makroporézní disky, tubulární kolony (CIM Disk, CIM Tube, BIA
Separations)
 Kapiláry – C18-silikagel (Merck, Phenomenex), PS-DVB (Thermo Fisher
Scientific)
12 mm x 3 mm
Současnost
 cLC – laminární tok
 Monolity účinnost
 10 000-40 000 ptp/m v LC
 přes 100 000 ptp/m v CEC
p
Anoda Katoda
HPLC
CEC
Kolony pro kapilární separační techniky
 CEC – elektroosmotický tok
 Náplňové
 Monolitické
 Anorganické monolity
 Polymerní monolity
 Vodné prostředí
 Prostředí organického rozpouštědla
 Silikagelové částice; modifikace
 Modifikovaný silikagel
 TiO2, ZrO2, HfO2
 Stlačené hydrofilní gely (akrylamid)
 Hydrofilní gely (akrylamid)
 Polystyrenové monolity
 Akrylátové a metakrylátové monolity
Ideální monolitický sorbent – rigidní materiál, vhodné chemické, fyzikální a mechanické
vlastnosti, permanentní porozita, stabilní v suchém stavu, odolává vysokým a nízkým
hodnotám pH.
Kolony pro kapilární separační techniky
 Silikagelové monolity
 Tetraalkoxysilan - tetramethoxysilan
 Polyetylenoxid (Mr 10 000)
 Kyselina octová
 Hydrolýza
≡Si-OR + H2O → ≡Si-OH + ROH
 Kondenzace alkoholu
≡Si-OH + RO-Si≡ → ≡Si-O-Si≡ + ROH
 Kondenzace vody
≡Si-OH + HO-Si≡ → ≡Si-O-Si≡ + H2O
Několik kroků přípravy – polymerace, promývání, sušení, kalcinace +
modifikace na požadovanou stacionární fázi.
Monolitické materiály
Silikagelový monolit
 Polymerní monolity
 Monomery (styren; GMA, BMA, LMA)
 Síťovací činidlo (divinylbenzen; EDMA)
 Porogen (organická rozpouštědla)
 Iniciátor polymerace – termální (AIBN) x UV (AIBN, 2,2-dimetoxy-2-fenyl-
acetofenon)
Monomery Síťovací činidlo
Monolitické materiály
 Modifikace základního monolitu – morfologie kolony zachována
 Chemická modifikace – derivatizace funkčních skupin na povrchu monolitu
 „Grafting“ – na povrch monolitu se radikálovou polymerací navazují řetězce
funkčních monomerů
 Imobilizace nanoobjektů – ovlivnění selektivity, zvýšení povrchu stacionární
fáze
 Použití vhodného prekurzoru pro přípravu monolitu – „one pot“
 Optimalizace složení směsi a podmínek přípravy
Monolitické stacionární fáze - příprava
 C18 - silikagelový monolit
CH3(CH2)16CH2Si (CH3)2Cl CH3(CH2)16CH2Si (CH3)2NH
Diethylamin
Toluen
Izokratická separace alkylbenzenů
(benzen - hexylbenzen, n = 0-6).
Mobilní fáze 80% ACN/voda, Fc 500 nl/min,
UV detekce 254 nm.
Kolona: silikagelový monolit – C18 (150 x 0,1mm).
0
1
2 3
4
5
6
Modifikace monolitu - chemická
Dimethyl-octadecylchlorosilane
 HILIC - A. J. Alpert, J. Chromatogr. A 499 (1990) 177.
 Mobilní fáze: 40-97% ACN - voda nebo pufr.
 Separace vysoce polárních látek – léčiva, peptidy, karbohydráty, nukleové
báze, nukleosidy, nukleotidy, atd.
 Příprava kolony
 1 – monolitická silika – tetramethoxysilan,
PEG 10 000, močovina, kyselina octová.
 2 – modifikace 3-trimethoxysilylpropyl
methakrylátem
 3 – modifikace [2-(methacryloyloxy)ethyl]-
dimethyl-(3-sulfopropyl)-hydroxidem
amonným – polymerace, 80°C, 3 hod.
D. Moravcová et al., J. Chromatogr. A 1270 (2012) 178– 185.
Modifikace monolitu – „grafting“
Připravená stacionární fáze.
Látka H [µm] N [tp/m] k u [mm/s]
Toluen 5.7 175 500 --- 1.5
Uracil 6.4 156 000 0.29 0.7
Cytosin 5.5 182 000 1.01 1.0
H-u křivka – monolitická kapilární
kolona (150 mm × 0.1 mm).
Mobilní fáze: 90% (v/v) ACN/ 10%
5mM octan amonný pH=6;
detekce UV 210 nm.
 – toluen
 – uracil
 – cytosin
Tabulka 1: Separační účinnost monolitické kapilární kolony.
Účinnost separace
D. Moravcová et al., J. Chromatogr. A 1270 (2012) 178– 185.
Porovnání HILIC separace nukleových
bází, nukleosidů a deoxynukleosidů na
silikagelové (A) a modifikované (B)
kapilární koloně.
Mobilní fáze: 95% (v/v) ACN/ 50 mM
mravenčan amonný, pH = 4.5,
Fc = 0.5 µl/min; detekce UV 210 nm.
Látky:
toluen (t0)
(1) Thymin
(2) Uracil
(3) 2-Deoxyuridin
(4) 5-Methyluridin
(5) Adenosin
(6) Uridin
(7) Cytosin
(8) 2-Deoxycytidin
(9) Cytidin
(10) 2-Deoxyadenosin
(11) Adenin
Uracil Thymin
D. Moravcová et al., J. Chromatogr. A 1270 (2012) 178– 185.
Modifikace monolitu - chemická
Et2NH
Na2CO3
Et2SO4
NO2CH3
t
t
Ph3P
H2O
t
NaN3
NaHSO3
H2O
LiCl
NaSH
(Ph3SiSH)
Separace kationtů
Kolona 150 x 0.25 mm;
mobilní fáze 10 mM CuSO4;
Fc 3 μL/min;
nepřímá UV detekce 210 nm.
Y. Ueki et al., Anal. Chem., 2004, 76 (23), pp 7007–7012.
 Iontově výměnná chromatografie – poly(GMA-EDMA ) monolit
Modifikace monolitu - chemická
5.5 μequiv/mL 25.4 μequiv/mL 151 μequiv/mL
Kapacita kolony
1M Na2SO3
W. Wieder et al., J. Sep. Sci. 2006, 29, 2478 – 2484.
Modifikace monolitu - chemická
Separace nukleotidů
Kolona 65 x 0.2 mm; mobilní fáze, (A) 20 mM
KH2PO4, 20% ACN, pH 8.0, (B) 1 M NaCl v A;
gradient, 0–4% B v 1 min, 4–15% B ve 2 min, 15–
25% B ve 3 min, 25–50% B ve 4 min; UV detekce
260 nm; Fc 2.0 µL/min.
Látky:
1 - CMP; 2 - AMP; 3 - ADP; 4 - GMP; 5 - CDP;
6 - UTP; 7 - CTP; 8 - ATP; 9 - GTP.
 Iontově výměnná chromatografie – poly(GMA-DVB) monolit
Et2NH
Na2CO3
60°C
Et2SO4
NO2CH3
50°C
 Použití vhodného prekurzoru při přípravě – „one pot“
 RP separace (BMA, LMA)
 HILIC
 Chirální stacionární fáze
Modifikace monolitu
 Podmínky polymerace - UV
iniciace (vlnová délka, čas,
teplota); termální iniciace
(teplota, čas).
 Složení polymerační směsi
 Monomer / Porogen
 Monomerní část – EDMA / BMA
 Porogenní část – BuOH / PrOH
Iniciátor – azobisisobutyronitril,
1% hm. z monomerní části směsi
Kolona 1 2 3
Porogen 60 60 60
Monomer 40 40 40
BMA 44.5 44.5 44.5
EDMA 54.5 54.5 54.5
PrOH 60 62 64
BuOH 30 28 26
Voda 10 10 10
% hm.
Ovlivnění struktury a chromatografických vlastností
monolitu
D. Moravcová et al., J. Sep. Sci. 2004, 27, 789–800.
A - Inertsil ODS-2, 5 mm, 150 x 0.32 mm, Metachem, Torrance, USA
B - Biospher C18E, 5 mm, 141 x 0.32 mm, Labio Praha, Česká republika
C - Chromolith CapRod RP-18e, 150 x 0.1 mm, Merck, Darmstad, Německo
Kolona 1 2 3 A B C
KF [cm2] 7.79E-10 2.38E-10 3.52E-11 2.25E-10 1.47E-10 8.66E-10
dperm [m] 7.6 3.8 1.9 7.2 5.6 5.1
Kolona 1 2 3 A B C
εT 0.710 0.680 0.650 0.590 0.650 0.847
εo 0.490 0.470 0.410 0.310 0.290 0.680
εi 0.220 0.210 0.240 0.280 0.360 0.167
 Permeabilita
 Porozita
D. Moravcová et al., J. Sep. Sci. 2004, 27, 789–800.
Porozita a permeabilita připravených kolon
1) 2) 3)
Podmínky separace: 70% ACN, 30% voda, UV detekce 254 nm,
Fc = 2 µl/min, kolony 0.32 mm I.D., l1,l2 = 240 mm, l3 = 140 mm.
5 m 5 m 5 m
Látky:
0 – uracil (nezadržovaná
látka)
1 – benzylalkohol
2 – benzaldehyd
3 – benzen
4 – toluen
5 – ethylbenzen,
6 – propylbenzen
7 – butylbenzen
8 - amylbenzen
Kolona 1 2 3
kTOL 1,19 1,13 1,30
NTOL 4270 21860 30380
kAB 3,03 2,81 3,47
NAB 2090 9680 22110
Separace nízkomolekulárních látek
D. Moravcová et al., J. Sep. Sci. 2004, 27, 789–800.
Separace proteinů na CIM disku (a) a na monolitické kapilární koloně (b)
Mobilní fáze: A - voda + 0.15 % TFA, B – ACN + 0.15 %TFA, gradient 20 - 80 % B v 6 min.
UV detekce 214 nm (ACN – acetonitril, TFA – trifluoroctová kyselina)
CIM disk (styren-divinylbenzen): 3 x 16 mm, Fc = 3 ml/min
Monolitická kapilární kolona poly(BMA-EDMA): 170 x 0.32 mm, Fc = 25 µl/min
b)a)
Analyty:
0 – uracil
1 - insulin
2 – trypsin
3 – BSA
4 – lactoferrin
Separace proteinů
Kolona SB EDMA Monomery Porogen εT
1 43 57 30 70 0.840
2 43 57 32.5 67.5 0.762
3 43 57 33.25 66.75 0.740
4 43 57 34 66 0.713
5 43 57 35 65 No
6 43 57 50 50 No
7 53 47 33.25 66.75 0.775
8 33 67 33.25 66.75 0.724
Mobilní fáze: 5 mM mravenčan amonný pH 3.0 v ACN/H2O
(95/5, v/v). Poly(SPE-co-EDMA) kolona 285 x 0,1mm;
Fc 800 nl/min; UV detekce 214 nm.
Látky: (1) toluen; (2) metakrylamid (3) akrylamide;
(4) thymin; (5) uracil; (6) adenin; (7) thiomočovina;
(8) cytosin.
J. Zhengjin et al.; Anal. Chem. 2007, 79, 1243-1250.
Modifikace monolitu – „one pot“
HILIC separace bází a neutrálních látek
AIBN
MeOH
60°C
12 hod
Příprava 2,3,6-tris(phenylcarbamoyl)-β-CD-6-methakrylátu
M. Ahmed, A. Ghanem, J. Chromatogr. A 1345 (2014) 115-127.
Chirální stacionární fáze – příprava monomeru Chirální stacionární fáze - syntéza
M. Ahmed, A. Ghanem, J. Chromatogr. A 1345 (2014) 115-127.
Kolona 250 x 0,150 mm; mobilní fáze: metanol/voda (0.1% TFA) 10:90 v/v, UV detekce 254 nm,
Fc 0.3 μL/min.
CeliprololPropranolol
Chirální separace racemátů
M. Ahmed, A. Ghanem, J. Chromatogr. A 1345 (2014) 115-127.
Brno, 2. 12. 2015
Mgr. Jana Krenkova, Ph.D.
Nanoparticle modified organic polymer-based
monolithic materials
Control of surface chemistry
• Preparation from functional monomers
• polymerization
• grafting
F. Svec, J. Chromatogr. A 2010, 1217, 902–924
Control of surface chemistry
• Modification of reactive monoliths
F. Svec, J. Chromatogr. A 2010, 1217, 902–924
• Attachment of nanomaterials
Control of surface chemistry
Why nanomaterials?
selectivity – chromatography, sample preparation
surface area
ligands for immobilization of bioactive molecules
Nanomaterials
materials of which a single unit is sized (in at least one dimension)
between 1 and 100 nanometers
Modification of monoliths with nanoparticles
simple and straightforward approach
distribution of NPs throughout the monolithic matrix
limited accessibility of NPs for desired interactions
• embedding (encapsulation) of NPs in the monolithic matrix
• attachment of nanoparticles to the surface of preformed monoliths
multistep approach
independent optimization of individual steps
improved accessibility of NPs for desired interactions
Latex nanoparticles
monolith:
poly(BMA-co-EDMA-co-AMPS)
Hilder et al., J. Chrom. A 2004 1053, 101
Ion exchange chromatography - carbohydrates
BMA – butyl methacrylate, EDMA – ethylene dimethacrylate,
AMPS - 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid
latex particles (60 nm diameter) with
tertiary amine functionality
Peaks: d(+)galactose (1), d(+)glucose (2),
d(+)xylose (3), d(+)mannose (4), maltose (5),
d(−)fructose (6), sucrose (7).
Gold nanoparticles
Colors of various sized
monodispersed gold
nanoparticles
HAuCl4 + trisodium citrate dihydrate
Au+3 ions are reduced to neutral gold atoms, where citrate
ions act as both a reducing agent and a capping agent.
Citrate synthesis
Gold nanoparticles
cystamine
TCEP
gold nanoparticles
attachment
Y. Lv et al. J. Chromatogr. 2015, 1261, 121
1 mm
Gold nanoparticles
Cys-GMA monolith
functionalized with
15 nm gold nanoparticles
Gold nanoparticles
Cao et al., Anal. Chem. 2010, 82, 7416-7421
Thiol-containing peptide enrichment
Ligand exchange - various chromatographic modes
ion exchange
reversed-phase
Peaks:
myoglobin (1)
ribonuclease A (2)
cytochrome c (3)
Gold nanoparticles
Lectin immobilization
Erythrina cristagalli lectin - galactose-selective lectin (ECL)
H. Alwael et al. Analyst 2011, 136, 2619
Gold nanoparticles
Lectin immobilization
Erythrina cristagalli lectin - galactose-selective lectin (ECL)
Peaks:
(1) ribonuclease B
(2) insulin chain B
(3) insulin
(4) cytochrome C
(5) desialylated transferrin
(6) BSA
(7) carbonic anhydrase
(8) Enolase
(9) desialylated thyroglobulin
before extraction
after extraction
after a galactose wash step
RP-LC/UV separation
of protein mixture
H. Alwael et al. Analyst 2011, 136, 2619
Fullerenes
[6,6]-phenyl-C61-butyric acid 2-hydroxyethylmethacrylate ester
molecule of carbon in the form of a hollow sphere, ellipsoid, tube, and many other
shapes
C60 in solution
spherical fullerenes - buckyballs
cylindrical fullerenes - carbon nanotubes or buckytubes
Fullerenes
Conditions: column 53 mm x 100 μm
i.d., flow rate 0.15 μL/min, UV
detection at 254 nm; (A) mobile phase
50:50 vol % acetonitrile-water; (B)
mobile phase 50:50 vol % acetonitrilewater;
(C) mobile phase 47.5:2.5:50
vol % acetonitrile-tetrahydrofuranwater;
peaks in order of elution:
uracil, benzene, toluene,
ethylbenzene, propylbenzene,
butylbenzene, and amylbenzene
Reversed-phase chromatography
Separation of alkylbenzenes
110 000 plates/m
for the retained
benzene
S.D. Chambers et al. Anal. Chem. 2011, 83, 9478
poly(GMA-co-EDMA) poly(GMA-co-EDMA)
containing 1 wt% PCB-HEM
Carbon nanotubes
Reversed-phase chromatography
Conditions: column, 180mm × 100 mm ID, mobile phase
45% acetonitrile–5% THF–50% water, flow rate 1mL/min,
UV detection at 254 nm; peaks: uracil (1), benzene (2),
toluene (3), ethylbenzene (4), propylbenzene (5),
butylbenzene (6), and amylbenzene (7).
Separation of alkylbenzenes
poly(GMA-co-EDMA)
poly(GMA-co-EDMA)
containing 0.25 wt%
entrapped MWNT
Multi-wall nanotubes
S.D. Chambers et al. J. Chromatogr. 2011, 1218, 2546
Metal-organic frameworks (MOF)
compounds consisting of metal ions or clusters coordinated to organic molecules to
form one-, two-, or three-dimensional structures
MOFs in monolithic materials
• preparation in situ
• admixing preformed MOFs
properties
superlative porosity
wide chemical tunability
high stability
applications
gas storage
gas separation
catalysis
Metal-organic frameworks (MOF)
monolith containing carboxylic acid
functionalities
Preparation in situ
synthesis of MIL-100
inorganic metal ions - FeCl3
organic ligand - 1,3,5-benzenetricarboxylic acid (BTC)
A. Saeed et al. Adv. Funct. Mater. 2014, 24, 5790
high specific micropore surface area of 389 m2/g
(original polymer monolith – surface area of 106 m2/g)
Metal-organic frameworks (MOF)
A. Saeed et al. Adv. Funct. Mater. 2014, 24, 5790
layer-by-layer growth (30 cycles)
after enrichment
before enrichment
Phosphopeptide enrichment (IMAC) - MALDI/MS
Metal-organic frameworks (MOF)
A. Saeed et al. Adv. Funct. Mater. 2014, 24, 5790
analysis of nonfat milk
Titanium and zirconium oxide nanoparticles
Metal oxide affinity
chromatography (MOAC)
MALDI mass spectrum obtained from in vitro
phosphorylated ERK1 digest before (A) and
after enrichment with poly(DVB)-TiO2/ZrO2
microcolumns (B)
M. Rainer et al. Proteomics 2008, 8, 4593
Iron oxide nanoparticles
before attachment of NPs
after attachment of NPs
• 200 mL polypropylene pipette tips
• modification of the inner wall by methyl methacrylate/ethylene dimethacrylate
• poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)
5 mL monolithic bed prepared by UV-initiated polymerization
• UV-photografting of [3-(methacroylamino)propyl]trimethylammonium
chloride on the pore surface of the monolith
• attachment of 20 nm citrate stabilized iron oxide NPs
on the quaternary amine functionalized monolith
Fe3+ + Fe2+ + OH- Fe3O4 + H2O
g-Fe2O3
oxidation
n(Fe2+)/n(Fe3+)=1/2
pH>10
Krenkova J., Foret F. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 2175-2183
Hydroxyapatite nanoparticles
• 200 mL polypropylene pipette tips
• modification of the inner wall by methyl methacrylate/ethylene dimethacrylate
• poly(2-hydroxyethyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) with embedded
hydroxyapatite NPs (nanorods – 50 x 150 nm)
5 mL monolithic bed prepared by UV-initiated polymerization
Krenkova J., Foret F. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 2175-2183
hydroxyapatite nanoparticles
morphology: rods - 50 x 150 nm
surface area: 115 m2/g
Phosphopeptide enrichment – MALDI/MS analysis
b-casein: 224 amino acid residues
5 phosphorylation sites
after enrichment using the
hydroxyapatite NP modified tipbefore
enrichment
after enrichment using the
titanium dioxide tip
after enrichment using the
iron oxide NP modified tip
m/z m/z
m/z m/z
*-phosphopeptides
Krenkova J., Foret F. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 2175-2183
The never ending story ….
Conclusion