Mapování cílových epitopů protilátek B. Vojtěšek MOÚ Brno TA ODDBD 1 MAQNDSQEFAELWEKNLIIQ20 5A9 (KC) ∆Np53 151 PDGDNLAPAG160 8BC1 341 KFMTKNKKEN350 7BG9 251 KTEESNFKKD260 ZFp53-1.1 271 TGTKRSLVKESSSATSRPEG290 ZFp53-4.1 149 VRRCPHHERTPDGDNLAPAG160 1F9 (KC) 251 KTEESNFKKDQETKTMAKTT270 7C7 (KC) ZFp53-2.1 301 EEIFTLQVRGRERYEILKKL320 ZFp53-3.1 Ukázka mapování epitopů protilátek rozlišujících “zebra fish” p53 26.11.2009 Úvod • Proč mapovat epitopy ? • Metody • Praktické připomínky • Anekdoty a mýty 26.11.2009 Proč ? • Umožní přesněji definovat specificitu • Predikuje krosreakci s jiným antigenem • Umožní vývoj imunodetekčních metod • Umožní definovat místa posttranslačních modifikací • Může se využít pro studium proteinové struktury a funkce • Model pro studium protein-proteinových interakcí 26.11.2009 Definice • Lineární lokální epitop • Konformačně komplexní epitop Lineární epitop 26.11.2009 Vlastnosti • 3-15 aminokyselin dlouhý • Sekvence je souvislá • Často má lokální strukturu ( helix ) • Protilátky proti lineárnímu epitopu jsou vhodné pro imunobloting a imunohistochemii (barvení fixovaných tkání) • Epitop může být někdy maskován, je-li protein v nativní nedenaturované formě • Epitopy jsou často v helixové oblasti proteinu • Většina anti-peptidových protilátek má tyto vlastnosti • Tyto epitopy jsou často maskovány posttranslačními modifikacemi 26.11.2009 Metody mapování cílových epitopů • “Pepscan“ • “Phage display“ • Exprese fragmentů cílového antigenu • Částečná proteolýza • Hmotnostní spektrometrie 26.11.2009 “Pepscan“ • Překrývající se syntetické peptidové sekvence pokrývající proteinovou sekvenci • 10, 15, 20 mery • 1, 5, 10 amino kyselinový překryv ($$) • Snadný alaninový “pepscan” na přesné určení důležitých aminokyselin v cílovém epitopu • Velmi rychlá a efektivní metoda • Dnes dostupná ve formě peptidů na membránách nebo ve formě biotinylovaných peptidových knihoven Peptidová Elisa metoda pro studium vazby p53 specifických protilátek k cílovým peptidům kopírujícím sekvenci proteinu p53 Hrp konjugovaná sekundární protilátka Anti-p53 protilátka Biotinylovaný Syntetický peptid Streptavidin navázaný na dno 96 jamkové desky 26.11.2009 Příklad • Mapování anti-p53 protilátky PAb 240 2 positivní peptidy ze 77 “15 merů” s 5 AA překryvem pro celý p53 OD450 0.5 1.0 1.5 1 3 5 7 9 1113 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 5 153 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 Peptide 42 LDDRNTFRHSSVVVPY Peptide 43 TFRHSSVVVPYEPPEV 26.11.2009 Výhody • Rychlost • Knihovna je teměř na celý život (?-pokud student neudělá chybu ) • Dá se velmi účinně využít i pro hledání nových interagujícíh proteinů nebo charakterizaci míst interakce u dvou známých proteinů • Dá se dobře využít v kinázových testech popřípadě při sledování modifikací proteinů Nevýhody • Musíte nutně znát přesnou sekvenci cílového proteinu • $$$$$ ??? 26.11.2009 “Phage display“ • Náhodná peptidová knihovna • 6,7,12,15 mery, lze připravit vlastními silami nebo se dá koupit (pokusím se přemluvit kolegu Mullera aby Vám přiblížil její konstrukci) • Nutné provést mnoho kol selekce • Nutné sekvenování vybraných fágů • Dostanete bohaté informace • Dneska se dají knihovny koupit komerčně Princip • Knihovny peptidů po produkci si zachovají kódující sekvence • Je nutné provést selekci na vašem cílovém proteinu „Phage display“ • Exprese peptidů na povrchu • Obvykle se k expresi využívá gen 111 • 5 kopií Konstrukce peptidových knihoven Transfekce do bakterií a produkce fágů Knihovny mají velikost až do 109 Selekční proces Aplikuje se knihovna na cílový protein Odmyjí se všechny nenavázané fágy Provede se eluce navázaných fágů 26.11.2009 Příklad • Mapování anti-p53 protilátky PAb 240 Selekce PAb 240 vazebného peptidu z náhodné “phage display” peptidové knihovny YLDDRNTFRHSVVVPYEPP RHSVIS FRHSLL WRHSVV FKHSVV LRHSIL YRHSVI LRHSVI YSRHSVVYGDGQ TLRHSIIFGGEW AVRHSVIERTLS “p53 sequence“ “Phage library sequences“ Selekce mdm2 vazebných peptidů z náhodné “phage display” peptidové knihovny PLSQET FSDLWKLL PENNV MPR FMDYWEGL N VQN FIDYWTQQ F TGPA FTHYNATF IDRAPT FRDHWFAL V PEPLAV FADYWETL Y PA FSRFWSDL SAGAR xxxPx FxDYWxxL xxxxx “p53 sequence“ “Phage library sequences“ Shoda Konformační epitop Lehký řetězec Těžký řetězec Antigen (HEL) 26.11.2009 Vlastnosti • 5-10 aminokyselin • Nesouvislá sekvence • Protilátky proti konformačním epitopům pracují dobře za nativních podmínek • Nefungují v imunoblotingu • Lokalizace je velmi složitá s využitím “NMR”, “X-Ray”, “Hydrogen Deuterium exchange“ • Lokalizace “snadnější” s využitím exprese proteinových fragmentů nebo částečnou proteolýzou a následnou imuno-precipitací 26.11.2009 Metody mapování konformačního epitopu • Kompetiční mapování • Hybridní proteiny • Exprese fragmentu • Částečná proteolýza • Hmotnostní spektrometrie 26.11.2009 Blokování vazby jedné protilátky vazbou protilátky se známým cílovým epitopem 26.11.2009 Kompetiční metoda Ab4 Ab1 Ab3 Ab2 26.11.2009 Hybridní Proteiny Lidský Kuřecí + + - - - 26.11.2009 Příklad • PAb 1620: anti-p53, neblotuje, IP pouze s Wild-type p53 konformací. Epitop je teplotně senzitivní. “Pepscan” analýza je negativní. • Mapováno pomocí kuřecího - lidského hybridního proteinu LWVSATPPAGSRV LYPEYLEDRQTFRH 145 157 201 214 Wang et al: Oncogene 20:2318 26.11.2009 Metody mapování konformačního epitopu • Kompetiční mapování • Hybridní proteiny • Exprese fragmentů • Částečná proteolýza • Hmotnostní spektrometrie Nyní všemu rozumím Perfektní Více než já vím!!