1. cyklus 2. cyklus dsDNA ssDNA denaturace annealing extenze denaturace annealing n. cyklus dsDNA primer 21 = 2 kopie 22 = 4 kopie 2n kopií ……………….. Princip PCR PCR umožňuje detekovat jediný leukocyt infikovaný HIV mezi 105 neinfikovaných bílých krvinek. K tomu je třeba onen jediný leukocyt, obsahující sekvenci typickou pro HIV, pomocí PCR rozmnožit. Při 30 PCR cyklech se původní počet cílových sekvencí znásobí 106 až 109. Vývoj PCR metod PCR Qualitative Multiplex PCR PCR-RFLP 1st 2nd 3rd Real-time PCR Relative Quantification Droplet Digital PCR Absolute Quantification Průběh qPCR Plateau fáze Lineární fáze Exponenciální fáze Teoretický nárůst Absolutní kvantifikace KALIBRAČNÍ KŘIVKA Počet kopií (log N) 1 2 3 CT 30 20 10 y=mx+b Fluorescence CTR CTV CTK CT V případě relativní kvantifikace je nejdříve provedena normalizace a získána tak hodnota ∆CT definovaná jako ∆CT = CT V (cílový gen) – CTR (referenční gen). Následně je stanovena ∆∆CT jako: ∆∆CT = ∆CT V - ∆CT K (kontrolní vzorek). Relativní kvantifikace vzorku vzhledem ke kontrolnímu vzorku je získána umocněním 2-∆∆CT . Relativní kvantifikace Typy sond: 1. Nespecifické (např. interkalační barviva) 2. Specifické (fluorescenčně značené sondy) 3. Fluorescenčně značené primery A B Teplota Teplota 1 2 3 4 FRET 3´ donorový fluorofor Amplifikovaná cílová DNA 5´ akceptorový fluorofor Sonda 1 Sonda 2 Princip molekulárních majáků Amplikon Vlásenka Smyčka Fluorescence ZhášečReportér Kolorektální karcinom, který patří k nejrozšířenějším nádorovým onemocněním v rozvinutých zemích, může být při velmi časné diagnóze úspěšně léčitelný (v lokalizovaném stadiu až 90 %). Existují genetické abnormality, které vedou nejprve k benigní proliferaci buněk sliznice tlustého střeva tj. k tvorbě polypů, dále pak adenomů a nakonec ke vzniku adenokarcinomu, popřípadě adenokarcinomu brzy metastazujícímu. Mutační analýza onkologických onemocnění Asi 1/3 populace mívá po padesátce adenomy tlustého střeva; ale jen u 10 % vznikne karcinom. Tyto adenomy možno klasifikovat podle jejich velikosti, patologie (makroskopická struktura) a dysplazie (mikroskopická struktura) na málo a na vysoce rizikové. Histopatologická kritéria nejsou však dostatečně objektivní. Mnohem lepší je průkaz mutace genu K-ras, který patří k protoonkogenům, uplatňujícím se v kaskádě transdukce signálu a je tedy částečně odpovědný za přeměnu adenomu na adenokarcinom. Mutace genu K-ras se většinou objevují v exonu 1, a to buď na kodónu 12 (GGT) nebo 13 (GGC). Oba triplety (GGT i GGC) kódují glycin. Vznikne-li mutace na jedné z obou bazí (kupř. GGT→GCT), pak v sekvenci polypeptidu je glycin nahrazen alaninem. Ad7) Techniky založené na kvantifikaci DNA PCR s alelově-specifickými primery ARMS (Amplification Refractory Mutation System) v kombinaci se systémem „Scorpion“ Stanovení mutací pomocí bi-funkčních molekul „scorpions“ Heterozygot CT CT CT Kvantifikace fluorescence pomocí qPCR Nasedání alelově specifckých primerů a extenze Denaturace a následné intramolekulární přeskupení oligonukleotidu Templát Alelově specifické „scorpions“ miRNA: „mikromanažeři genové exprese“ Stanovení hladiny miRNA Reversní transkripce qPCR Ad 8) Princip HRMdsDNA maximální fluorescence Profil křivky tání u wt vzorku (100% párování) ssDNA (denaturovaná) minimální fluorescence Digitální PCR Make Droplets  Partition reagents and sample into 20,000 droplets PCR Droplets  Perform conventional PCR on thermal cycler Read Droplets  Quantify target nucleic acid by counting sample partitions with a positive PCR product (fluorescent) and a negative PCR product Results  Digital readout provides absolute measure of target DNA “X” target copies Siméon Denis Poisson (1781-1840) Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Low concentration High concentration NO targets Medium concentration Poisson corrected 38/143 Poisson corrected 96/143 Poisson corrected 6.2/143 Analýza exprese u onkologických onemocnění Rozdíl v expresních profilech zdravá x nádorová buňka Nejčastější markery: MGB1, CEA, CK20, EGFR1, C-MYC, TH, TS, … Detekce MRD Epidemiologie nádorů Lékařský vědní obor, součást onkologie, zabývající se problematikou výskytu jednotlivých zhoubných nádorů v různých oblastech, zemích a kontinentech. Podle procenta jejich výskytu lze usuzovat na možné příčiny jejich vzniku a v rámci prevence se snažit o snížení výskytu a včasnou depistáž určitého typu nádoru. • Velkému procentu nádorů lze preventivně předejít • Během posledních 20-ti let výrazně vyšší účinnost léčby všech karcinomů? • Prevence nádorů je jednodušší a levnější než léčba • Screeningové testy existují pro většinu nádorů Odvozeno z řeckých slov epi (nad, mezi) a démos (lid) a logos (slovo, věda, studium) volný překlad: „studium toho, co je nad lidmi“. Empirická medicína --> „medicína založená na důkazu“ - nemoc nikdy nevznikne náhodně, vždy determinanty pro výskyt onemocnění - distribuce onemocnění není náhodná, vždy souvisí s rizikovými faktory, které je třeba studovat Základní epidemiologické principy (1) • Populace, vzorek, náhodná chyba (statistická významnost „p“) •Systematická chyba (bias) – výběr vzorku nebo získáváni dat je prováděn odlišně pro skupinu cílovou a kontrolní, důsledkem chybný odhad vztahu mezi rizikovým faktorem a vznikem nemoci. Výběrový (selekční) bias X Observační (informační) bias • Zavádějící faktor (confounding) - faktor jenž je nezávisle na expozici rizikovým faktorem pro sledovanou nemoc.  vede k rozdílu tam, kde ve skutečnosti není  smazává rozdíl, který ve skutečnosti existuje • Diagnostické testy – cílem odlišit normální od abnormálního Senzitivita = proporce nemocných, kteří mají pozitivní test. Specificita = proporce zdravých, kteří mají negativní test. každý test by měl být jak vysoce senzitivní, tak i vysoce specifický Ne vždy možné (klinické údaje mají charakter kontinuálních hodnot) --> tzv. hraniční bod (cut-off point). Empiricky X ROC Hledání diagnostického cut-off pomocí ROC křivek Cíle ROC analýzy: 1. Určit, zda je spojitá proměnná vhodná pro diagnostické odlišování zdravých a nemocných jedinců. 2. Nalezení dělicího bodu („cut-off point“) na škále hodnot spojité proměnné, který nejlépe odlišuje zdravé a nemocné jedince. Analýza přežití Optimální experiment osoby bez nemoci rozdělit na skupiny a jednu skupinu exponovat rizikovému faktoru a ostatní ne. Rozdíly frekvence nemoci v těchto skupinách by se pak mohly přisuzovat vlivu rizikového faktoru (v řadě situací při řešení závažných klinických otázek však není možno experiment provádět z etických i jiných důvodů). Typy studií 1. Průřezová studie Vybereme náhodně N jedinců z celé populace a ptáme se na nemoc a expozici. - Jsme schopni odhadovat jak riziko onemocnění, tak i pravděpodobnost expozice v populaci. - Pokud je riziko onemocnění a pravděpodobnost expozice malá má získaná kontingenční tabulka malé počty - Observační bias 2. Kohortová studie Výběr sestrojíme zvlášť pro skupinu exponovaných a neexponovaných (rozsahy plánujeme odděleně). Ve skupinách budeme zjišťovat nemocnost. - Získáme tabulku s většími počty v jednotlivých políčkách - Odhadneme riziko v jednotlivých skupinách ale ne v celé populaci - Je možno porovnat rizika obou skupin 3. Studie případů a kontrol (Case control study) Výběr sestrojíme zvlášť pro skupinu zdravých a nemocných (rozsahy plánujeme odděleně). V obou skupinách zjistíme zda osoby byly exponovány či ne. - Získáme opět tabulku s většími počty v jednotlivých políčkách - Nejsme schopni odhadnout žádné riziko, ale můžeme hodnotit případnou souvislost mezi nemocí a expozicí Exp. Nemoc + + a b - c d a+c b+d Statistická asociace Bias ANO NE 5 kriterií kauzality ANO Asociace je kauzální NE Zkoumaný faktor se nepodílí na etiologii ANO Asociace falešně pozitivní NE Asociace není kauzální 1. Následnost Příčina musí předcházet následku, tedy expozice nemoci. Časové hledisko se z obecného pohledu posuzuje jednodušeji u kohortových studií než u studií případů a kontrol či průřezových, které zkoumají expozici i následek ve stejné době. Mnohdy se ještě uvažuje časové prodlení (jako interval mezi expozicí a nemocí) Například u většiny typů rakoviny se předpokládá, že nemohou vzniknout dříve než za 10 let od začátku expozice. Někdy je problémem, že nemoc může zřejmě zpětně ovlivnit expozici, např. osoby s počínajícím srdečním onemocněním mají tendenci méně se pohybovat. 2. Koherence Pokud je faktor příčinou nemoci, měly by další epidemiologické argumenty být v souladu s tímto očekáváním a nemělo by být zřejmé žádné alternativní vysvětlení (nerozpornost dat na jednotlivých úrovních). Kriteria kauzality 3. Síla asociace Pokud se po maximálně zodpovědném vyloučení všech zdrojů zkreslení a zavádějících faktorů a po zohlednění rozsahu výběru jeví asociace (posuzovaná především podle velikosti relativního rizika (RR) či poměru šancí (OR)) 4. Konzistence Pokud (velmi) odlišně navržené studie na různých subjektech dojdou k podobným závěrům, je větší šance, že asociace je kauzální. 5. Vztah dávky a účinku pokud jsou vyšší hladiny expozice asociovány s vyšší incidencí nemoci (neboli pokud je vztah dávky a účinku monotónní), svědčí to často ve prospěch kauzality. POZOR na zavádějící faktory! http://www.svod.cz/ Molekulární patologie & Koncept personalizované terapie Molekulární diagnostika nebo mikroskop? Hlavní výzva molekulární patologie: integrace „starého a nového“ Molekulární patologie Vymezení pojmu v onkologii: Disciplína patologie, která využívá nástroje molekulární biologie jako doplněk ke konvenčním morfologickým, imunohistochemickým a chemickým analýzám abnormalit tkání a buněk s cílem lépe porozumět etiologii a patogenezi tumorů, upřesnit jejich diagnostiku, přispět ke stanovení prognózy onemocnění a navrhnout nejvhodnější formu léčby. Biopatologie: Disciplína patologie, zaměřená na identifikaci biomarkerů ve tkáních. Molekulární medicína: Studium dysfunkcí molekulárních systémů za určitého chorobného procesu, molekulárních systémů, jejichž funkce za normálního stavu je definována (nebo by definována měla být v optimálním případě). Molekulární patologie - hlavní výzvy 1. Klinicky využitelné biomarkery (identifikace a validace) 2. Laboratorní techniky (OMIC přístupy) 3. Ko-alterace a dysregulace signálních drah (komplexita onemocnění) 4. „Decision making“ (na základě identifikovaných biomarkerů) 5. Pre-analytické výzvy (získávání, zpracování vzorků) 6. Biomarkery v klinických studiích (randomizace, vhodné respondery) 7. Využití biomarkerů ve standardizované terapii (FDA) 8. Možnosti do budoucna (nové, účínnější a ekonomicky dostupné technologie ) Personalizovaná medicína Nádorové biomarkery: • Diagnostika (patol. stavy, detekce, rizikové f.) • Identifikace (podtypy) • Predikce (citlivost) • Prognóza (progrese, rekurence) Biomarker: jakákoli změna která se objeví mezi expozicí a rozvinutím onemocnění Prognóza versus predikce Prognostický marker: léčba na základě individuálních předpokladů (TNM) Prediktivní marker: selekce terapie dle daného typu nádoru (ER+ ca mammy, metylace MGMT či BRCA1) Velmi často kombinace obou: např. ER je i progn. Faktor (ER+ pomaleji rostou) Některé neg. progn. faktory (erbB-2) mohou predikovat lepší odpověď na vhodnou terapii (rezistence k hormonální terapii a alkylačním agens X citlivost k antracyklinům, Herceptinu) Karcinom mléčné žlázy Karcinom mléčné žlázy - terapie Terapie - neoadjuvantní x adjuvantní Vzhledem k léčbě: přítomnost steroidních receptorů, Her2 + další klinickopatologické parametry Hormonální terapie → tamoxifen / aromatázové inhibitory / antiestrogeny Chemoterapie → obv. kombinace cytostatik (CMF, FEC, AC, popř + taxol, …) RT, obv. omezená radiosenzitivita, Biologická terapie → inhibice membránových receptorů (trastuzumab) Rutinně používané klinickopatologické parametry Prognóza onemocnění & predikce odpovědi na léčbu ER a PgR pozitivní – hormonální léčba ER a PgR negativní – chemo/radio-terapie Her2/neu negativní – dle stavu ER/PgR (tzv. basal like ca) Her2/neu pozitivní – trastuzumab, antracykliny Využití mikroskopie k predikci prognózy nádorového onemocnění Molekulární subtypy MammaPrint: stanovení prognózy na základě expresního profilu 70 genů Grade x MammaPrint ? Cílená terapie: efektivita vs. cena význam individualizovaného přístupu Efektivita konvenční protinádorové terapie? Mortalita ca mléčné žlázy 1/4 BENEFIT 1/30 ROSTE VÝZNAM BIOMARKERŮ